通过发酵生产4-氨基苯乙胺的工程化生物合成途径的制作方法

概括地说，本公开涉及通过发酵生产4-氨基苯乙胺的工程化微生物领域。

背景技术：

1、4-氨基苯乙胺(4-apea)是芳族胺(aa)。aa用于生产先进的聚合物材料，包括功能性和/或高性能塑料。aa的胺基和芳族部分分别提供亲核反应性和优异的热机械性能。aa通常与羰基化合物缩聚以产生芳族聚酰胺、聚酰亚胺、聚唑、聚脲和聚甲亚胺。aa与芳族酸的缩聚产生具有极高热机械性能的超工程塑料。这些包括聚(对苯二甲酰对苯二胺(kevlartm)和聚(4,4'-氧二亚苯基均苯四甲酰亚胺)(kaptontm)，它们用作防弹衣和其他阻燃材料的织物中的热稳定材料，用于电子设备、车身和抗压气缸的纤维增强塑料。

2、已经在大肠杆菌(escherichia coli)中证明了4-apea的发酵生产(masuo等人,(2016)scientific reports,6:25764)，但是大肠杆菌(e.coli)对高滴度4-apea的耐受性差使其不适合大规模发酵宿主。

技术实现思路

1、本公开提供了工程化的微生物细胞、微生物细胞的培养物以及生产4-氨基苯乙胺(4-apea)的方法，包括以下：

2、本文所关注的各种实施方案可以包括但不必限于以下的一个或多个：

3、实施方案1：产生4-氨基苯乙胺(4-apea)的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞对与产生4-apea相关的毒性具有高耐受性，该耐受性由工程化微生物细胞的生长减慢至少30克/升的一半(ki)的浓度来定义。

4、实施方案2：实施方案1的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包括真菌细胞。

5、实施方案3：实施方案2的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包括酵母细胞。

6、实施方案4：实施方案3的工程化微生物细胞，其中酵母细胞是komagataella属的细胞。

7、实施方案5：实施方案4的工程化微生物细胞，其中酵母细胞是pastoris或phaffi种的细胞。

8、实施方案6：实施方案1-5中任一项的工程化微生物细胞，其中随着4-apea浓度的增加，观察到的毒性效应的斜率小于6。

9、实施方案7：实施方案1-6中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞异源表达以下酶活性中的每一种：4-氨基-4-脱氧分支酸合酶、4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶、4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶、氨基转移酶(at)和脱羧酶(dc)，其中这些酶活性由编码这些酶的异源表达基因提供，并且至少一种异源表达的酶对于该工程化微生物细胞是非天然的。

10、实施方案8：实施方案7的工程化微生物细胞，其中至少两种、三种、四种或所有异源表达的酶对于工程化微生物细胞是非天然的。

11、实施方案9：产生4-氨基苯丙酮酸(4-app)的komagataella属的工程化微生物细胞。

12、实施方案10：实施方案9的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞是pastoris或phaffi种的细胞。

13、实施方案11：实施方案9或实施方案10的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞异源表达以下酶活性中的每一种：4-氨基-4-脱氧分支酸合酶、4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶和4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶，其中每种酶活性由编码这些酶的异源表达基因提供，并且至少一种异源表达的酶对于工程化微生物细胞是非天然的。

14、实施方案12：实施方案9-11中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还产生4-氨基苯丙氨酸(4-aphe)。

15、实施方案13：实施方案12的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还异源表达氨基转移酶(at)活性。

16、实施方案14：实施方案9-11中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还产生4-氨基苯乙醇。

17、实施方案15：实施方案14的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还异源表达醇脱氢酶/乙醛还原酶。

18、实施方案16：实施方案9-15中任一项的工程化微生物细胞，其中至少两种、三种或所有异源表达的酶对于工程化微生物细胞是非天然的。

19、实施方案17：实施方案7-16中任一项的工程化微生物细胞，其中至少一种异源表达的酶由组成型启动子表达。

20、实施方案18：实施方案7-16中任一项的工程化微生物细胞，其中异源表达的酶中的至少一种由受调控的启动子表达，任选地其中该受调控的启动子是硫胺素阻遏型启动子。

21、实施方案19：实施方案1-18中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包含增加的活性的一种或多种上游分支酸途径酶，所述增加的活性为相对于对照细胞是增加的。

22、实施方案20：实施方案19的工程化微生物细胞，其中所述增加的活性选自葡糖激酶、转酮醇酶、转醛醇酶、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶、3-脱氧-d-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶、分支酸合酶活性及其任意组合。

23、实施方案21：实施方案20的工程化微生物细胞，其中所述增加的活性包括增加的3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶和3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶活性，其通过异源表达五功能酶来提供。

24、实施方案22：实施方案1-21中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包含增加的活性的一种或多种氮同化和利用途径酶。

25、实施方案23：实施方案22的工程化微生物细胞，其中所述增加的活性选自异柠檬酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、谷氨酸脱氢酶、铵通透酶及其任意组合。

26、实施方案24：实施方案1-23中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包含降低的活性的消耗一种或多种分支酸途径前体、分支酸、和/或一种或多种由分支酸至4-apea的途径中的中间体的一种或多种酶，和/或消耗4-apea的多种酶，所述降低的活性为相对于对照细胞是降低的。

27、实施方案25：实施方案24的工程化微生物细胞，其中消耗一种或多种分支酸途径前体的一种或多种酶选自二羟丙酮磷酸酶、3-脱氢莽草酸脱水酶、莽草酸脱氢酶和磷酸烯醇丙酮酸磷酸转移酶。

28、实施方案26：实施方案24的工程化微生物细胞，其中消耗分支酸的一种或多种酶选自邻氨基苯甲酸合酶和分支酸变位酶。

29、实施方案27：实施方案24的工程化微生物细胞，其中消耗一种或多种由分支酸至4-apea的途径中的中间体的一种或多种酶选自脱羧酶、芳香族氨基酸脱羧酶、苯丙酮酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、芳香族氨基酸脱氨酶和醇脱氢酶/乙醛还原酶。

30、实施方案28：实施方案24的工程化微生物细胞，其中消耗4-apea的一种或多种酶选自苯丙酮酸双加氧酶、二胺氧化酶、胺氧化酶和氨基酸氧化酶。

31、实施方案29：实施方案24-28中任一项的工程化微生物细胞，其中通过用活性较低的启动子替换所述一种或多种酶的基因的天然启动子或通过缺失或敲除该基因来实现降低的活性。

32、实施方案30：实施方案1-29中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞还表达反馈去调节的dahp合酶。

33、实施方案31：实施方案1-30中任一项的工程化微生物细胞，其中该工程化微生物细胞包含增加的活性的一种或多种酶，所述酶增加还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)供应，所述增加的活性为相对于对照细胞是增加的。

34、实施方案32：实施方案31的工程化微生物细胞，其中增加还原形式的nadph供应的一种或多种酶选自戊糖磷酸途径酶、nadp+依赖性甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)和nadp+依赖性谷氨酸脱氢酶。

35、实施方案33：实施方案1的工程化微生物细胞，其中非天然酶包括：与来自荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens，菌株sbw25)的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶、与来自photorhabdus laumondii亚种laumondii(菌株dsm 15139/cip 105565/tt01)的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶、与来自荧光假单胞菌(菌株sbw25)的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶；任选地，与来自大肠杆菌(菌株k12)的氨基转移酶(at)具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基转移酶(at)；以及任选地与来自罂粟(papaver somniferum)的脱羧酶(dc)具有至少70％氨基酸序列同一性的脱羧酶(dc)。

36、实施方案34：实施方案33的工程化微生物细胞，其中，来自荧光假单胞菌(菌株sbw25)的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶包含seq id no:4，来自photorhabdus laumondii亚种laumondii(菌株dsm 15139/cip 105565/tt01)的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶包含seq idno:6，来自荧光假单胞菌(菌株sbw25)的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶包含seq id no:8；来自大肠杆菌(菌株k12)的氨基转移酶(at)，如果存在的话，包含seq id no:(seq id no:13)；并且来自罂粟的脱羧酶(dc)，如果存在的话，包含seq id no:9。

37、实施方案35：实施方案1的工程化微生物细胞，其中，非天然酶包括：与来自链霉菌属种(streptomyces sp.)cb01635的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶，与来自始旋链霉菌(streptomycespristinaespiralis)的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶，与来自假单胞菌属种(pseudomonas sp.)2822的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶；任选地，与来自矮牵牛(petunia hybrida)的氨基转移酶(at)具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基转移酶(at)；以及任选地，与来自罂粟的脱羧酶(dc)具有至少70％氨基酸序列同一性的脱羧酶(dc)。

38、实施方案36：实施方案35的工程化微生物细胞，其中，来自链霉菌属种cb01635的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶包含seq id no:3，来自始旋链霉菌的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶包含seq id no:5，来自假单胞菌属种2822的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶包含seq idno:7；来自矮牵牛的氨基转移酶(at)，如果存在的话，包含seq id no:14；并且来自罂粟的脱羧酶(dc)，如果存在的话，包含seq id no:9。

39、实施方案37：实施方案1的工程化微生物细胞，其中，非天然酶包括：与来自链霉菌属种cb01635的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶，与来自photorhabdus asymbiotica亚种asymbiotica的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶，与来自xenorhabdus doucetiae的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶具有至少70％氨基酸序列同一性的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶；任选地，与来自谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)的氨基转移酶(at)具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基转移酶(at)；以及任选地，与来自罂粟的脱羧酶(dc)具有至少70％氨基酸序列同一性的脱羧酶(dc)。

40、实施方案38：实施方案35的工程化微生物细胞，其中，来自链霉菌属种cb01635的4-氨基-4-脱氧分支酸合酶包含seq id no:3，来自photorhabdus asymbiotica亚种asymbiotica的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶包含seq id no:25，来自xenorhabdusdoucetiae的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶包含seq id no:29；来自谷氨酸棒状杆菌的氨基转移酶(at)，如果存在的话，包含seq id no:16；并且来自罂粟的脱羧酶(dc)，如果存在的话，包含seq id no:9。

41、实施方案39：实施方案7-38中任一项的工程化微生物细胞，其中，该工程化微生物细胞还包含选自以下的基因型改变：p9_peno1_kpa:gln1 、 p35_pkex2_kpa:nufm 、p9_peno1_kpa:nufm 、 p115_pthi11_kpa:pdc2 和p5_ptdh3_kpa:pdc2。

42、实施方案40：实施方案1-8和19-39中任一项的工程化微生物细胞，其中，当培养时，该工程化微生物细胞以至少11克/升培养基的水平产生4-apea。

43、实施方案41：实施方案9-16中任一项的工程化微生物细胞，其中，当培养时，该工程化微生物细胞以至少20毫克/升培养基的水平产生4-app；任选地，其中，当培养时，该工程化微生物细胞以至少5毫克/升培养基的水平产生4-aphe。

44、实施方案42：实施方案1-41中任一项的工程化微生物细胞的培养物。

45、实施方案43：实施方案42的培养物，其中该培养物包含4-app、4-a-phe和/或4-apea。

46、实施方案44：培养实施方案1-41中任一项的工程化微生物细胞的方法，该方法包括在适于产生4-app、4-aphe和/或4-apea的条件下培养细胞。

47、实施方案45：实施方案44的方法，其中该方法包括补料分批培养，初始葡萄糖水平在1-100g/l的范围内，然后进行受控的糖补料。

48、实施方案46：实施方案44或实施方案45中任一项的方法，其中，在培养期间对培养物进行ph控制。

49、实施方案47：实施方案44-46中任一项的方法，其中，在培养期间控制硫胺素的浓度。

50、实施方案48：实施方案44-47中任一项的方法，其中，在培养期间给培养物充气。

51、实施方案49：实施方案42或实施方案43的培养物或实施方案44-48中任一项的方法，其中该培养物包含：至少20毫克/升培养基水平的4-app；至少5毫克/升培养基水平的4-aphe；和/或至少15毫克/升培养基水平的4-apea。

52、实施方案50：实施方案40的工程化微生物细胞或实施方案49的培养物或方法，其中，当培养时，该工程化微生物细胞或该培养物包含至少6克/升培养基水平的4-apea。

53、实施方案51：实施方案40的工程化微生物细胞或实施方案49的培养物或方法，其中，当培养时，该工程化微生物细胞或该培养物包含至少11克/升培养基水平的4-apea。

54、实施方案52：实施方案44-51中任一项的方法，其中，该方法还包括从培养物中回收4-app、4-aphe和/或4-apea。

55、本公开还提供以上实施方案的这样的版本：其中，这些实施方案由所列举的要素或举措组成或基本上由这些要素或举措组成。在基本上由所列举的要素/举措组成的实施方案的情况下，实施方案的“基本和新颖特征”是工程化微生物细胞、培养物或方法的生产特征(例如，特定产物的产率，任选地以培养基中的滴度来表示)。

56、上述实施方案的这样的版本也在本公开的范围内：其中，使用用于提供组合物权利要求所列举元素的任何手段以及用于进行方法权利要求所列举的举措的任何手段来执行实施方案。