新型抗CD47抗体及其用途的制作方法

本技术涉及抗cd47抗体，制备这类抗体的方法以及这类抗体在治疗与cd47相关的疾病和病症中的用途。

背景技术：

1、cd47(分化簇47)在20世纪80年代首次鉴定为人卵巢癌的肿瘤抗原。从那时起，已发现cd47在多种人肿瘤类型上表达，包括急性髓系白血病(aml)、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、膀胱癌和其他实体瘤。高水平的cd47允许癌细胞避免吞噬作用，尽管有更高水平的钙网蛋白–主要的促吞噬信号。

2、cd47也称作整联蛋白相关蛋白(iap)、卵巢癌抗原oa3、rh相关抗原和mer6，是一种属于免疫球蛋白超家族的多跨膜受体。它的表达和活性与许多疾病和病症有关。它是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，具有单一的ig样结构域和五个跨膜区域，作为sirpα的细胞配体，通过信号调节蛋白α(sirpα)的nh2-末端v样结构域介导结合。sirpα主要在髓系细胞上表达，包括巨噬细胞、粒细胞、髓系树突细胞(dc)、肥大细胞及其前体，包括造血干细胞。

3、巨噬细胞通过吞噬作用从血流清除病原体以及受损或衰老的细胞。细胞表面cd47与其在巨噬细胞上的受体sirpα相互作用，抑制正常、健康细胞的吞噬作用。sirpα抑制巨噬细胞对宿主细胞的吞噬作用，其中通过宿主靶细胞上表达的cd47连接巨噬细胞上的sirpα会产生由shp-1介导的抑制信号，负向调节吞噬作用。

4、与cd47抑制正常细胞吞噬的作用一致，有证据表明在造血干细胞(hsc)和祖细胞迁移前和迁移过程中，cd47会短暂上调，并且这些细胞上cd47的水平决定了它们在体内被吞噬的概率。

5、cd47还在许多癌症中组成性上调，包括髓系白血病。髓系白血病系上cd47的过量表达通过使其逃避吞噬作用而增加其致病性。已经得出结论，cd47上调是在炎症介导的动员过程中为正常hsc提供保护的重要机制，而白血病祖细胞共同采用这种能力以逃避巨噬细胞的杀伤。

6、已经证明某些cd47抗体恢复吞噬作用和预防动脉粥样硬化。参见，例如，kojimaet al.,nature,vol.36,86-90(aug.4,2016)。本发明提供新型cd47抗体或其免疫学活性片段，其在人中具有低免疫原性，并且引起低水平或无水平的红细胞耗竭。正如本领域技术人员公知的，这类抗体可以互换地称为“抗cd47抗体”。

技术实现思路

1、本文提供一种特异性地结合人cd47(hcd47)的抗体或其免疫学活性片段，其包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含(1)在其n-末端的谷氨酸残基(e)；(2)包含rawmn(seq idno:5)的cdr-h1；(3)包含rikrktdgettdyaapvkg(seq id no:6)的cdr-h2；(4)包含snrafdi(seq id no:7)的cdr-h3；和(5)在其c-末端的丝氨酸(s)；以及(b)轻链可变(vl)结构域，其包含(1)包含kssqsvlyagnnrnyla(seq id no:8)的cdr-l1；(2)包含qastras(seq id no:9)的cdr-l2；和(3)包含qqyytppla(seq id no:10)的cdr-l3。

2、在一些实施方案中，vh结构域的n-末端氨基酸根据kabat编号系统对应于位置h1，vh结构域的c-末端氨基酸根据kabat编号系统对应于位置h113。在一些实施方案中，vh结构域的n-末端氨基酸根据chothia编号系统对应于位置h1，vh结构域的c-末端氨基酸根据chothia编号系统对应于位置h113。在一些实施方案中，vh结构域的n-末端氨基酸根据imgt编号系统对应于位置h1，vh结构域的c-末端氨基酸根据imgt编号系统对应于位置h128。在一些实施方案中，vh结构域的n-末端氨基酸对应于seq id no:1的氨基酸1，vh结构域的c-末端氨基酸对应于seq id no:1的氨基酸118。在一些实施方案中，vh包含与seq id no:1具有至少95％相同性的氨基酸序列，vl包含与seq id no:2具有至少95％相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，vh包含seq id no:1，vl包含seq id no:2。

3、在一些实施方案中，抗cd47抗体或其免疫学活性片段包含fc结构域。在一些实施方案中，fc结构域是人igg fc结构域。在一些实施方案中，人igg fc结构域是igg1、igg2、igg3或igg4 fc结构域。在一些实施方案中，抗cd47抗体是全长抗体。在一些实施方案中，全长抗cd47抗体包含重链和轻链，所述重链包含seq id no:3或seq id no:55，所述轻链包含seq id no:4。在一些实施方案中，抗cd47抗体的免疫学活性片段是fab、fab’、f(ab)’2、fab’-sh、单链fv(scfv)、fv片段或线性抗体。在一些实施方案中，抗cd47抗体或其免疫学活性片段是单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，抗cd47抗体或其免疫学活性片段是嵌合的或人源化的。

4、在一些实施方案中，抗cd47抗体或其免疫学活性片段与癌细胞表面上表达的hcd47结合。在一些实施方案中，癌细胞是sk-ov-3细胞、toledo细胞、k562细胞、hcc827细胞、jurkat细胞、u937细胞、tf-1细胞、raji细胞、su-dhl-4细胞、mda-mb-231细胞、a375细胞或sk-mes-1细胞。在一些实施方案中，癌细胞是实体瘤癌症。在一些实施方案中，实体瘤癌症是肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌。在一些实施方案中，癌细胞是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是非霍奇金淋巴瘤。

5、在一些实施方案中，抗cd47抗体或其免疫学活性片段不与血细胞表面上表达的hcd47结合。在一些实施方案中，血细胞是红细胞。在一些实施方案中，抗cd47抗体或其免疫学活性片段与hcd47的结合防止hcd47与信号调节蛋白α(sirpα)的相互作用。在一些实施方案中，sirpα是人sirpα(hsirpα)。在一些实施方案中，抗cd47抗体或其免疫学活性片段与癌细胞表面上表达的hcd47的结合促进巨噬细胞介导的对癌细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，癌细胞是sk-ov-3细胞、toledo细胞、k562细胞、hcc827细胞、jurkat细胞、u937细胞、tf-1细胞、raji细胞、su-dhl-4细胞、mda-mb-231细胞、a375细胞或sk-mes-1细胞。在一些实施方案中，癌细胞是实体瘤癌症。在一些实施方案中，实体瘤癌症是肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肉瘤癌、头颈癌、胃癌、肾癌或皮肤癌。在一些实施方案中，癌细胞是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，向受试者给药抗cd47抗体或其免疫学活性片段不会引起受试者中显著水平的血凝或受试者的红细胞耗竭。

6、本文提供编码本文所述的抗cd47抗体或其免疫学活性片段的核酸。本文还提供包含这类核酸的载体。此外，本文提供包含本文所述的核酸和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一些实施方案中，cho细胞是cho-k1细胞。在一个相关方面，本文提供制备抗cd47抗体或其免疫学活性片段的方法，其包括：a)在有效引起抗cd47抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞；以及b)回收宿主细胞表达的抗cd47抗体或其免疫学活性片段。

7、本文提供包含抗cd47抗体或其免疫学活性片段以及药学上可接受的载剂的药物组合物。

8、本文提供治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者给药有效量的抗cd47抗体，其中所述抗cd47抗体包含(a)重链可变结构域(vh)，其包含(1)包含rawmn(seq id no:5)的cdr-h1；(2)包含rikrktdgettdyaapvkg(seq id no:6)的cdr-h2；和(3)包含snrafdi(seq id no:7)的cdr-h3；(b)轻链可变(vl)结构域，其包含(1)包含kssqsvlyagnnrnyla(seq id no:8)的cdr-l1；(2)包含qastras(seq id no:9)的cdr-l2；和(3)包含qqyytppla(seq id no:10)的cdr-l3。

9、在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤是肺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肉瘤肿瘤、头颈肿瘤、胃肿瘤、肾肿瘤或皮肤肿瘤。在一些实施方案中，实体瘤是复发和/或难治性实体瘤。

10、在一些实施方案中，癌症是非霍奇金淋巴瘤(nhl)，并且所述方法进一步包括向受试者给药有效量的利妥昔单抗。在一些实施方案中，nhl是滤泡性淋巴瘤(fl)、弥漫性大b-细胞淋巴瘤(dlbcl)或套细胞淋巴瘤(mcl)。在一些实施方案中，nhl是复发/难治性nhl。在一些实施方案中，受试者接受过至少一次nhl的先前治疗。在一些实施方案中，受试者接受过2-10次nhl的先前治疗。在一些实施方案中，受试者接受过靶向cd20的药剂的nhl先前治疗。在一些实施方案中，受试者在靶向cd20的药剂的先前治疗期间或之后出现进展。

11、在本文提供的任何治疗方法的一些实施方案中，抗cd47抗体包含人igg4恒定区或其变体，所述变体包含s233p突变(其中编号根据eu索引)。在一些实施方案中，将抗cd47抗体以10mg/kg的剂量向受试者给药。在一些实施方案中，将抗cd47抗体以20mg/kg的剂量向受试者给药。在一些实施方案中，将抗cd47抗体以30mg/kg的剂量向受试者给药。在一些实施方案中，将抗cd47抗体每周一次(qw)向受试者给药。在一些实施方案中，其中将抗cd47抗体通过静脉内(iv)输注向受试者给药。在治疗nhl的方法的一些实施方案中，利妥昔单抗在前五周每周一次(qw)以375mg/m2的剂量给药，在前五周之后每4周一次(q4w)以375mg/m2的剂量给药。

12、在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，受试者不因为用抗cd47抗体治疗而出现明显的血液学毒性。在一些实施方案中，受试者不因为用抗cd47抗体治疗而出现任何血液学毒性。在一些实施方案中，血液学毒性包括贫血、血细胞减少和/或血凝。在一些实施方案中，抗cd47抗体的vh包含seq id no:1，并且抗cd47抗体的vl包含seq id no:2。在一些实施方案中，抗cd47抗体的重链包含seq id no:3或seq id no:55，并且抗cd47抗体的轻链包含seq id no:4。

13、本文还提供治疗癌症的试剂盒，其包含本文所述的抗cd47抗体或药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒根据本文提供的治疗方法使用。

14、应当理解，本文描述的各种实施方案的一个、一些或全部特征可以结合以形成本发明的其他实施方案。对于本领域的技术人员来说，本发明的这些和其他方面会变得明显。本发明的这些和其他实施方案通过下面的详细描述进一步描述。