1种以上的HLA基因用引物的制作方法

本发明涉及1种以上的hla基因用引物等。

背景技术：

1、人白细胞抗原(human leukocyte antigen；hla)是对免疫应答性进行控制的重要分子，与各种疾病易感性相关。hla大致分为i类分子和ii类分子。hlai类分子除了具有向t细胞提呈抗原肽的功能外，还作为自然杀伤细胞、t细胞、髓样细胞上的免疫受体的配体发挥作用。

2、hlai类分子存在经典(ia类)分子和非经典(ib类)分子这两个组。hla ia类分子hla-a、hla-b、hla-c在几乎所有的人细胞中都有表达。另一方面，对于hla ib类分子hla-e、hla-f、hla-g，表达的组织的分布往往是有限的，功能也不限于抗原肽的提呈，涉及多方面。例如，hla-g分子主要在胎盘中表达，与hla ia类分子一样，提呈抗原肽，接受提呈的受体是自然杀伤细胞的受体，调节自然杀伤细胞的功能。自然杀伤细胞在癌症免疫疗法中至关重要。

3、hlai类基因簇彼此之间序列同源性高，纵列在6号染色体短臂上。hla ia类基因具有非常高的多态性，而hla ib类基因的多态性比较缺乏。另一方面，由于hla基因区域整体高度富于多态性，因此与一般的基因组区域相比，基因间区域也富于多态性。因此，仅通过人基因组参考序列(基因组组装版本hg38)，难以设计能够包罗地扩增hla等位基因的基因全长的pcr引物。

4、hla等位基因由基因全长的多态性组合限定。桑格(sanger)型测序器和下一代测序器由于可确定的序列长度较短，所以不能一次对基因全长进行测序。特别是hlaib类基因多态性比较缺乏，因此在确定的序列内存在多态位点的概率低，所以无法对来自母亲和来自父亲的hla等位基因进行定相(衰落)(非专利文献1)。此外，hla ib类基因由于没有确立的hla等位基因分型方法，试剂盒没有市售，因此关于分型结果的报告事例很少。因此，登记在imgt/hla数据库中hla ib类基因hla等位基因信息是有限的。

5、nilsson等人报道了能够扩增也包含非翻译区域在内的hla-g基因全长的1种引物组(primer set)(非专利文献2)。

6、alizadeh等人报道了以hla-f基因为靶标的长距离pcr(long range pcr)引物组，将引物设计在非翻译区域(非专利文献3)。

7、wang等人报道了以hla-e基因为靶标的长距离pcr引物组，但不能扩增包含非翻译区域的hla-e基因全长(非专利文献4)。lucas等人报道了使用了长距离pcr的hla-e基因全长的测序结果，在非翻译区域设计引物，但不能扩增包含影响基因表达的非翻译区域的区域(非专利文献5)。

8、现有技术文献

9、非专利文献

10、非专利文献1：suzuki s et al.，front.immunol.2018oct 4；9：2294.

11、非专利文献2：nilsson ll et al.，hla.2018；92：144-153.

12、非专利文献3：alizadeh m et al.，hum immunol.2020；81(5)：202-205.

13、非专利文献4：wang s-x et al.，hla.2017；89：327-330.

14、非专利文献5：lucas jam et al.，hla.2020；95：561-572.

技术实现思路

1、发明所解决的技术问题

2、对于hla-e基因和hla-f基因，没有报道能够扩增包含非翻译区域的基因全长的引物。

3、对于现有技术中公开的hla-g基因引物，如实施例所示，通过使用全基因组测序数据的分析进行了研究，结果确认了根据样品的不同，在引物结合位点存在错配，这表明未观察到pcr扩增或者很可能影响均匀的扩增。

4、此外，在现有技术中，通过使用以hla ib类基因的翻译区域为中心而设计的一对引物的pcr，分析了hla ib类基因的序列，但在这样的方法中，无法分析对基因表达重要的非翻译区域的区域中的多态性。

5、因此，本发明的目的在于：提供1种以上的能够高度包罗hla-e、hla-f或hla-g基因的hla等位基因而进行检测或扩增的引物。本发明的目的还在于：提供1种以上的引物，所述引物能够高度包罗所述基因的hla等位基因而进行检测或扩增，并且能够扩增包含所述基因的非翻译区域的基因全长。

6、解决问题的技术手段

7、本发明人等进行了深入研究，结果发现了1种以上的hla基因用引物，该引物能够高度包罗hla-e、hla-f或hla-g基因的hla等位基因而进行检测或扩增，并且还能够扩增包含所述基因的非翻译区域的基因全长。实际上，与现有技术不同，由本发明人发现的1种以上的hla基因用引物实质上被证实能够高度包罗包含推定为新hla等位基因的多个hla等位基因组而进行扩增(表6)。基于这些发现，本发明人成功地提供了1种以上的hla基因用引物，从而完成了本发明。

8、即，本发明如下。

9、[1]一种引物，其是选自下述(1)～(3)中的1种以上的hla基因用引物：

10、(1)1种以上的hla-g基因用引物，其为(1a)包含seq id no.1的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物和/或(1b)包含seq id no.3的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物；

11、(2)1种以上的hla-e基因用引物，其为(2a)包含seq id no.5的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物和/或(2b)包含seq id no.7的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物；

12、(3)1种以上的hla-f基因用引物，其为(3a)包含seq id no.9的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物和/或(3b)包含seq id no.11的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物。

13、[2]根据[1]的1种以上的hla基因用引物，其中，所述1种以上的hla基因用引物为选自下述(1’)～(3’)中的hla基因扩增用引物组：

14、(1’)hla-g基因扩增用引物组，其包含：(1a)包含seq id no.1的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物和(1b)包含seq id no.3的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物；

15、(2’)hla-e基因扩增用引物组，其包含：(2a)包含seq id no.5的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物和(2b)包含seq id no.7的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物；

16、(3’)hla-f基因扩增用引物组，其包含：(3a)包含seq id no.9的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物和(3b)包含seq id no.11的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物。

17、[3]根据[1]或[2]的1种以上的hla基因用引物，其中，

18、(1a)包含seq id no.1的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物为(1a’)包含seqid no.2的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物，

19、(1b)包含seq id no.3的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物为(1b’)包含seqid no.4的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物，

20、(2a)包含seq id no.5的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物为(2a’)包含seqid no.6的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物，

21、(2b)包含seq id no.7的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物为(2b’)包含seqid no.8的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物，

22、(3a)包含seq id no.9的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物为(3a’)包含seqid no.10的碱基序列或其互补碱基序列的第1引物，

23、(3b)包含seq id no.11的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物为(3b’)包含seqid no.12的碱基序列或其互补碱基序列的第2引物。

24、[4]一种hla基因的检测方法，其包含：

25、使用[1]～[3]中任一项的1种以上的hla基因用引物，在从人受试体得到的样品中检测1种以上的hla基因，

26、所述检测方法中，1种以上的hla基因选自hla-g基因、hla-e基因和hla-f基因。

27、[5]根据[4]的方法，其中，1种以上的hla基因的检测通过1种以上的hla基因的扩增进行。

28、[6]一种hla基因的检测试剂，其包含[1]～[3]中任一项的1种以上的hla基因用引物。

29、[7]一种hla基因的检测试剂盒，其包含下述(a)和(b)：

30、(a)[1]～[3]中任一项的1种以上的hla基因用引物；

31、(b)聚合酶。

32、发明的效果

33、通过本发明，能够高度包罗hla-e、hla-f或hla-g基因的hla等位基因而进行检测或扩增。此外，通过本发明，能够扩增包含hla-e、hla-f或hla-g基因的非翻译区域的基因全长。