在鼠李糖代谢失效的宿主细胞中产生重组蛋白的方法及其表达载体、宿主细胞和重组蛋白与流程

本发明涉及适用于在细菌宿主细胞中表达重组蛋白的dna构建体，其中所述dna构建体包含编码以下的核苷酸序列：rhabad启动子、rhar转录激活子、rhas转录激活子、抗生素抗性标志物、至少一个终止子和复制起点。dna构建体还可以包含可操作地连接至编码抗生素抗性标志物的核酸的启动子，以及可操作地连接至rhabad启动子的编码所述重组蛋白的核苷酸序列。至少一个终止子可以是rrnb t1终止子和rrnb t2终止子。重组蛋白可以是兰尼单抗(ranibizumab)。本发明还涉及包含所述dna构建体的载体和细菌宿主细胞以及通过将所述细菌宿主细胞暴露于鼠李糖并由此诱导所述重组蛋白的表达来产生所述重组蛋白的方法。

背景技术：

0、发明背景

1、鼠李糖的代谢涉及l-鼠李糖经由渗透酶rhat被吸收到细胞中，然后由l-鼠李糖异构酶(rhaa)异构化为l-鼠李糖，然后l-鼠李糖由鼠李糖激酶(rhab)进一步磷酸化，最后由鼠李糖-1-磷酸醛缩酶(rhad)水解产生磷酸二羟基丙酮和l-乳醛[1]。基因rhaa、rhab和rhad形成称为rhabad的操纵子，并在rhabad启动子的帮助下转录[1]。与其他系统相比，鼠李糖代谢途径的区别在于需要称为rhas和rhar的两种转录激活子进行调节，如下文所述[1]。

2、rhabad操纵子是正调控的分解代谢操纵子，其从rhasr操纵子分别转录上述rhab、rhaa和rhad基因，其中大约240bp的dna将它们各自的转录起始位点分开[1]。rhasr操纵子编码rhas和rhar，其中二聚体rhas和rhar蛋白的每个单体含有两个螺旋-转角-螺旋基序，并与dna的两个大沟接触。rhar通过结合相对于rhasr转录起始位点跨越-32至-82个碱基的启动子dna来调节rhasr的转录[1]。在rhasr表达之后，rhas在相对于转录起始位点的-32至-81个碱基处结合rhabad操纵子上游的dna，以增加rhabad表达[1]。此外，rhasr-rhabad基因间区域含有相对于rhabad操纵子的转录起始位点在-92.5位置处的crp结合位点(crp1)和相对于rhasr操纵子的转录起始位点在位置-92.5(crp 2)、-115.5(crp 3)和-116.5(crp 4)处的crp结合位点[1]。环amp受体蛋白(crp)调节大肠杆菌中超过100个启动子的表达。

3、包含编码rhas、rhar和rhabad启动子的dna序列的dna构建体是本领域已知的。us8138324公开了ptaco和plemo衍生的质粒(即dna构建体)，该质粒包含编码rhas、rhar和rhabad启动子的dna序列。然而，us8138324没有提及使用鼠李糖代谢失效的宿主细胞。

4、基于包含编码rhas、rhar和rhabad启动子的dna序列的prha衍生质粒的dna构建体也是本领域已知的，例如来自giacalone等人[5]或hjelm等人[2]。giacalone等人描述了例如质粒prha67a和prha109a而hjelm等人公开了质粒prha67k。

5、尽管包含编码rhas、rhar和rhabad启动子的dna序列的dna构建体在本领域中是已知的，但仍然存在许多挑战，尤其是在重组蛋白特别是单克隆抗体或其片段的工业规模生产中。主要挑战是：

6、(i)宿主细胞受到压力，导致细胞大分子如细胞膜、蛋白质和核酸受损；

7、(ii)宿主细胞生长不良；

8、(iii)产生的重组蛋白活性差；和/或

9、(iv)获取重组蛋白的产率低。

10、因此，需要改进的dna构建体以及适合于以高产率有效生产重组蛋白(如单克隆抗体或其片段)的宿主细胞和方法，特别是当此类重组蛋白旨在用于治疗应用时。

11、发明目的

12、因此，本发明的目的是提供改进的dna构建体，以及细菌宿主细胞和适合于在细菌宿主细胞中以高产率有效生产重组蛋白(如单克隆抗体或其片段)的方法，特别是当此类重组蛋白旨在用于治疗应用时。重组蛋白可以是兰尼单抗。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明的第一方面涉及用于在细菌宿主细胞中表达兰尼单抗的dna构建体，其中兰尼单抗包含(i)包含seq id 3的氨基酸序列的轻链，和(ii)包含seq id 4的氨基酸序列的重链，其中所述dna构建体包含编码兰尼单抗的核苷酸序列，其中所述dna构建体还包含编码信号肽的至少一个核苷酸序列，所述核苷酸序列在转录方向上可操作地连接至编码兰尼单抗的轻链和/或兰尼单抗的重链的核苷酸序列，其中所述dna构建体包含编码以下的核苷酸序列：

2、-rhabad启动子，

3、-rhar转录激活子，

4、-rhas转录激活子，

5、-抗生素抗性标志物，

6、-至少一个终止子，以及

7、-pmb1复制起点。

8、在优选的实施方案中，所述dna构建体还包含编码启动子的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接至编码抗生素抗性标志物的核苷酸序列。

9、在优选的实施方案中，dna构建体还包含编码rrnb t1终止子和rrnb t2终止子的核苷酸序列。

10、在优选的实施方案中，dna构建体的特征在于：

11、-抗生素抗性标志物是卡那霉素抗性标志物，优选包含seq id 12的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列的卡那霉素抗性标志物；

12、-可操作地连接至编码抗生素抗性标志物的核苷酸序列的启动子是ampr启动子，优选包含seq id 13的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列的ampr启动子；

13、-rrnb t1终止子包含seq id 14的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；

14、-rrnb t2终止子包含seq id 15的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；和/或

15、-pmb1复制起点包含seq id 16的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列。

16、在优选的实施方案中，dna构建体的特征在于：

17、-抗生素抗性标志物是包含seq id 12的核苷酸序列的卡那霉素抗性标志物；

18、-可操作地连接至编码抗生素抗性标志物的核苷酸序列的启动子是包含seq id13的核苷酸序列的ampr启动子；

19、-rrnb t1终止子包含seq id 14的核苷酸序列；

20、-rrnb t2终止子包含seq id 15的核苷酸序列；和/或

21、-pmb1复制起点包含seq id 16的核苷酸序列。

22、在优选的实施方案中，dna构建体的特征在于：

23、-rhabad启动子包含seq id 8的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；

24、-rhar转录激活子包含seq id 9的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；

25、-rhas转录激活子包含seq id 11的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；

26、-抗生素抗性标志物是包含seq id 12的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列的卡那霉素抗性标志物；

27、-ampr启动子包含seq id 13的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；

28、-rrnb t1终止子包含seq id 14的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；

29、-rrnb t2终止子包含seq id 15的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；和

30、-pmb1复制起点包含seq id 16的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列。

31、在优选的实施方案中，dna构建体的特征在于：

32、-rhabad启动子包含seq id 8的核苷酸序列；

33、-rhar转录激活子包含seq id 9的核苷酸序列；

34、-rhas转录激活子包含seq id 11的核苷酸序列；

35、-抗生素抗性标志物是包含seq id 12的核苷酸序列的卡那霉素抗性标志物；

36、-ampr启动子包含seq id 13的核苷酸序列；

37、-rrnb t1终止子包含seq id 14的核苷酸序列；

38、-rrnb t2终止子包含seq id 15的核苷酸序列；和

39、-pmb1复制起点包含seq id 16的核苷酸序列。

40、在优选的实施方案中，dna构建体包含多克隆位点，该位点包含可由限制酶ecori、ndei、noti、xhoi、pspxi、paer71、bbsi、styi、avrii、bani、acc65i、kpni、eco53ki、saci、bamhi、xbai、sali、acci、psti、sbfi、sphi和hindiii切割的17个限制位点。

41、在优选的实施方案中，dna构建体包含seq id 1的核苷酸序列，或与其具有至少90％的序列同一性的序列，优选seq id 1的核苷酸序列。

42、在优选的实施方案中，编码兰尼单抗的核苷酸序列可操作地连接至rhabad启动子。

43、在优选的实施方案中，编码兰尼单抗的核苷酸序列包含(i)编码兰尼单抗轻链的核苷酸序列，该序列包含seq id 5的序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列，和/或(ii)编码兰尼单抗重链的核苷酸序列，该序列包含seq id 6的序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列。在进一步优选的实施方案中，所述编码兰尼单抗的核苷酸序列包含(i)编码兰尼单抗轻链的包含seq id 5的序列的核苷酸序列，和/或(ii)编码兰尼单抗重链的包含seq id 6的序列的核苷酸序列。

44、在实施方案中，编码信号肽的核苷酸序列在转录方向上可操作地连接至seq id 5和seq id 6的核苷酸序列之一或两者。

45、在实施方案中，信号肽是pelb(果胶裂解酶b)。在优选的实施方案中，编码pelb信号肽的核苷酸序列包含seq id 7的序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；更优选地，编码pelb信号肽的核苷酸序列包含seq id 7的序列。

46、在一个实施方案中，所得pelb信号肽包含seq id 18的氨基酸序列[6]：mkyllptaaagllllaaqpama。

47、在优选的实施方案中，dna构建体包含seq id 17的序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列，优选地包含seq id 17的序列。

48、本发明的第二方面涉及包含根据本发明第一方面的任何dna构建体的表达载体。

49、本发明的第三方面涉及包含根据本发明第一方面的dna构建体或根据本发明第二方面的表达载体的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞优选大肠杆菌细胞，更优选大肠杆菌k-12细胞。

50、在优选的实施方案中，所述细菌宿主细胞或者包含(i)在rhab基因的核酸序列中包含使rhab失活的突变的染色体，或者包含(ii)其中编码rhab的核苷酸序列缺失的染色体。

51、在优选的实施方案中，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌w3110细胞，优选包含在编码rhab的核苷酸序列中包含移码突变的染色体。

52、在优选的实施方案中，所述细菌宿主细胞是包含染色体的大肠杆菌w3110细胞，该染色体包含seq id 2的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列，优选seq id2的核苷酸序列，其中任选地细菌宿主细胞的染色体还包含编码rhat的核苷酸序列。

53、本发明的第四方面涉及产生兰尼单抗的方法，该方法包括将根据本发明第三方面的细菌宿主细胞暴露于鼠李糖，从而诱导兰尼单抗表达的步骤。在优选的实施方案中，该方法还包括从细菌宿主细胞中回收兰尼单抗的步骤；并且任选地还包括优选地通过一个或多个层析步骤实现的一个或多个纯化回收的兰尼单抗的步骤。

54、本发明的第五方面涉及产生兰尼单抗的方法，该方法包括以下步骤：

55、将编码重组蛋白的核苷酸序列克隆到dna构建体中，该构建体包含seq id 1的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列，优选seq id 1的核苷酸序列，使得编码兰尼单抗蛋白的核苷酸序列可操作地连接至rhabad启动子；和

56、a.将所得核苷酸序列引入包含染色体的细菌宿主细胞中，该染色体包含使鼠李糖代谢失效的突变或修饰。

57、在优选的实施方案中，该方法还包括将细菌宿主细胞暴露于鼠李糖，从而诱导重组蛋白表达的步骤。

58、在另一个实施方案中，该方法还包括从细菌宿主细胞中回收兰尼单抗的步骤；并且任选地还包括优选地通过一个或多个层析步骤实现的纯化回收的兰尼单抗的一个或多个步骤。

59、在优选的实施方案中，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞，更优选大肠杆菌k-12细胞，最优选大肠杆菌w3110细胞。

60、在优选的实施方案中，所述细菌宿主细胞或者包含(i)在rhab基因的核苷酸序列中包含使rhab失活的突变的染色体，或者包含(ii)其中编码rhab的核苷酸序列缺失的染色体。

61、在优选的实施方案中，所述细菌宿主细胞是包含在编码rhab的核苷酸序列中包含移码突变的染色体的大肠杆菌w3110细胞。

62、在优选的实施方案中，所述细菌宿主细胞是包含染色体的大肠杆菌w3110细胞，该染色体包含seq id 2的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列，优选seq id2的核苷酸序列，其中任选地细菌宿主细胞的染色体还包含编码rhat的核苷酸序列。

63、在优选的实施方案中，所述编码兰尼单抗的核苷酸序列包含(i)编码兰尼单抗轻链的核苷酸序列，该核苷酸序列包含seq id 5的序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列，和/或(ii)编码兰尼单抗重链的核苷酸序列，该核苷酸序列包含seq id 6的序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；优选地，所述编码重组蛋白的核苷酸序列包含(i)编码兰尼单抗轻链的包含seq id 5的序列的核苷酸序列，和/或(ii)编码兰尼单抗重链的包含seq id 6的序列的核苷酸序列。

64、在优选的实施方案中，包含seq id 5和/或seq id 6的核苷酸序列还包含编码信号肽的核苷酸序列，该核苷酸序列在转录方向上可操作地连接至seq id 5和/或seq id 6的核苷酸序列。

65、在优选的实施方案中，所述编码信号肽的核苷酸序列是编码pelb信号肽的核苷酸序列，优选地，编码pelb信号肽的核苷酸序列包含seq id 7的序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列；优选地，编码pelb信号肽的核苷酸序列包含seq id 7的序列并且融合至编码兰尼单抗的轻链和/或重链的核苷酸序列。

66、在优选的实施方案中，所得待引入细菌宿主细胞的核苷酸序列包含seq id 17的序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列，优选包含seq id 17的序列。

67、本发明的第六方面涉及作为大肠杆菌w3110细胞的细菌宿主细胞，并且包含在编码rhab的核苷酸序列中包含移码突变的染色体。在实施方案中，所述大肠杆菌w3110宿主细胞包含染色体，该染色体包含seq id 2的核苷酸序列或与其具有至少90％的序列同一性的序列，优选seq id 2的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，细菌宿主细胞的染色体包含编码rhat的核苷酸序列。

68、本发明的各个方面(及其实施方案)的上述seq id 1-18中的一个或多个可以被与其具有至少90％的序列同一性的序列替代。本文所用的术语“序列同一性”是关于氨基酸或核苷酸序列使用的，并且序列同一性是在特定序列的整个长度上。因此，序列可以是与指定氨基酸或核苷酸序列至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。因此，本发明的此类序列包括对本发明序列的单个或多个核苷酸或氨基酸改变(添加、取代、插入或缺失)。在氨基酸水平上，具有上述定义的序列同一性的优选序列在本发明的序列中含有多达5个，例如1、2、3、4或5个，优选1、2或3个，更优选1或2个改变的氨基酸。