细胞外囊泡的产生用培养基、培养基试剂盒、添加剂及细胞外囊泡的产生方法与流程

本发明涉及一种细胞外囊泡的产生用培养基、培养基试剂盒、添加剂、细胞外囊泡的产生方法。

背景技术：

1、来源于细胞的由脂质双重膜构成的小型膜囊泡即细胞外囊泡(extracellularvesicle)被认为担负着经由内包的mrna或microrna等核酸、或者蛋白质的搬运的细胞间信息传递(非专利文献1)。并且，以使用了细胞外囊泡的疾病的诊断或质量等为目的，进行培养并获得细胞外囊泡。

2、作为由间充质干细胞产生(分泌)的细胞外囊泡的获得方法，已知有从培养了间充质干细胞的细胞培养上清液通过超离心分离法等获得的方法。

3、通常，细胞培养时使用以向细胞供给营养成分为目的添加了来源于胎牛的血清(fbs)的培养基(细胞培养液)。然而，由于fbs含有大量来源于胎牛的细胞外囊泡，因此在细胞外囊泡的纯化中不希望使用包含fbs的培养基。

4、因此，作为无血清培养基，非专利文献2中，使用作为基础培养基的d-mem(包含4mm的l-谷氨酰胺)，非专利文献3中，使用在作为基础培养基的d-mem(包含4mm的l-谷氨酰胺)中包含0.01μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)等的培养基。

5、现有技术文献

6、非专利文献

7、非专利文献1：mathieu m,martin-jaular l,lavieu g,thery c(2019)specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellularvesicl es for cell-to-cell communication.nat cell biol,21(1):9-17

8、非专利文献2：basalova et al.,(2020)secretome of mesenchymal stroma lcells prevents myofibroblasts differentiation by transferring fibrosis-associat ed micrornas within extracellular vesicles.cells:9(5):1272.

9、非专利文献3：mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles asmediators of anti-inflammatory effects:endorsement of macrophage polarization

技术实现思路

1、发明要解决的技术课题

2、然而，本发明人等使用作为所述基础培养基的d-mem、或者在作为基础培养基的d-mem中添加了bfgf的培养基而产生细胞外囊泡时，发现所产生的细胞外囊泡极少，不足以在产业中利用。

3、鉴于上述情况，本发明的课题在于提供一种促进细胞外囊泡的产生的细胞外囊泡的产生用培养基、试剂盒、添加剂及细胞外囊泡的产生方法。

4、用于解决技术课题的手段

5、本发明人等为了解决上述课题，对细胞外囊泡的产生用培养基的成分进行了深入研究的结果发现，通过使用细胞外囊泡的产生用培养基，促进细胞外囊泡的产生，以致完成了本发明，该细胞外囊泡的产生用培养基含有选自l-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，含有l-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的l-谷氨酰胺或其盐的浓度为5mm以上。

6、即，本发明是细胞外囊泡的产生用培养基，其基本方式为如下：

7、(1)一种细胞外囊泡的产生用培养基，其含有动物细胞培养用基础培养基、及选自l-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，

8、含有l-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的l-谷氨酰胺或其盐的浓度为5mm以上；

9、(2)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述l-谷氨酰胺或其盐；

10、(3)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转铁蛋白；

11、(4)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述亚硒酸或其盐；

12、(5)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转铁蛋白及所述亚硒酸或其盐；

13、(6)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述胰岛素；

14、(7)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述胰岛素样生长因子；

15、(8)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述血清素化合物；

16、(9)根据(1)所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有所述转化生长因子β；

17、(10)根据选自(1)至(9)中任一项所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其不包含血清；

18、(11)根据选自(1)至(10)中任一项所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有选自所述l-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少两种成分；

19、(12)根据选自(1)至(10)中任一项所述的细胞外囊泡的产生用培养基，其含有选自所述l-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少三种成分。

20、本发明是细胞外囊泡的产生用培养基试剂盒，具体而言为如下。

21、(13)一种细胞外囊泡的产生用培养基试剂盒，

22、其包括动物细胞培养用基础培养基、及含有选自l-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分的细胞外囊泡的产生用添加剂，

23、所述细胞外囊泡的产生用添加剂含有l-谷氨酰胺或其盐的情况下的所述细胞外囊泡的产生用添加剂包含细胞外囊泡的产生用培养基中的l-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mm以上的量的l-谷氨酰胺或其盐。

24、本发明也是细胞外囊泡的产生用添加剂，具体而言为如下。

25、(14)一种细胞外囊泡的产生用添加剂，其用于制造培养基，其中，

26、所述培养基是选自(1)至(12)中任一项所述的培养基，

27、含有选自l-谷氨酰胺或其盐、转铁蛋白、亚硒酸或其盐、胰岛素、胰岛素样生长因子、血清素化合物及转化生长因子β中的至少一种成分，

28、包含含有l-谷氨酰胺或其盐的情况下的细胞外囊泡的产生用培养基中的l-谷氨酰胺或其盐的浓度成为5mm以上的量的l-谷氨酰胺或其盐。

29、本发明也是细胞外囊泡的产生方法，具体而言为如下。

30、(15)一种细胞外囊泡的产生方法，其包括使用选自(1)至(12)中任一项所述的培养基，并从间充质干细胞产生细胞外囊泡的步骤。

31、发明效果

32、根据本发明的细胞外囊泡的产生用培养基、试剂盒及细胞外囊泡的产生方法，促进细胞外囊泡的产生。