用于分离双链断裂的方法

本发明涉及用于确定核酸样品中的dna双链断裂(dsb)的数量和性质的方法，所述核酸样品理想情况下为基因组dna (gdna)；用于实施前述方法的成套试剂盒，其包含至少多个用于连接至所述核酸样品的寡核苷酸；以及用于所述试剂盒和所述方法的寡核苷酸。

背景技术：

0、发明背景

1、核酸中的断裂(其中一条或多条核酸主链被切断)对细胞和生物体特别有害，因为它们可以导致基因组重排。此类断裂包括通常在dna中的双链断裂(dsb)，这是所有dna损伤中最危险的，因为如果不修复的话它们直接损害基因组的稳定性。除了引起细胞死亡和无法正确地修复外，dsb可以经由形成结构性基因组改变而导致癌变，所述结构性基因组改变包括体细胞中的缺失、插入、dna易位和有丝分裂重组事件。在健康细胞中，据估计在细胞周期过程中每个细胞形成多达50个内源性dsb。这些低水平的生理性断裂作为正常的细胞过程(诸如dna复制、转录和染色质环化)的结果而偶尔发生，或是由于为了促进减数分裂期间的过程(诸如v(d)j重组)而由细胞编程的反复断裂形成而以较高水平发生。v(d)j重组是适应性免疫系统的定义性特征。其是在b细胞和t细胞成熟的早期阶段期间在发育的淋巴细胞中发生的遗传重组的独特机制。其涉及体细胞重组，并导致分别在b细胞和t细胞中发现的抗体/免疫球蛋白和t细胞受体(tcr)的高度多样性的谱系(repertoire)。

2、除了通过正常细胞过程获得的dsb外，多种外源物理和化学试剂，诸如电离辐射、化疗药物和更近来的crispr基因组编辑技术，也是链断裂(特别是基因组dsb)的有效诱导物。

3、理解在核酸(特别是基因组)中产生断裂的过程和修复它们的机制对于基因组医学是至关重要的。从确定癌症的原因和治愈，到基因组编辑技术的安全发展，对基因组中dna双链断裂的频率、位置和原因的精确和准确的测量是最重要的。但是，在细胞中同时测量内源和外源/诱导的dsb的全基因组景观(genome-wide landscape)是具有挑战性的，主要是因为相对于频繁诱导的复发事件的极大范围的罕见偶发性断裂事件。

4、下一代测序(ngs)的出现推动了在基因组规模上检测和测量与核酸链断裂(特别是dsb)相关的dna序列的多种方法的开发。这些方法大致分为三类：

5、i)使用蛋白作为断裂的代替物的间接断裂标记(例如y/h2ax chip-seq、discover-seq)；

6、ii)修复的断裂的间接标记(例如guide-seq、htgts)，和

7、iii)细胞中未修复的断裂末端的直接标记(例如bless、dsbcapture、end-seq、bliss)。

8、尽管在这些方法的每次迭代中进行了许多技术上的渐进改进，但是它们所有均受困于共同的根本缺陷；在测序前通过pcr标记和富集样品中的dsb之后，依赖于ngs所需的标准dna文库制备。该方法的pcr扩增阶段在dna测序文库中引入了显著的偏差，导致样品中存在的dsb的原始模式的间接和失真的表现。这是一种公知的现象，使得不可能确定样品中原始dsb组成的量化。对许多ngs应用，诸如全基因组/外显子组测序，这可能不代表重要的问题。但是对于特定特征(诸如dsb)的定量的、基因组范围的测量，pcr扩增偏差将高水平的噪声引入到信号(dsb)已经非常低的系统中。

9、为了克服这一缺点，我们设计了新的dna文库制备方案，该方案避免了在检测dsb之前通过pcr进行断裂序列扩增的需要，并且此外还增强了dsb信号。通过改善dsb检测的信噪比，我们获得了样品中基因组断裂的直接测量，其中一个序列读段(read)等同于样品中存在的一个断裂，理想情况下为dsb。

技术实现思路

0、发明概述

1、在本文中，我们描述了我们的新方法，称为induce-seq，该方法用于直接测量核酸断裂(通常为dsb)，此外，我们证明了该方法鉴定断裂模式的能力，所述断裂模式可以表征由多种不同的生理和诱导原因形成的断裂。

2、induce-seq由此可以同时检测由生理转录和dna复制引起的低水平偶发性双链断裂以及由限制酶或基因组编辑核酸酶(诸如crispr-cas9)诱导的更高水平的复发性断裂的存在。induce-seq因此可用于确定dna断裂形成的起源及其修复机制，以及用于基因组编辑的安全发展。

3、在本发明的一个方面，提供了用于鉴定核酸样品中的dna双链断裂(dsb)的方法，该方法包括：

4、i)在连接条件下将怀疑含有dsb的核酸的样品暴露于第一对寡核苷酸，所述第一对寡核苷酸的第一寡核苷酸包含使得所述寡核苷酸能够连接至所述dsb的第一链的5’结合特征、第一测序引物可与之结合的杂交位点(rd1 sp)和用于从dsb池中分离所述dsb的结合序列；和第二寡核苷酸，其与第一对的所述第一寡核苷酸互补并包含使得所述寡核苷酸能够连接至所述dsb的第二链的3’结合特征；其中所述寡核苷酸的一种或两种包含3’和/或5’保护性特征；

5、ii)将所述样品的核酸片段化成片段；

6、iii)在连接条件下将所述片段暴露于第二对寡核苷酸，所述第二对寡核苷酸的第一寡核苷酸包含使得所述寡核苷酸能够连接至所述片段化核酸的第一链的5’结合特征和第二测序引物可与之结合的杂交位点(rd2 sp)；和第二较长的寡核苷酸，其与第二对的所述第一寡核苷酸部分互补并包含用于与所述片段化核酸的第二链结合的3’结合特征、与所述杂交位点互补的序列、和另外的序列，其任选为用于实现桥式扩增的结合序列；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种包含3’和/或5’保护性特征；

7、iv)使片段变性以提供单链核酸；

8、v)将部分iv)的链分成两组：a组，已经在第一末端处连接由部分i)的寡核苷酸提供的第一杂交位点和结合序列并在另一末端处连接由部分iii)的寡核苷酸提供的第二杂交位点和另外的序列的那些片段，和b组，并未在第一末端处连接由部分i)的寡核苷酸提供的杂交位点和结合序列以及并未在另一末端处连接由部分iii)的寡核苷酸提供的第二杂交位点和另外的序列的那些片段；和

9、vi)使用与第一和/或第二杂交位点结合的引物对a组的链进行测序，其中每个序列等同于一个dsb断裂，并且进一步地，其中碱基对缺失的数量和性质可以通过将每个序列与代表从中采集样品的所述物种的基因组进行比较来确定。

10、包含5’结合特征的第二对的寡核苷酸可以不包含用于分离所述片段化核酸的结合序列。

11、部分i)和部分iii)的寡核苷酸可以互换，由此，在步骤ii)中片段化后，首先将核酸暴露于部分iii)的寡核苷酸，并随后将核酸暴露于部分i)的寡核苷酸。

12、核酸样品可以是gdna。

13、5’和/或3’结合特征可包含以下的一种：磷酸基团；三磷酸“t尾”，优选脱氧胸苷三磷酸“t尾”；三磷酸“a尾”，优选脱氧腺苷三磷酸“a尾”；至少一个随机n核苷酸和多个n核苷酸。5’和/或3’保护性特征可包含提供对以下的任意一个或多个的抗性的特征：磷酸化活性、磷酸酶活性、末端转移酶活性、核酸杂交、核酸内切酶活性、核酸外切酶活性、连接酶活性、聚合酶活性和蛋白结合。保护性特征可包含硫代磷酸酯连接(phosphorothioatelinkage)、双脱氧核苷酸或共价嵌段、亚磷酰胺、c3间隔子亚磷酰胺(3spc3)。

14、部分i)的所述第一寡核苷酸的5’结合特征可以是磷酸基团，并且部分i)的所述第二寡核苷酸的所述3’结合特征可以是三磷酸尾。部分i)的第一和第二寡核苷酸还可包含索引特征，所述索引特征是使得能够确定汇集样品(pooled sample)的来源的特定核苷酸序列。

15、部分i)的第一寡核苷酸，从5’至3’读取，可包含5’结合特征和随后任选的保护性特征、测序引物可与之结合的杂交位点(rd1 sp)、索引序列、用于从dsb池中分离所述dsb的结合序列、和3’结合和/或保护性特征。结合特征可以是磷酸基团。部分i)的第二寡核苷酸，从3’至5’读取，可包含3’结合特征和随后任选的保护性特征、测序引物可与之结合的杂交序列(rd1 sp)、索引序列、用于从dsb池中分离所述dsb的结合序列、和5’结合和/或保护性特征。3’结合特征可包含3’脱氧胸苷三磷酸“t尾”以及硫代磷酸酯连接。

16、部分i)的第一寡核苷酸对的第一和/或第二寡核苷酸可包含两种不同的末端保护性特征。部分iii)的第二寡核苷酸对的所述第一寡核苷酸的5’结合特征可以是磷酸基团，并且部分iii)的所述第二寡核苷酸的所述3’结合特征可以是三磷酸尾。

17、部分iii)的第一和第二寡核苷酸还可包含索引特征，所述索引特征是使得能够确定汇集样品的来源的特定核苷酸序列。

18、部分iii)的第二寡核苷酸，从5’至3’读取，可包含5’结合特征和随后任选的保护性特征、任选用于实现桥式扩增的另外的序列、索引序列、测序引物可与之结合的杂交位点(rd2 sp)、和3’结合和/或保护性特征。

19、部分iii)的第二寡核苷酸对的第一或第二寡核苷酸可包含两种不同的末端保护性特征。

20、部分i)的寡核苷酸可包含具有seq id no.1的第一寡核苷酸和具有seq id no.2的第二寡核苷酸；或与seq id no.1或2共享至少80％同一性或同源性的寡核苷酸。部分iii)的第二对寡核苷酸可包含具有seq id no.3的第一寡核苷酸和具有seq id no.4的第二寡核苷酸；或与seq id no.3或4共享至少80％同一性或同源性的寡核苷酸。部分iii)的所述第二对寡核苷酸的第二寡核苷酸可包含以下序列中的任一种：seq id no.4-28；或与seq id no.4-28中的一种共享至少80％同一性或同源性的寡核苷酸。

21、样品可以是哺乳动物或人。部分i)中的连接可以原位发生或使用细胞或组织样品体外发生。在进行步骤i)之前，样品可以暴露于透化剂。在进行步骤i)之前，样品可以暴露于至少一种用于进行精氨酸尾修复的试剂。

22、部分i)还可包括在进行后续步骤之前从所述样品中提取gdna。

23、方法可进一步包括在部分ii)和/或部分iv)之后，除去其尺寸小于大约100bp、或小于大约150bp的片段，和/或保留其尺寸大于大约150bp的片段。

24、部分v)的分离可以涉及使用由部分i)的寡核苷酸提供的所述结合序列来结合配偶体，并因此将部分iv)的a组链与任何其它链分离。

25、由部分i)的寡核苷酸提供的所述结合序列的互补结合链可以锚定在基底上，并且所述核酸单链流经或流过锚定的互补结合链。

26、部分vi)可以涉及桥式扩增，其中在部分v)下分离的单链在已在部分i)的第一寡核苷酸的结合序列和部分iii)的第二寡核苷酸的另外的序列的寡核苷酸/结合位点锚定于其上的基底上进行克隆扩增。

27、在进行要求保护的方法之前，可以将含有或怀疑含有单链断裂的样品连接或断裂以确保该单链断裂转化为双链断裂。

28、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定gdna样品中的dna双链断裂(dsb)的成套试剂盒，其包含：

29、i)第一对寡核苷酸，所述第一对寡核苷酸的第一寡核苷酸包含使得所述寡核苷酸能够连接至所述dsb的第一链的5’结合特征、第一测序引物可与之结合的杂交位点(rd1sp)和用于从dsb池中分离所述dsb的结合序列；和第二寡核苷酸，其与第一对的所述第一寡核苷酸互补，并包含用于与所述dsb的第二链结合的3'结合特征；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种包含3’和/或5’保护性特征；和

30、ii)第二对寡核苷酸，所述第二对寡核苷酸的第一寡核苷酸包含使得所述寡核苷酸能够连接至所述dsb的第一链的5’结合特征，和第二测序引物可与之结合的杂交位点(rd2 sp)；和第二较长的寡核苷酸，其与第二对的所述第一寡核苷酸部分互补，并包含用于与所述dsb的第二链结合的3'结合特征、与所述杂交位点互补的序列、和另外的序列，其任选为用于实现桥式扩增的结合序列；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种包含3’和/或5’保护性特征。

31、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定gdna样品中的dsb的样品制备试剂盒，其包含：

32、i)第一对寡核苷酸，所述第一对寡核苷酸的第一寡核苷酸包含使得所述寡核苷酸能够连接至双链核酸的一条链，并包含根据tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的序列的5’结合特征；和第二寡核苷酸，其与第一对的所述第一寡核苷酸互补；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种分别包含3’和/或5’保护性特征；和

33、ii)第二对寡核苷酸，所述第二对寡核苷酸的第一寡核苷酸不包含序列atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的超过5、10、15或20个碱基的序列，或不包含序列atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的全部24个碱基；和第二寡核苷酸，其包含使得所述寡核苷酸能够连接至双链核酸的一条链，并包含根据caagcagaagacggcatacgagat(seq id no:32)的序列的3’结合特征；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种分别包含3’和/或5’保护性特征。

34、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定gdna样品中的dsb的样品制备试剂盒，其包含：

35、i)第一对寡核苷酸，所述第一对寡核苷酸的第一寡核苷酸包含使得所述寡核苷酸能够连接至双链核酸的一条链，并包含根据atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的序列的5’结合特征；和第二寡核苷酸，其与第一对的所述第一寡核苷酸互补；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种分别包含3’和/或5’保护性特征；和

36、ii)第二对寡核苷酸，所述第二对寡核苷酸的第一寡核苷酸不包含序列tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的超过5、10或15个碱基的序列，或不包含序列tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的全部20个碱基；和第二寡核苷酸，其包含使得所述寡核苷酸能够连接至双链核酸的一条链，并包含根据aatgatacggcgaccaccga(seq idno:34)的序列的3’结合特征；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种分别包含3’和/或5’保护性特征。

37、第一对和/或第二对寡核苷酸的第一寡核苷酸可包含第一测序引物可与之结合的杂交位点。部分i)和/或部分ii)的第一和第二寡核苷酸可包含索引特征，所述索引特征是使得能够确定汇集样品的来源的特定核苷酸序列。

38、试剂盒可进一步包含至少一种引物，其与第一和/或第二杂交位点结合以便用于测序目的。试剂盒可进一步包含分别用于将核酸片段化和/或变性成片段和/或单链的片段化剂和/或变性剂。

39、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定核酸样品，诸如gdna样品中的dna双链断裂(dsb)的双链衔接子，其包含：第一寡核苷酸链，其包含使得所述寡核苷酸能够连接至所述dsb的第一链的5’结合特征、测序引物可与之结合的杂交位点(rd1 sp)和用于从dsb池中分离所述dsb的结合序列；和第二寡核苷酸链，其与所述第一寡核苷酸互补并包含用于与所述dsb的第二链结合的3'结合特征；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种包含3’和/或5’保护性特征。

40、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定核酸样品，诸如gdna样品中的dna双链断裂(dsb)的双链衔接子，其包含：第一寡核苷酸链，其包含使得所述寡核苷酸能够连接至所述dsb的第一链的5’结合特征和测序引物可与之结合的杂交位点(rd2 sp)；和第二较长的寡核苷酸链，其与所述第一寡核苷酸部分互补，并包含用于与所述dsb的第二链结合的3'结合特征、与所述杂交位点互补的序列、和另外的序列，其任选为用于实现桥式扩增的结合序列；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种包含3’和/或5’保护性特征。

41、衔接子可包含含有索引特征的第一和第二寡核苷酸，所述索引特征是使得能够确定汇集样品的来源的特定核苷酸序列。

42、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定核酸样品中的dna双链断裂(dsb)的双链衔接子，其包含：第一寡核苷酸链，其不包含序列atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的超过5、10、15或20个碱基的序列，或不包含序列atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的全部24个碱基；和第二寡核苷酸，其包含使得所述寡核苷酸能够连接至双链核酸的一条链并包含根据caagcagaagacggcatacgagat(seq id no:32)的序列的3’结合特征；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种分别包含3’和/或5’保护性特征。

43、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定核酸样品中的dna双链断裂(dsb)的双链衔接子，其包含：第一寡核苷酸链，其不包含序列tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的超过5、10或15个碱基的序列，或不包含序列tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的全部20个碱基；和第二寡核苷酸，其包含使得所述寡核苷酸能够连接至双链核酸的一条链，并包含根据aatgatacggcgaccaccga(seq id no:34)的序列的3’结合特征；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种分别包含3’和/或5’保护性特征。

44、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定核酸样品中的dna双链断裂(dsb)的样品制备方法，其中制备包括修饰dsb相关核酸以适于与包含固定引物的基底结合，该方法包括：

45、a)提供包含多个核酸的样品；

46、b)在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第一衔接子，其中第一衔接子包含能够连接至dsb的一条链的3’末端的寡核苷酸且所述寡核苷酸包含能够通过杂交与固定于基底的引物结合的序列；

47、c)片段化多个核酸；和

48、d)在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第二衔接子，其中第二衔接子包含能够在片段化诱导的断裂处连接至一条链的5’末端但不能连接至第一衔接子的寡核苷酸，且所述寡核苷酸不包含能够通过杂交与固定于基底的引物结合的序列。

49、步骤d)的寡核苷酸可包含与第二引物的区域相同的序列。基底可包含第一和第二固定引物；步骤b)的寡核苷酸可包含能够通过杂交与第一固定引物结合的序列；并且步骤d)的寡核苷酸可包含与第二固定引物的区域相同的序列。

50、在一个实施方案中，步骤b)是：在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第一衔接子对，其中第一衔接子对能够连接至dsb的一条链的至少3’末端，并且其中第一衔接子对包含至少部分互补的第一和第二寡核苷酸，并且第一寡核苷酸可连接至3’末端并包含能够通过杂交与固定于基底的引物结合的序列；以及步骤d)是：

51、在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第二衔接子对，其中第二衔接子对能够在片段化诱导的断裂处连接至一条链的至少5’末端，但不能连接至第一衔接子对的第一寡核苷酸，其中第二衔接子包含第一和第二部分互补的寡核苷酸，并且第一寡核苷酸可连接至5’末端并包含与第二引物的区域相同的序列，并且第二寡核苷酸不包含与所述与第二引物的区域相同的序列互补的序列。

52、在方法的一个实施方案中，第二衔接子对包含：

53、含有根据caagcagaagacggcatacgagat(seq id no:32)的序列的第一寡核苷酸，和含有不包含序列atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的超过5、10、15或20个碱基的序列，或不包含序列atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的全部24个碱基的序列的第二寡核苷酸；或

54、含有根据aatgatacggcgaccaccga(seq id no:34)的序列的第一寡核苷酸，和含有不包含序列tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的超过5、10或15个碱基的序列，或不包含序列tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的全部20个碱基的序列的第二寡核苷酸。

55、第一衔接子对的第一和/或第二寡核苷酸可包含3’和/或5’保护性特征；和/或其中第二衔接子对的第一和/或第二寡核苷酸包含3’和/或5’保护性特征。在一个实施方案中，由于第一衔接子的3’修饰的存在，第二衔接子不能连接至第一衔接子。

56、在一个实施方案中，可连接至5’末端的第二衔接子的寡核苷酸包含与固定引物的5、10、15、20、21、24或更多个碱基相同的序列。

57、方法可进一步包含使多个核酸变性以形成多个单链核酸。方法可进一步包括在适于固定引物与互补核酸杂交的条件下使多个核酸与包含固定引物的基底接触。方法可进一步包括获得与基底杂交的任何核酸的序列信息。

58、在方法的一个实施方案中，包含多个核酸的样品是gdna。

59、在一些实施方案中，步骤以a)、b)、c)和随后d)的顺序进行。在另一些实施方案中，步骤以a)、c)、d)和随后b)的顺序进行；其中在步骤d)和b)之间将样品暴露于能够引起或怀疑能够引起dsb的条件。

60、在一些实施方案中，将样品暴露于能够在核酸样品中的目标特征处引起dsb的条件。

61、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定核酸样品中的dna双链断裂(dsb)的样品制备方法，其中制备包括修饰dsb相关核酸以适于与包含固定的第一引物的基底结合，该方法包括：

62、1)提供包含多个核酸的样品；

63、2)在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第一衔接子，其中第一衔接子包含能够连接至dsb的一条链的3’末端的寡核苷酸且所述寡核苷酸包含能够与第二引物杂交的序列；

64、3)片段化多个核酸；

65、4)在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第二衔接子，其中第二衔接子包含能够在片段化诱导的断裂处连接至一条链的5’末端但不能连接至第一衔接子的寡核苷酸，且所述寡核苷酸包含与固定的第一引物的区域相同的序列；和

66、5)在适于引物延伸的条件下使多个核酸与第二引物接触。

67、在一个实施方案中，步骤2)是：在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第一衔接子对，其中第一衔接子对能够连接至dsb的一条链的至少3’末端，并且其中第一衔接子对包含至少部分互补的第一和第二寡核苷酸，并且第一寡核苷酸可连接至3’末端并包含能够与第二引物杂交的序列；以及步骤4)是：

68、在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第二衔接子对，其中第二衔接子对能够在片段化诱导的断裂处连接至一条链的至少5’末端但不能连接至第一衔接子对的第一寡核苷酸，其中第二衔接子包含第一和第二部分互补的寡核苷酸，并且第一寡核苷酸可连接至5’末端并包含与固定的第一引物的区域相同的序列，并且第二寡核苷酸不包含与所述与固定的第一引物的区域相同的序列互补的序列。

69、第二衔接子对可包含含有根据aacccactacgcctccgctttcc(seq id no:40)的序列的第一寡核苷酸；和不包含序列ggaaagcggaggcgtagtggtt(seq id no:36)的超过5、10、15、20个碱基的序列，或不包含序列ggaaagcggaggcgtagtggtt(seq id no:36)的全部22个碱基的第二寡核苷酸。

70、第一衔接子对的第一和/或第二寡核苷酸可包含3’和/或5’保护性特征；和/或其中第二衔接子对的第一和/或第二寡核苷酸包含3’和/或5’保护性特征。在一个实施方案中，由于第一衔接子的3’修饰的存在，第二衔接子不能连接至第一衔接子。

71、在一个实施方案中，可连接至5’末端的第二衔接子的寡核苷酸包含与固定引物的5、10、15、20、21、24或更多个碱基相同的序列。

72、方法可进一步包括使多个核酸变性以形成多个单链核酸。方法可进一步包括在适于固定的第一引物与互补核酸杂交的条件下使多个核酸与包含固定的第一引物的基底接触。方法可进一步包括获得与基底杂交的任何核酸的序列信息。包含的样品可以是gdna。

73、在一个实施方案中，步骤以1)、2)、3)、4)和随后5)的顺序进行。在另一个实施方案中，步骤以1)、3)、4)、2)和随后5)的顺序进行；其中在步骤4)和2)之间将样品暴露于能够引起或怀疑能够引起dsb的条件。

74、在一个实施方案中，将样品暴露于能够在核酸样品中的目标特征处引起dsb的条件。

75、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定核酸样品中的目标特征的样品制备方法，其中制备包括修饰与目标特征相关的核酸以适于与包含固定引物的基底结合，该方法包括：

76、a)提供包含多个核酸的样品，将多个核酸暴露于能够在目标特征处切割核酸的至少一条链的条件，并使多个核酸变性成单链核酸；

77、b)在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第一衔接子，其中第一衔接子包含能够连接至切割位点的一条链的3’末端的寡核苷酸且所述寡核苷酸包含能够通过杂交与固定于基底的引物结合的序列；

78、c)片段化多个核酸；和

79、d)在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第二衔接子，其中第二衔接子包含能够在片段化诱导的断裂处连接至一条链的5’末端但不能连接至第一衔接子的寡核苷酸，且所述寡核苷酸不包含能够通过杂交与固定于基底的引物结合的序列。

80、目标特征可以是能够被特异性切割的任何特征。目标特征可以是环丁烷嘧啶二聚体(cpd)、8-氧代鸟嘌呤或脱碱基位点。

81、步骤d)的寡核苷酸可包含与第二引物的区域相同的序列。基底可包含第一和第二固定引物；步骤b)的寡核苷酸可包含能够通过杂交与第一固定引物结合的序列；以及步骤d)的寡核苷酸可包含与第二固定引物的区域相同的序列。

82、在一个实施方案中，步骤b)是：在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第一衔接子对，其中第一衔接子对能够连接至切割位点的一条链的至少3’末端，并且其中第一衔接子对包含至少部分互补的第一和第二寡核苷酸，并且第一寡核苷酸可连接至3’末端并包含能够通过杂交与固定于基底的引物结合的序列；以及其中步骤d)是：

83、在有助于连接的条件下将多个核酸暴露于第二衔接子对，其中第二衔接子对能够在片段化诱导的断裂处连接至一条链的至少5’末端但不能连接至第一衔接子对的第一寡核苷酸，其中第二衔接子包含第一和第二部分互补的寡核苷酸，并且第一寡核苷酸可连接至5’末端并包含与第二引物的区域相同的序列，并且第二寡核苷酸不包含与所述与第二引物的区域相同的序列互补的序列。

84、在一个实施方案中，第二衔接子对包含：

85、含有根据caagcagaagacggcatacgagat(seq id no:32)的序列的第一寡核苷酸，和含有不包含序列atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的超过5、10、15或20个碱基的序列，或不包含序列atctcgtatgccgtcttctgcttg(seq id no:30)的全部24个碱基的序列的第二寡核苷酸；或含有根据aatgatacggcgaccaccga(seq id no:34)的序列的第一寡核苷酸，和含有不包含序列tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的超过5、10或15个碱基的序列，或不包含序列tcggtggtcgccgtatcatt(seq id no:31)的全部20个碱基的序列的第二寡核苷酸。

86、第一衔接子对的第一和/或第二寡核苷酸可包含3’和/或5’保护性特征；和/或其中第二衔接子对的第一和/或第二寡核苷酸可包含3’和/或5’保护性特征。在一个实施方案中，由于第一衔接子的3’修饰的存在，第二衔接子不能连接至第一衔接子。

87、可连接至5’末端的第二衔接子的寡核苷酸可包含与固定引物的5、10、15、20、21、24或更多个碱基相同的序列。

88、在一个实施方案中，方法进一步包括使多个核酸变性以形成多个单链核酸。在一个实施方案中，方法进一步包括在适于固定引物与互补核酸杂交的条件下使多个核酸与包含固定引物的基底接触。在一个实施方案中，方法进一步包括获得与基底杂交的任何核酸的序列信息。

89、在一个实施方案中，包含多个核酸的样品是gdna。在一个实施方案中，步骤以a)、b)、c)和随后d)的顺序进行。在另一实施方案中，步骤以c)、d)、a)和随后b)的顺序进行。

90、在本发明的另一方面，提供了用于鉴定核酸样品，诸如gdna样品中的dna双链断裂(dsb)的双链衔接子，其包含：第一寡核苷酸链，其不包含序列ggaaagcggaggcgtagtggtt(seq id no:36)的超过5、10、15、20个碱基的序列，或不包含序列ggaaagcggaggcgtagtggtt(seq id no:36)的全部22个碱基；和第二寡核苷酸，其包含使得所述寡核苷酸能够连接至双链核酸的一条链并包含根据aacccactacgcctccgctttcc(seq id no:40)的序列的3’结合特征；并且其中所述寡核苷酸的一种或两种分别包含3’和/或5’保护性特征。