具有启动受体的工程化免疫细胞的制作方法

背景技术：

1、癌症是一种以细胞不受控制的生长为特征的疾病。已经尝试了许多治疗癌症的方法，包括药物和放射疗法。最近的癌症治疗试图利用人体自身的免疫细胞来攻击癌细胞。一种有前景的方法是使用从患者身上提取的t细胞，并通过对t细胞进行基因工程化来产生嵌合抗原受体或car，这种受体蛋白赋予t细胞新的靶向特定蛋白质的能力。这些受体是嵌合的，因为它们将抗原结合与t细胞激活功能结合到单个受体中。

2、使用这些car-t细胞的免疫疗法是很有前景的，因为经修饰的t细胞有可能识别癌细胞，从而更有效地靶向和摧毁它们。

3、在利用car对t细胞进行工程化后，将所得car-t细胞引入患者体内以攻击肿瘤细胞。car-t细胞可以源自患者自身血液中的t细胞(自体)或来自另一健康供体的t细胞(同种异体)。

4、car-t细胞一旦注入患者体内，它们就会与细胞上的靶向抗原接触。car-t细胞与抗原结合并被激活。抗原结合后，car t细胞可以呈指数增殖，启始肿瘤细胞因子的产生以及靶肿瘤细胞的杀伤。然而，基于car t细胞的免疫疗法仍然存在一些问题和局限性。一些car t细胞可能与表达低水平靶抗原的正常细胞接合，导致脱靶毒性。

5、此外，使用病毒载体很难将大基因构建体插入特定基因靶标中，这是免疫细胞工程化中的一个已知瓶颈。

技术实现思路

1、在一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一个以非病毒方式插入所述细胞的基因组的靶区中的dna模板，其中所述dna模板的大小为大于或等于约5千碱基对(kb)。

2、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞不包含用于将所述dna模板引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。

3、在一些实施方案中，所述dna模板的大小为大于或等于约5.0kb、5.1kb、5.2kb、5.3kb、5.4kb、5.5kb、5.6kb、5.7kb、5.8kb、5.9kb、6.0kb、6.1kb、6.2kb、6.3kb、6.4kb、6.5kb、6.6kb、6.7kb、6.8kb、6.9kb、7.0kb、7.1kb、7.2kb、7.3kb、7.4kb、7.5kb、7.6kb、7.7kb、7.8kb、7.9kb、8.0kb、8.1kb、8.2kb、8.3kb、8.4kb、8.5kb、8.6kb、8.7kb、8.8kb、8.9kb、9.0kb、9.1kb、9.2kb、9.3kb、9.4kb、9.5kb、9.6kb、9.7kb、9.8kb.9.9kb、10.0kb或介于这些大小之间的任何dna模板大小。

4、在一些实施方案中，所述dna模板的大小为约5kb至约10kb、约5kb至约9kb、约5kb至约8kb、约5kb至约7kb、约5kb至约6kb、约kb 6至约10kb、约6kb至约9kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb、约7kb至约10kb、约7kb至约9kb、约7kb至约8kb、约8kb至约10kb、约8kb至约9kb，或约9kb至约10kb。

5、在一些实施方案中，所述dna模板是双链dna模板或单链dna模板。

6、在一些实施方案中，所述dna模板是线状dna模板或环状dna模板，任选地其中所述环状dna模板是质粒。

7、在一些实施方案中，所述dna模板的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。

8、在一些实施方案中，所述细胞的基因组的所述靶区是t细胞受体α恒定(trac)基因座或基因组安全港(gsh)。

9、在一些实施方案中，所述dna模板包含异源序列。

10、在一些实施方案中，所述dna模板包含基因。

11、在一些实施方案中，所述dna模板包含含有转录因子的启动受体。

12、在一些实施方案中，所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)。

13、在一些实施方案中，所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)和包含转录因子的启动受体。

14、在一些实施方案中，所述dna模板包含可操作地连接至所述嵌合抗原受体的诱导型启动子。

15、在一些实施方案中，所述dna模板还包含可操作地连接至所述启动受体的组成型启动子。

16、在一些实施方案中，所述dna模板还包含可操作地连接至所述嵌合抗原受体的诱导型启动子和可操作地连接至所述启动受体的组成型启动子。

17、在一些实施方案中，所述dna模板在5’至3’方向上包含：所述诱导型启动子；所述嵌合抗原受体；所述组成型启动子；和所述启动受体。

18、在一些实施方案中，所述dna模板在5’至3’方向上包含：所述组成型启动子；所述启动受体；所述诱导型启动子；和所述嵌合抗原受体。

19、在一些实施方案中，所述dna模板还包含自切除2a肽(p2a)。

20、在一些实施方案中，所述p2a核酸处于所述dna模板的3’端。

21、在一些实施方案中，所述dna模板还包含土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件(wpre)。

22、在一些实施方案中，所述wpre处于编码所述car的核酸的3’端和编码所述启动受体的核酸的5’端，或者其中所述wpre处于编码所述启动受体的核酸的3’端和编码所述car的核酸的5’端。

23、在一些实施方案中，所述启动受体在n末端至c末端方向上包含：对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；和包含人或人源化转录效应子的细胞内结构域，其中抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述配体诱导型蛋白水解裂解位点处的裂解，从而释放所述细胞内结构域。

24、在一些实施方案中，所述启动受体还包含定位于所述跨膜结构域与所述细胞内结构域之间的近膜结构域(jmd)。

25、在一些实施方案中，所述转录因子结合至所述诱导型启动子并诱导所述car的表达。

26、在一些实施方案中，所述car从n末端至c末端包含：对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域；细胞内共刺激结构域；和细胞内激活结构域。

27、在一些实施方案中，所述启动受体和所述car结合不同的抗原。

28、在一些实施方案中，所述启动受体和所述car结合相同的抗原。

29、在一些实施方案中，所述免疫细胞是原代人免疫细胞。

30、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是自体免疫细胞。

31、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是自然杀伤(nk)细胞、t细胞、cd8+t细胞、cd4+t细胞、原代t细胞或t细胞祖细胞。

32、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代t细胞。

33、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代人t细胞。

34、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是无病毒的。

35、在另一方面，本文提供了包含多个本文公开的原代免疫细胞的细胞群体。

36、在另一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一个插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中的dna模板，其中所述dna模板的大小为大于或等于5千碱基对，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述dna模板引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。

37、在另一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一个插入所述原代免疫细胞的基因组的靶区中的dna模板，所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)和包含转录因子的启动受体，其中所述dna模板的大小为大于或等于5千碱基对，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述dna模板引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。

38、在另一方面，本文提供了活的无病毒的原代细胞，所述原代细胞包含核糖核蛋白复合物(rnp)-dna模板复合物，其中所述rnp包含核酸酶结构域和指导rna，其中所述dna模板的大小为大于或等于5千碱基核苷酸的大小，并且其中所述dna模板的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。

39、在另一方面，本文提供了活的无病毒的原代细胞，所述原代细胞包含核糖核蛋白复合物(rnp)-dna模板复合物，其中所述rnp包含核酸酶结构域和指导rna，其中所述dna模板的大小为大于或等于5千碱基核苷酸的大小，其中所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)和包含转录因子的启动受体，并且其中所述dna模板的5’端和3’端包含与所述原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。

40、在另一方面，本文提供了治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用原代免疫细胞。

41、在一些实施方案中，所述疾病是癌症。

42、在另一方面，本文提供了非病毒载体，所述非病毒载体包含dna模板，其中所述dna模板的大小为大于或等于5千碱基核苷酸，并且其中所述dna模板的5’端和3’端包含与原代细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列。

43、在一些实施方案中，所述dna模板的大小为大于或等于约5.0kb、5.1kb、5.2kb、5.3kb、5.4kb、5.5kb、5.6kb、5.7kb、5.8kb、5.9kb、6.0kb、6.1kb、6.2kb、6.3kb、6.4kb、6.5kb、6.6kb、6.7kb、6.8kb、6.9kb、7.0kb、7.1kb、7.2kb、7.3kb、7.4kb、7.5kb、7.6kb、7.7kb、7.8kb、7.9kb、8.0kb、8.1kb、8.2kb、8.3kb、8.4kb、8.5kb、8.6kb、8.7kb、8.8kb、8.9kb、9.0kb、9.1kb、9.2kb、9.3kb、9.4kb、9.5kb、9.6kb、9.7kb、9.8kb.9.9kb、10.0kb或介于这些大小之间的任何dna模板大小。

44、在一些实施方案中，所述dna模板的大小为约5kb至约10kb、约5kb至约9kb、约5kb至约8kb、约5kb至约7kb、约5kb至约6kb、约kb 6至约10kb、约6kb至约9kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb、约7kb至约10kb、约7kb至约9kb、约7kb至约8kb、约8kb至约10kb、约8kb至约9kb，或约9kb至约10kb。

45、在一些实施方案中，所述细胞的基因组的所述靶区是t细胞受体α恒定(trac)基因座或基因组安全港(gsh)。

46、在一些实施方案中，所述dna模板包含异源序列。

47、在一些实施方案中，所述dna模板包含基因。

48、在一些实施方案中，所述dna模板包含含有转录因子的启动受体。

49、在一些实施方案中，所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)。

50、在一些实施方案中，所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)和包含转录因子的启动受体。

51、在一些实施方案中，所述dna模板包含可操作地连接至所述嵌合抗原受体的诱导型启动子。

52、在一些实施方案中，所述dna模板还包含可操作地连接至所述启动受体的组成型启动子。

53、在一些实施方案中，所述dna模板还包含可操作地连接至所述嵌合抗原受体的诱导型启动子和可操作地连接至所述启动受体的组成型启动子。

54、在一些实施方案中，所述dna模板在5’至3’方向上包含：所述诱导型启动子；所述嵌合抗原受体；所述组成型启动子；和所述启动受体。

55、在一些实施方案中，所述dna模板在5’至3’方向上包含：所述组成型启动子；所述启动受体；所述诱导型启动子；和所述嵌合抗原受体。

56、在一些实施方案中，所述dna模板还包含自切除2a肽(p2a)。

57、在一些实施方案中，所述p2a处于所述dna模板的3’端。

58、在一些实施方案中，所述dna模板还包含土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件(wpre)。

59、在一些实施方案中，所述启动受体在n末端至c末端方向上包含：对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；和包含人或人源化转录效应子的细胞内结构域，其中抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述配体诱导型蛋白水解裂解位点处的裂解，从而释放所述细胞内结构域。

60、在一些实施方案中，所述启动受体还包含定位于所述跨膜结构域与所述细胞内结构域之间的近膜结构域(jmd)。

61、在一些实施方案中，所述转录因子结合至所述诱导型启动子并诱导所述car的表达。

62、在一些实施方案中，所述car从n末端至c末端包含：对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域；细胞内共刺激结构域；和细胞内激活结构域。

63、在一些实施方案中，所述启动受体和所述car结合不同的抗原。

64、在一些实施方案中，所述启动受体和所述car结合相同的抗原。

65、在另一方面，本文提供了编辑原代免疫细胞的方法，所述方法包括：提供核糖核蛋白复合物(rnp)-dna模板复合物，其中所述rnp包含核酸酶结构域和指导rna，其中所述dna模板的大小为大于或等于5千碱基核苷酸的大小，并且其中所述dna模板的5’端和3’端包含与所述原代免疫细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列；以非病毒方式将所述rnp-dna模板复合物引入所述原代免疫细胞中，其中所述指导rna与所述原代免疫细胞的基因组的靶区特异性地杂交，并且其中所述核酸酶结构域使所述靶区裂解以产生在所述原代免疫细胞的基因组中的所述插入位点；以及通过将所述dna模板插入所述原代免疫细胞的基因组中的所述插入位点中来编辑所述原代免疫细胞。

66、在一些实施方案中，以非病毒方式引入包括电穿孔。

67、在一些实施方案中，所述核酸酶结构域包含crispr相关核酸内切酶(cas)，任选地是cas9核酸酶。

68、在一些实施方案中，所述dna模板的大小为大于或等于约5.0kb、5.1kb、5.2kb、5.3kb、5.4kb、5.5kb、5.6kb、5.7kb、5.8kb、5.9kb、6.0kb、6.1kb、6.2kb、6.3kb、6.4kb、6.5kb、6.6kb、6.7kb、6.8kb、6.9kb、7.0kb、7.1kb、7.2kb、7.3kb、7.4kb、7.5kb、7.6kb、7.7kb、7.8kb、7.9kb、8.0kb、8.1kb、8.2kb、8.3kb、8.4kb、8.5kb、8.6kb、8.7kb、8.8kb、8.9kb、9.0kb、9.1kb、9.2kb、9.3kb、9.4kb、9.5kb、9.6kb、9.7kb、9.8kb.9.9kb、10.0kb或介于这些大小之间的任何dna模板大小。

69、在一些实施方案中，所述dna模板的大小为约5kb至约10kb、约5kb至约9kb、约5kb至约8kb、约5kb至约7kb、约5kb至约6kb、约kb 6至约10kb、约6kb至约9kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb、约7kb至约10kb、约7kb至约9kb、约7kb至约8kb、约8kb至约10kb、约8kb至约9kb，或约9kb至约10kb。

70、在一些实施方案中，所述细胞的基因组的所述靶区是t细胞受体α恒定(trac)基因座或基因组安全港(gsh)。

71、在一些实施方案中，所述dna模板是双链dna模板或单链dna模板。

72、在一些实施方案中，所述dna模板是线状dna模板或环状dna模板，任选地其中所述环状dna模板是质粒。

73、在一些实施方案中，所述dna模板包含异源序列。

74、在一些实施方案中，所述dna模板包含基因。

75、在一些实施方案中，所述dna模板包含含有转录因子的启动受体。

76、在一些实施方案中，所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)。

77、在一些实施方案中，所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)和包含转录因子的启动受体。

78、在一些实施方案中，所述dna模板包含可操作地连接至所述嵌合抗原受体的诱导型启动子。

79、在一些实施方案中，所述dna模板还包含可操作地连接至所述启动受体的组成型启动子。

80、在一些实施方案中，所述dna模板还包含可操作地连接至所述嵌合抗原受体的诱导型启动子和可操作地连接至所述启动受体的组成型启动子。

81、在一些实施方案中，所述dna模板在5’至3’方向上包含：所述诱导型启动子；所述嵌合抗原受体；所述组成型启动子；和所述启动受体。

82、在一些实施方案中，所述dna模板在5’至3’方向上包含：所述组成型启动子；所述启动受体；所述诱导型启动子；和所述嵌合抗原受体。

83、在一些实施方案中，所述dna模板还包含自切除2a肽(p2a)。

84、在一些实施方案中，所述p2a核酸处于所述dna模板的3’端。

85、在一些实施方案中，所述dna模板还包含土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件(wpre)。

86、在一些实施方案中，所述wpre处于编码所述car的核酸的3’端和编码所述启动受体的核酸的5’端，或者其中所述wpre处于编码所述启动受体的核酸的3’端和编码所述car的核酸的5’端。

87、在一些实施方案中，所述启动受体在n末端至c末端方向上包含：对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；和包含人或人源化转录效应子的细胞内结构域，其中抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述配体诱导型蛋白水解裂解位点处的裂解，从而释放所述细胞内结构域。

88、在一些实施方案中，所述启动受体还包含定位于所述跨膜结构域与所述细胞内结构域之间的近膜结构域(jmd)。

89、在一些实施方案中，所述转录因子结合至所述诱导型启动子并诱导所述car的表达。

90、在一些实施方案中，所述car从n末端至c末端包含：对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域；细胞内共刺激结构域；和细胞内激活结构域。

91、在一些实施方案中，所述启动受体和所述car结合不同的抗原。

92、在一些实施方案中，所述启动受体和所述car结合相同的抗原。

93、在一些实施方案中，所述免疫细胞是原代人免疫细胞。

94、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是自体免疫细胞。

95、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是自然杀伤(nk)细胞、t细胞、cd8+t细胞、cd4+t细胞、原代t细胞或t细胞祖细胞。

96、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代t细胞。

97、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代人t细胞。

98、在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是无病毒的。

99、在一些实施方案中，所述方法还包括从患者获得所述免疫细胞以及在体外引入所述质粒。

100、在另一方面，本文提供了编辑原代免疫细胞的方法，所述方法包括：提供核糖核蛋白复合物(rnp)-dna模板复合物，其中所述rnp包含核酸酶结构域和指导rna，其中所述dna模板的大小为大于或等于5千碱基核苷酸的大小，其中所述dna模板包含嵌合抗原受体(car)和包含转录因子的启动受体，并且其中所述dna模板的5’端和3’端包含与所述原代免疫细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列；以非病毒方式将所述rnp-dna模板复合物引入所述原代免疫细胞中，其中所述指导rna与所述原代免疫细胞的基因组的靶区特异性地杂交，并且其中所述核酸酶结构域使所述靶区裂解以产生在所述原代免疫细胞的基因组中的所述插入位点；以及通过将所述dna模板插入所述原代免疫细胞的基因组中的所述插入位点中来编辑所述原代免疫细胞。