枯草杆菌中的病毒载体质粒生产的制作方法

本公开文本提供生产病毒载体质粒的方法。本公开文本还提供这样生产的病毒载体质粒及包含其的制剂。本公开文本也提供包含病毒载体质粒的枯草杆菌(haybacillus)。进而，本公开文本提供由病毒载体质粒生产的病毒载体。

背景技术：

1、为了基因治疗及疫苗疗法等，已开发了腺病毒载体(专利文献1)等各种病毒载体。

2、为了制备病毒载体，通常需要在生产细胞中导入病毒载体质粒。因此，需要进行病毒载体质粒的合成·构建。所设计的病毒载体质粒在大肠杆菌等中进行合成·构建的情况较多，并未在枯草杆菌中合成·构建。

3、现有技术文献

4、专利文献

5、专利文献1：国际公开第2001/090392号

技术实现思路

1、用于解决课题的手段

2、本技术的发明人发现在枯草杆菌中能够生产病毒载体质粒。基于该见解，本公开文本提供在枯草杆菌中制作病毒载体质粒的方法、及这样制作的病毒载体质粒。另外，本公开文本也提供包含病毒载体质粒的枯草杆菌、及由病毒载体质粒生产的病毒载体。

3、因此，本发明提供以下方案。

4、(项目a1)

5、制作病毒载体质粒的方法，所述方法包括下述步骤：

6、步骤a)，将包含用于生产病毒载体的核酸序列的核酸导入宿主细胞中，在前述宿主细胞中形成质粒；和

7、步骤b)，将包含前述质粒的宿主细胞配置于前述质粒进行扩增的条件下。

8、(项目a2)

9、制作病毒载体质粒的方法，所述病毒载体质粒具有能在枯草杆菌内被复制的序列，所述方法包括下述步骤：

10、将包含具有能在枯草杆菌内被复制的序列的、用于生产病毒载体的核酸序列的核酸导入宿主细胞中，在前述宿主细胞中形成质粒。

11、(项目a3)

12、制作病毒载体质粒的方法，所述病毒载体质粒具有能在枯草杆菌内被复制的序列，所述方法包括下述步骤：

13、将包含前述质粒的宿主细胞配置于前述质粒进行扩增的条件下。

14、(项目a4)

15、前述项目中的任一项的方法，其中，将前述核酸导入前述宿主细胞中的步骤包括使感受态的前述宿主细胞与前述核酸接触。

16、(项目a5)

17、前述项目中的任一项的方法，其中，前述核酸为具有串联重复的核酸序列的非环状核酸。

18、(项目a6)

19、前述项目中的任一项的方法，其中，前述核酸或质粒包含所期望的基因的核酸序列。

20、(项目a7)

21、前述项目中的任一项的方法，其还包括将2～120个单位核酸集聚从而制作前述核酸的步骤。

22、(项目a8)

23、前述项目中的任一项的方法，其还包括将5～80个单位核酸集聚从而制作前述核酸的步骤。

24、(项目a9)

25、前述项目中的任一项的方法，其还包括将10～60个单位核酸集聚从而制作前述核酸的步骤。

26、(项目a10)

27、前述项目中的任一项的方法，其中，前述病毒为选自由α病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、流行性感冒病毒、水疱性口炎病毒、冠状病毒、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、狂犬病病毒、仙台病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus)、腺病毒、呼肠弧病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、及新城疫病毒组成的组中的病毒。

28、(项目a11)

29、前述项目中的任一项的方法，其中，前述病毒为腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、或仙台病毒。

30、(项目a12)

31、前述项目中的任一项的方法，其中，前述病毒为腺相关病毒或慢病毒。

32、(项目a13)

33、前述项目中的任一项的方法，其中，前述病毒为腺相关病毒。

34、(项目a14)

35、前述项目中的任一项的方法，其中，前述质粒不包含前述病毒的全基因组中的至少一部分基因的序列。

36、(项目a15)

37、前述项目中的任一项的方法，其中，前述质粒包含至少一种核酸，所述至少一种核酸包含：

38、在枯草杆菌中促进质粒复制的核酸序列；和

39、构成病毒所必需的核酸序列。

40、(项目a16)

41、前述项目中的任一项的方法，其中，前述构成病毒所必需的核酸序列为约10kb以上。

42、(项目a17)

43、前述项目中的任一项的方法，其中，前述构成病毒所必需的核酸序列包含前述病毒的2个末端重复序列及其他部分，前述其他部分位于被前述2个末端重复序列夹持的区域之外。

44、(项目a18)

45、前述项目中的任一项的方法，其中，前述构成病毒所必需的核酸序列包含：

46、编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列；

47、编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列；

48、前述病毒的2个末端重复序列；和

49、辅助基因(helper gene)。

50、(项目a19)

51、前述项目中的任一项的方法，其中，前述末端重复序列为来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者的末端反向重复序列(itr)。

52、(项目a20)

53、前述项目中的任一项的方法，其中，在5’itr与3’itr之间从上游起包含启动子、所期望的基因及终止子。

54、(项目a21)

55、前述项目中的任一项的方法，其中，前述辅助基因包含e1a、e1b、e2a、e4及va中的至少一者。

56、(项目a22)

57、前述项目中的任一项的方法，其中，前述辅助基因包含e2a、e4及va。

58、(项目a23)

59、前述项目中的任一项的方法，其中，前述辅助基因各自来源于腺病毒的血清型1～52及其修饰体中的任一者。

60、(项目a24)

61、前述项目中的任一项的方法，其中，编码对前述病毒的基因组进行包装、转录及复制的蛋白质的核酸序列包含rep。

62、(项目a25)

63、前述项目中的任一项的方法，其中，前述rep来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者。

64、(项目a26)

65、前述项目中的任一项的方法，其中，编码前述病毒的衣壳蛋白的核酸序列包含cap。

66、(项目a27)

67、前述项目中的任一项的方法，其中，前述cap来源于腺相关病毒的血清型1～12及其修饰体中的任一者。

68、(项目a28)

69、前述项目中的任一项的方法，其特征在于，前述质粒使得能够在将前述质粒单独导入后的生产细胞中进行病毒载体的生产。

70、(项目a29)

71、前述项目中的任一项的方法，其还包括对经扩增的前述质粒进行纯化的步骤。

72、(项目a30)

73、前述项目中的任一项的方法，其中，前述宿主细胞为选自由大肠杆菌、枯草杆菌及酵母组成的组中的生物的细胞。

74、(项目a31)

75、前述项目中的任一项的方法，其中，前述宿主细胞为枯草杆菌的细胞。

76、(项目a32)

77、前述项目中的任一项的方法，其中，前述宿主细胞在a)及b)中为不同或相同种类的细胞。

78、(项目a33)

79、前述项目中的任一项的方法，其中，a)的前述宿主细胞为枯草杆菌的细胞。

80、(项目a34)

81、前述项目中的任一项的方法，其中，a)的前述宿主细胞与b)的前述宿主细胞不同，所述方法包括将a)中所生成的前述质粒导入b)的前述宿主细胞中的工序。

82、(项目a35)

83、前述项目中的任一项的方法，其中，a)的前述宿主细胞为枯草杆菌的细胞，b)的前述宿主细胞为大肠杆菌的细胞，所述方法包括将a)中所生成的前述质粒导入b)的前述宿主细胞中的工序。

84、(项目a36)

85、前述项目中的任一项的方法，其中，前述宿主细胞不同，并且b)中的宿主细胞为枯草杆菌的细胞。

86、(项目a37)

87、质粒，其是利用前述项目中的任一项的方法生产的。

88、(项目a38)

89、含有质粒的组合物，所述质粒是利用前述项目中的任一项的方法生产的。

90、(项目a39)

91、前述项目中的任一项的含有质粒的组合物，其中，所含的内毒素为100eu/ml以下。

92、(项目a40)

93、前述项目中的任一项的含有质粒的组合物，其中，质粒的ccc(covalently closedcircular，共价闭合环状)纯度为80％以上。

94、(项目a41)

95、制作病毒载体的方法，其包括下述步骤：

96、利用前述项目中的任一项的方法制作质粒的步骤；和

97、将前述质粒导入生产细胞中而形成病毒载体的步骤。

98、(项目a42)

99、前述项目中的任一项的方法，其中，将前述质粒导入生产细胞中的步骤包括将单一的前述质粒导入生产细胞中。

100、(项目a43)

101、前述项目中的任一项的方法，其中，前述质粒中包含的核酸的至少一部分被整合到前述生产细胞的染色体中。

102、(项目a44)

103、病毒载体，其是利用前述项目中的任一项的方法生产的。

104、(项目a45)

105、含有病毒载体的组合物，所述病毒载体是利用前述项目中的任一项的方法生产的。

106、(项目a46)

107、前述项目中的任一项的含有病毒载体的组合物，其中，全部病毒粒子中的未搭载核酸的病毒粒子的比例为65％以下。

108、(项目a47)

109、前述项目中的任一项的组合物，其中，全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于前述质粒的核酸的病毒载体粒子为2％以下。

110、(项目1)

111、制作病毒载体质粒的方法，所述病毒载体质粒具有在枯草杆菌内进行扩增的序列，所述方法包括下述步骤：

112、将具有在枯草杆菌内进行扩增的序列的、包含用于生产病毒载体的核酸序列的核酸导入宿主细胞中，在前述宿主细胞中形成质粒。

113、(项目2)

114、对病毒载体质粒进行扩增的方法，所述病毒载体质粒具有在枯草杆菌内进行扩增的序列，所述方法包括下述步骤：

115、将包含前述质粒的宿主细胞配置于前述质粒进行扩增的条件下。

116、(项目3)

117、制作病毒载体质粒的方法，所述方法包括下述步骤：

118、步骤a)，将包含用于生产病毒载体的核酸序列的核酸导入宿主细胞中，在前述宿主细胞中形成质粒；和

119、步骤b)，将包含前述质粒的宿主细胞配置于前述质粒进行扩增的条件下。

120、(项目4)

121、前述项目中的任一项的方法，其中，将前述核酸导入前述宿主细胞中的步骤包括使感受态的前述宿主细胞与前述核酸接触。

122、(项目5)

123、前述项目中的任一项的方法，其中，前述核酸为具有串联重复的核酸序列的非环状核酸。

124、(项目6)

125、前述项目中的任一项的方法，其中，前述核酸或质粒包含所期望的基因的核酸序列。

126、(项目7)

127、前述项目中的任一项的方法，其还包括将2～100个单位核酸集聚从而制作前述核酸的步骤。

128、(项目8)

129、前述项目中的任一项的方法，其中，前述病毒为选自由α病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、流行性感冒病毒、水疱性口炎病毒、冠状病毒、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、狂犬病病毒、仙台病毒、腺相关病毒、腺病毒、呼肠弧病毒、柯萨奇病毒、及新城疫病毒组成的组中的病毒。

130、(项目9)

131、前述项目中的任一项的质粒，其中，前述病毒为腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或仙台病毒。

132、(项目10)

133、前述项目中的任一项的方法，其中，前述质粒包含至少一种核酸，所述至少一种核酸包含：

134、在枯草杆菌中促进质粒扩增的核酸序列；和

135、构成病毒所必需的核酸序列。

136、(项目11)

137、前述项目中的任一项的方法，其特征在于，前述质粒使得能够在将前述质粒单独导入后的生产细胞中进行病毒载体的生产。

138、(项目12)

139、前述项目中的任一项的方法，其还包括对经扩增的前述质粒进行纯化的步骤。

140、(项目13)

141、前述项目中的任一项的方法，其中，前述宿主细胞选自由大肠杆菌、枯草杆菌、酵母组成的组。

142、(项目14)

143、前述项目中的任一项的方法，其中，前述宿主细胞为枯草杆菌。

144、(项目15)

145、前述项目中的任一项的方法，其中，前述宿主细胞在a)及b)中为不同或相同种类。

146、(项目16)

147、前述项目中的任一项的方法，其中，前述宿主细胞不同，并且b)中的宿主细胞为枯草杆菌。

148、(项目17)

149、质粒，其是利用前述项目中的任一项的方法生产的。

150、(项目18)

151、含有质粒的组合物，所述质粒是利用前述项目中的任一项的方法生产的。

152、(项目19)

153、前述项目中的任一项的含有质粒的组合物，其中，所含的内毒素为100eu/ml以下。

154、(项目20)

155、前述项目中的任一项的含有质粒的组合物，其中，质粒的ccc(共价闭合环状)纯度为80％以上。

156、(项目21)

157、制作病毒载体的方法，其包括下述步骤：

158、利用前述项目中的任一项的方法制作质粒的步骤；和

159、将前述质粒导入生产细胞中而形成病毒载体的步骤。

160、(项目22)

161、前述项目中的任一项的方法，其中，将前述质粒导入生产细胞中的步骤包括将单一的前述质粒导入包装细胞中。

162、(项目23)

163、病毒载体，其是利用前述项目中的任一项的方法生产的。

164、(项目24)

165、含有病毒载体的组合物，所述病毒载体是利用前述项目中的任一项的方法生产的。

166、(项目25)

167、前述项目中的任一项的含有病毒载体的组合物，其中，全部病毒粒子中的未搭载核酸的病毒粒子的比例为65％以下。

168、(项目26)

169、前述项目中的任一项的组合物，其中，全部病毒载体粒子中，包含除所期望的核酸以外的来源于前述质粒的核酸的病毒载体粒子为2％以下。

170、本发明中，上述的1个或多个特征意味着，除了明确示出的组合之外，还可进一步组合来提供。关于本发明的更进一步的实施方式及优点，本领域技术人员只要根据需要阅读以下的详细说明并加以理解即可获知。

171、发明效果

172、本公开文本提供用于制作病毒载体质粒的新的体系。基于该体系，可获得内毒素的减少等益处。