用于分析抗原结合分子的方法和组合物与流程

本公开在一些方面涉及用于分析抗原结合分子的方法和组合物，该抗原结合分子包括分泌型抗原受体，例如分泌型抗体。

背景技术：

1、用于发现抗体的方法通常依赖于通量较低的永生化(例如，通过将产生第一抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤)、引起抗体分泌的培养方法，以及对小(通常为三个或更少)抗原组的检测。杂交瘤可以在培养物中生长，每种培养物均从一个活杂交瘤细胞开始培养，所产生的培养物中的每一种均由遗传上相同的杂交瘤组成，这些遗传上相同的杂交瘤在每种培养物中产生一种抗体(单克隆)，而不是不同抗体的混合物(多克隆)。与检测试剂(诸如荧光团)偶联的抗原诱饵可以用于检测克隆扩增细胞中的抗体-抗原相互作用。然而，对抗体分泌(例如，来自原代细胞的抗体分泌)进行单细胞分析仍然充满挑战。需要有效地分析分泌型抗体和抗体分泌细胞的方法，特别是在抗体分泌细胞的异质群体中进行高通量筛选的方法。本公开解决了这些和其他需求。

技术实现思路

1、本公开提供了用于对单细胞分析物进行检测和测量的方法和系统，其包括可以与来自单细胞(例如，抗体产生细胞)的分泌型分析物(例如，抗体)偶联的加核苷酸条形码的多肽。本文所述的方法和系统可以包括执行下一代测序，以测量和分析可以从单细胞分泌并且/或者存在于单细胞中的分析物分子(例如，抗体、细胞因子、mrna等)。与其他细胞分析方法相比，本文所公开的方法和系统可以增加能够从单细胞测量的不同分子或分析物的数量。此外，本发明所公开的方法和系统可以允许同时测量多种细胞分子(例如，分泌型分子和/或细胞内分子)，诸如分泌型分析物(例如，抗体)、mrna、细胞表面蛋白、抗原受体序列和抗原结合特异性等。

2、在一些实施方案中，本文提供了用于分析来自单细胞(例如，来自受试者的异质细胞群体中的原代细胞)的分泌型分析物的方法和组合物，该分泌型分析物诸如抗原结合分子，例如抗体，该分析例如使用捕获剂和/或细胞珠粒来将该分泌型分析物与分泌它的细胞相关联。在一些实施方案中，来自细胞(例如，浆细胞)的分泌型抗体可以束缚至该细胞的表面(例如，经由细胞表面双特异性抗体捕获剂)并且/或者束缚至包封该细胞的基质(例如，细胞珠粒)，然后使用基于核酸的加条形码的抗原来筛选多种抗原特异性。这种方法能够与抗原/表位的大阵列相容，并且直接将抗体的重链和/或轻链与这些抗原/表位配对，使得具有感兴趣的抗原/表位特异性的抗体能够被快速克隆并转化为适于进一步治疗性开发和检测的形式。

3、在一些方面，本文提供了用于分析来自多个细胞中的单细胞的分泌型分析物的方法和组合物，其中该分泌型分析物包括抗原结合分子，诸如分泌型抗原受体，例如分泌型抗体。在一些方面，对该单细胞的分析还包括分析一种或多种其他分析物，包括蛋白质分析物(例如，一种或多种细胞表面蛋白分析物(诸如受体和/或配体)，以及/或者一种或多种其他分泌型分析物(诸如细胞因子))、核酸分析物(例如，基因组dna和/或rna(诸如mrna))、碳水化合物分析物，以及/或者脂质分析物。

4、本文在一个方面提供了一种用于单细胞分析的方法，包括：(a)将细胞(例如，抗体分泌细胞)与包含报告核酸分子的报告剂接触，以提供标记细胞，其中该报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，其中该标记细胞包括与该细胞的表面偶联的复合物，并且其中该复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌型抗原结合分子(例如，分泌型抗原受体，诸如分泌型抗体或其抗原结合片段)，和(iii)报告剂；(b)将该标记细胞分隔在分区中，其中该分区包含多个条形码核酸分子，这些条形码核酸分子包含多个分区条形码序列(例如，其可以是或包括共同的分区特异性条形码序列)；以及(c)在该分区中，从多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中该加条形码的核酸分子包含报告序列或其互补序列，以及分区条形码序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)或其互补序列。

5、在任一项前述实施方案中，细胞(例如，抗体分泌细胞)可以属于b细胞谱系，例如浆细胞。

6、在任一项前述实施方案中，捕获剂可以被配置为与细胞表面分子偶联。

7、在任一项前述实施方案中，所述细胞表面分子可以是细胞表面蛋白。

8、在任一项前述实施方案中，捕获剂可以被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。

9、在任一项前述实施方案中，所述捕获剂可以被配置为与细胞表面蛋白和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。

10、在任一项前述实施方案中，所述捕获剂可以是第一抗体结合剂。

11、在任一项前述实施方案中，报告剂可以被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。

12、在任一项前述实施方案中，所述报告剂可以是第二抗体结合剂。

13、在任一项前述实施方案中，所述报告核酸分子还可以包含被配置为与条形码核酸分子偶联的序列。

14、在任一项前述实施方案中，所述标记细胞还可以包含第二报告剂，该第二报告剂包括第二报告核酸分子。

15、在任一项前述实施方案中，所述第二报告剂可以被配置为与该细胞的第二细胞表面蛋白偶联。

16、在任一项前述实施方案中，所述第二报告核酸分子可以包含对应于第二报告剂的第二报告序列。

17、在任一项前述实施方案中，该分区还可以包括多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子。多个第二条形码核酸分子中的这一个第二条形码核酸分子可以包含共同的分区特异性条形码序列。

18、在任一项前述实施方案中，所述第二报告核酸分子可以包含被配置为与第二条形码核酸分子偶联的第二序列。

19、在任一项前述实施方案中，步骤(c)还可以包括从多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子和第二报告核酸分子产生第二加条形码的核酸分子，其中该第二加条形码的核酸分子可以包含来自第二报告核酸分子的序列(例如，第二报告序列)，以及来自第二条形码核酸分子的序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)，或者它们的互补序列。

20、在任一项前述实施方案中，所述标记细胞还可以包含多种核酸分析物，其中所述多种核酸分析物中的一种核酸分析物可以包含核酸分析物序列。

21、在任一项前述实施方案中，该分区还可以包括多个第三条形码核酸分子。多个第三条形码核酸分子可以包含共同的分区特异性条形码序列。

22、在任一项前述实施方案中，所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子可以包含被配置为与该核酸分析物序列偶联的第三序列。

23、在任一项前述实施方案中，步骤(c)还可以包括从多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子和核酸分析物产生第三加条形码的核酸分子，其中该第三加条形码的核酸分子可以包含来自核酸分析物的序列，以及来自第三条形码核酸分子的序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)，或者它们的互补序列。

24、在任一项前述实施方案中，所述分区可以包括其中包含多个条形码核酸分子的支持物。

25、在任一项前述实施方案中，所述支持物可以是珠粒。

26、在任一项前述实施方案中，所述珠粒可以是凝胶珠粒。

27、在任一项前述实施方案中，所述多个条形码核酸分子能够可释放地附接到该支持物。

28、在任一项前述实施方案中，该分区可以来自多个分区。

29、在任一项前述实施方案中，该分区可以是液滴或微孔。

30、在另一个方面，本文提供了一种单细胞分析方法，包括：(a)将细胞珠粒与包含报告核酸分子的报告剂接触，以提供标记细胞珠粒，其中该细胞珠粒在基质中包含细胞，例如抗体分泌细胞，其中该报告核酸分子包含对应于报告剂的报告序列，其中该标记细胞珠粒在该细胞珠粒之中或之上包含复合物，并且其中该复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌型抗体或其抗原结合片段，和(iii)报告剂；(b)将该标记细胞珠粒分隔在分区中，其中该分区包含多个条形码核酸分子，这些条形码核酸分子包含多个分区条形码序列(例如，其可以是或包括共同的分区特异性条形码序列)；以及(c)在该分区中，从多个条形码核酸分子中的一个条形码核酸分子和报告核酸分子产生加条形码的核酸分子，其中该加条形码的核酸分子包含报告序列或其互补序列，以及分区条形码序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)或其互补序列。

31、在任一项前述实施方案中，细胞(例如，抗体分泌细胞)可以属于b细胞谱系，例如浆细胞。

32、在任一项前述实施方案中，捕获剂可以被配置为与细胞珠粒的基质偶联。

33、在任一项前述实施方案中，所述基质可以是可降解的聚合物基质。

34、在任一项前述实施方案中，捕获剂可以被配置为与分泌型抗体或其抗原结合片段偶联。

35、在任一项前述实施方案中，所述捕获剂可以被配置为与基质和所述分泌型抗体或其抗原结合片段两者偶联。

36、在任一项前述实施方案中，所述捕获剂可以是第一抗体结合剂。

37、在任一项前述实施方案中，报告剂可以被配置为与该抗体或其抗原结合片段偶联。

38、在任一项前述实施方案中，所述报告剂可以是第二抗体结合剂。

39、在任一项前述实施方案中，所述报告核酸分子还可以包含被配置为与条形码核酸分子偶联的序列。

40、在任一项前述实施方案中，所述细胞或所述标记细胞珠粒还可以包含第二报告剂，该第二报告剂包括第二报告核酸分子。

41、在任一项前述实施方案中，所述第二报告剂可以被配置为与该细胞的细胞表面蛋白偶联。

42、在任一项前述实施方案中，所述第二报告核酸分子可以包含对应于第二报告剂的第二报告序列。

43、在任一项前述实施方案中，该分区还可以包括多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子。多个第二条形码核酸分子中的这一个第二条形码核酸分子可以包含共同的分区特异性条形码序列。

44、在任一项前述实施方案中，所述第二报告核酸分子可以包含被配置为与第二条形码核酸分子偶联的第二序列。

45、在任一项前述实施方案中，步骤(c)还可以包括从多个第二条形码核酸分子中的一个第二条形码核酸分子和第二报告核酸分子产生第二加条形码的核酸分子，其中该第二加条形码的核酸分子可以包含来自第二报告核酸分子的序列(例如，第二报告序列)，以及来自第二条形码核酸分子的序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)，或者它们的互补序列。

46、在任一项前述实施方案中，所述细胞还可以包含多种核酸分析物，其中所述多种核酸分析物中的一种核酸分析物可以包含核酸分析物序列。

47、在任一项前述实施方案中，该分区还可以包括多个第三条形码核酸分子。多个第三条形码核酸分子可以包含共同的分区特异性条形码序列。

48、在任一项前述实施方案中，所述多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子可以包含被配置为与该核酸分析物序列偶联的第三序列。

49、在任一项前述实施方案中，步骤(c)还可以包括从多个第三条形码核酸分子中的一个第三条形码核酸分子和核酸分析物产生第三加条形码的核酸分子，其中该第三加条形码的核酸分子可以包含来自核酸分析物的序列，以及来自第三条形码核酸分子的序列(例如，共同的分区特异性条形码序列)，或者它们的互补序列。

50、在任一项前述实施方案中，所述分区可以包括其中包含多个条形码核酸分子的支持物。

51、在任一项前述实施方案中，所述支持物可以是珠粒。

52、在任一项前述实施方案中，所述珠粒可以是凝胶珠粒。

53、在任一项前述实施方案中，所述多个条形码核酸分子能够可释放地附接到该支持物。

54、在任一项前述实施方案中，该分区可以来自多个分区。

55、在任一项前述实施方案中，该分区可以是液滴或微孔。

56、在任一项前述实施方案中，这些方法还可以包括步骤(d)，其中对所产生的加条形码的核酸分子进行测序。如果对所产生的加条形码的核酸分子进行测序，则细胞(例如抗体分泌细胞)可以被分析为分泌能够结合报告剂的抗体，例如经由检测到报告序列。如果该方法进一步(d)对所产生的加条形码的核酸分子进行测序，则可以在对所产生的加条形码的核酸分子进行测序之前将其扩增。