信使RNA的大规模合成的制作方法

文档序号:34832588发布日期:2023-07-20 13:50阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种大规模产生包含全长信使rna(mrna)的组合物的方法,所述方法包括使用sp6rna聚合酶体外合成mrna,其中以单个批次合成至少1g mrna,并且其中所述组合物含有按重量计小于1%的双链rna(dsrna)。

2.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法不包括色谱步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其中在非变性条件下合成所述mrna。

4.一种产生包含全长信使rna(mrna)的组合物的方法,所述方法包括体外合成mrna,其中所述组合物含有按重量计小于1%的双链rna(dsrna),并且其中所述方法不包括色谱步骤。

5.一种产生包含全长信使rna(mrna)的组合物的方法,所述方法包括体外合成mrna,其中所述组合物含有按重量计小于1%的双链rna(dsrna),并且其中在非变性条件下合成所述mrna。

6.根据权利要求4或5所述的方法,其中以单个批次合成至少1g mrna。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中以所述单个批次合成至少10g、100g、250g、500g、1kg或10kg mrna。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述组合物含有按重量计小于0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的所述dsrna。

9.根据权利要求8所述的方法,其中所述组合物基本上不含所述dsrna。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中mrna的所述体外合成在约6至8.5之间的ph下进行。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中mrna的所述体外合成在包含25mmtris hcl、2mm亚精胺、25mm mgcl、0.5mm nacl和ph 7.5的缓冲液中进行。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法不包括离液剂。

13.一种大规模产生包含全长信使rna(mrna)的组合物的方法,所述方法包括使用sp6rna聚合酶体外合成mrna,其中所述组合物包含按重量计小于1%的双链rna(dsrna),并且其中以单个批次合成至少100mg mrna。

14.根据权利要求13所述的方法,其中所述组合物含有按重量计小于0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的所述dsrna。

15.根据权利要求14所述的方法,其中所述组合物基本上不含所述dsrna。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中通过斑点印迹测定或elisa检测所述dsrna。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在为所述合成的mrna加帽或加尾之前对所述dsrna进行检测。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括为所述合成的mrna加帽和/或加尾的步骤。

19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中在为所述合成的mrna加帽和加尾之后对所述dsrna进行检测。

20.根据权利要求13-19中任一项所述的方法,其中以单个批次合成至少200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、150g、200g、250g、500g、750g、1kg、5kg或10kg或更多的mrna。

21.根据权利要求13-20中任一项所述的方法,其中所述方法不包括特意去除所述dsrna的步骤。

22.根据权利要求13-21中任一项所述的方法,其中所述方法不包括色谱步骤。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述sp6 rna聚合酶是天然存在的sp6 rna聚合酶。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述sp6 rna聚合酶是重组sp6 rna聚合酶。

25.根据权利要求24所述的方法,其中所述sp6 rna聚合酶包含标签。

26.根据权利要求25所述的方法,其中所述标签是his标签。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中基于dna模板通过所述sp6 rna聚合酶合成所述mrna。

28.根据权利要求27所述的方法,其中反应混合物中sp6 rna聚合酶的按重量计的量等于或大于dna模板的按重量计的量。

29.根据权利要求28所述的方法,其中dna模板与sp6 rna聚合酶的重量比在1:1与1:3之间。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法,其中所述dna模板包含可操作地连接至编码待合成的mrna序列的dna序列的sp6启动子。

31.根据权利要求30所述的方法,其中所述dna序列是经优化的。

32.根据权利要求31所述的方法,其中所述dna序列经优化以降低在所述合成的mrna中形成发夹结构的可能性。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在反应混合物中合成所述mrna,所述反应混合物包含每种ntp在范围为1-10mm的浓度下的ntp、在范围为0.01-0.5mg/ml的浓度下的所述dna模板、以及在范围为0.01-0.1mg/ml的浓度下的所述sp6 rna聚合酶。

34.根据权利要求33所述的方法,其中所述反应混合物包含每种ntp在5mm的浓度下的ntp、在0.1mg/ml的浓度下的所述dna模板和在0.05mg/ml的浓度下的所述sp6 rna聚合酶。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在范围为37℃-42℃的温度下合成所述mrna。

36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法,其中所述ntp是天然存在的ntp。

37.根据权利要求33-35中任一项所述的方法,其中所述ntp包括修饰的ntp。

38.根据权利要求37所述的方法,其中所述修饰的ntp包含假尿苷(“ψu”)。

39.根据权利要求38所述的方法,其中所述假尿苷是1-n-甲基-假尿苷。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述全长mrna分子的长度是至少100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、600个碱基、700个碱基、800个碱基、900个碱基、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、8kb、10kb或15kb。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述mrna是经密码子优化的。

42.一种组合物,所述组合物包含通过根据前述权利要求中任一项所述的方法产生的mrna。

43.一种包含使用sp6 rna聚合酶以单个批次产生而没有通过色谱步骤纯化的体外合成的信使rna(mrna)的组合物,其中所述组合物含有小于1%的双链rna(dsrna)。

44.根据权利要求43所述的组合物,其中所述组合物包含至少100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、150g、200g、250g、500g、750g、1kg、5kg、10kg或更多的mrna。

45.根据权利要求43-44中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含按重量计小于0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的所述dsrna。

46.根据权利要求45所述的组合物,其中所述组合物基本上不含所述dsrna。

47.根据权利要求43-46中任一项所述的组合物,其中通过斑点印迹测定检测所述dsrna。

48.根据权利要求43-47中任一项所述的组合物,其中所述其中所述mrna基本上不含短聚体污染。

49.根据权利要求48所述的组合物,其中所述mrna基本上不含dsrna和短聚体污染两者。

50.根据权利要求43-49中任一项所述的组合物,其中所述mrna是经密码子优化的。

51.根据权利要求43-50中任一项所述的组合物,其中所述mrna的长度是至少100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、600个碱基、700个碱基、800个碱基、900个碱基、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、8kb、10kb或15kb。

52.根据权利要求42-51中任一项所述的组合物,其中将所述mrna包封在脂质体内。

53.根据权利要求42所述的组合物,其中所述脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种peg修饰的脂质。

54.根据权利要求53所述的组合物,其中所述脂质体进一步包含基于胆固醇的脂质。

55.根据权利要求43-54中任一项所述的组合物,其中所述mrna是未修饰的。

56.根据权利要求43-54中任一项所述的组合物,其中所述mrna是修饰的。

57.根据权利要求56所述的组合物,其中所述修饰的mrna包含假尿苷(“ψu”)。

58.根据权利要求57所述的组合物,其中所述假尿苷是1-n-甲基-假尿苷。

59.一种治疗疾病或障碍的方法,所述方法包括使用根据权利要求42-54中任一项所述的组合物。


技术总结
本发明尤其提供了用于大规模产生包含基本上不含双链RNA的全长信使RNA产物的组合物的方法以及使用此类方法产生的组合物及其用途。本发明部分地基于以下令人惊奇的发现:使用SP6RNA聚合酶通过体外转录产生的mRNA产物基本上不含双链RNA。在一方面,本发明提供了大规模产生用于mRNA疗法而不需要色谱步骤的mRNA产物的方法。

技术研发人员:J·阿比萨尔赫,A·迪亚斯,J·E·瓦格斯,D·库珀,F·德罗萨
受保护的技术使用者:翻译生物公司
技术研发日:
技术公布日:2024/1/13
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