用于制备基于扩增检测病原体的生物样品的提取溶液的制作方法

本发明描述了一种提取组合物，其允许在无需预先提取和纯化靶核酸的情况下，通过pcr通过病原体的核酸基因组直接检测该病原体，尤其是rna病毒如sars-cov-2。将根据本发明的提取组合物添加至粗制生物样品中，由此使所制样品，在无需预先纯化靶核酸的情况下，与后续的一种或多种靶核酸的直接扩增相容。与现有技术方法相比，本发明的技术增加了灵敏度。此外，还提供了一些手段，以避免由于制备的生物样品中的组分对扩增反应的抑制而导致的灵敏度下降。

背景技术：

1、检测生物样品中是否存在靶核酸的方法被广泛使用，在诊断领域具有特殊意义。此类方法被广泛用于确定对象是否感染了目标病原体。检测病原体(例如细菌或病毒)的标准程序是证明病原体的基因组核酸(即dna或rna)的存在。在标准的现有技术方法中，使用文献中描述的样品制备方法从患者样品中纯化病原体(例如病毒)的核酸。然后将纯化的核酸应用于核酸扩增反应，扩增并检测以确定病原体是否存在。

2、由于其灵敏度，聚合酶链反应(pcr)经常用于检测，具体是病毒的检测。如本领域已知的，对于具有rna基因组的病毒，在通过pcr检测之前需要将rna转化为dna的另外步骤。催化该过程的酶是逆转录酶(rt)。将rna转录成cdna并随后通过pcr扩增基因组，通常称为rt-pcr并广泛用于本领域。该技术已被广泛用于各种人类致病病毒，包括但不限于冠状病毒科，例如sars-cov[-1](严重急性呼吸系统综合征冠状病毒[1])、mers-cov(中东呼吸系统综合征冠状病毒)和sars-cov-2(严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2)。

3、为了检测许多病原体，包括sars-cov-2(covid-19疾病的病因)，需要从对象身上获取生物样品，例如通过鼻咽或口咽拭子。然后将带有收集的生物样品的拭子放入介质中，例如utm(通用运输介质；科潘恩公司(copan))或vtm(病毒运输介质；cdc：https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/viral-transport-medium.pdf)用于运输并送到实验室以进一步进行基于扩增的分析。然后使用病毒dna/rna提取方法(例如qiaamp病毒rna微型试剂盒；qiagen)从收集的生物样品中分离核酸，包括sars-cov-2rna基因组(如果存在于收集的样品中)，然后通过特异性pcr检测病毒rna基因组的一种或多种靶核酸。从收集的生物样品中预先纯化核酸提供了含有用于扩增反应模板的纯洗脱液。预先去除生物样品本身或收集介质中所含的扩增反应的杂质和抑制剂，从而确保扩增反应不被抑制并且可以高灵敏度地检测是否存在靶标。

4、然而，在大流行的情况下(例如在当前的covid-19大流行中)，必须在尽可能短的时间内分析大量患者样品，这种经典工作流程显示出明显的缺点。包括核酸分离步骤的初始样品制备会减慢整个诊断过程，即使该方法以自动化方式进行也是如此。因此，这会导致诊断中出现不期望和不可接受的积压。此外，由于大流行期间需要处理的样品数量众多，因此存在所需核酸提取试剂短缺的风险，从而进一步增加了积压。因此，迫切需要可靠和灵敏的方法，其允许基于扩增检测收集的生物样品中是否存在病原体，而无需在进行基于扩增的检测之前纯化靶核酸。

5、鉴于这一迫切需要，开发了几种方法，其旨在规避涉及核酸纯化的样品制备步骤，而是旨在直接从运输介质中检测病原体(例如sars-cov-2)，这意味着生物样品的等分部分在其运输介质中直接接受标准pcr反应。这在预印本服务器biorxiv(https://www.biorxiv.org/)和medrxiv(https://www.medrxiv.org/)上发布的许多出版物中都有描述。然而，不足为奇的是，运输介质的组分严重抑制了pcr，导致ct值显著增加，以及因此所致的不可接受的灵敏度损失。因此，标准pcr组合物不适用于直接检测，如例如alcoba-florez等(2020)和foomsgard ans rosenstierne(2020)中所述。

6、也有一些商业化的pcr试剂盒可以应对直接应用运输介质的情况。然而，它们仍然需要对原始样品进行耗时的手动预处理步骤，例如加热后离心(takara；primedirectprobe rt-qpcr混液(primedirect probe rt-qpcr mix))或添加预处理溶液后加热(shimadzu；2019冠状病毒检测试剂盒)。这些系统的另一个限制是，即使在预处理步骤之后，也只能应用于有限量的样品，与病毒rna纯化后的pcr检测相比，这也可能导致灵敏度降低。

7、先前的研究还调查了初始热灭活步骤对pcr灵敏度和准确性的影响。这些研究一致证实，在通过pcr检测sars-cov-2之前加热样品会导致ct值显著增加，从而降低检测率，这与加热步骤后是否提取病毒核酸无关，也与使用的试验方法无关(e、n、orf1 ab)(zou等，2020；alcoba-florez等，2020；fomsgaard&rosenstierne，2020)。在病毒载量低的情况下，这种灵敏度损失尤其成问题。此外，从这些先前的报道可以看出，即使在省略核酸提取步骤时可以检测到信号并节省时间，但这些直接方法在pcr灵敏度和准确性方面无法与已建立的结合病毒核酸提取步骤标准方法相当，该步骤目前是sars-cov-2检测领域的黄金标准(alcoba-florez等，2020；fomsgaard&rosenstierne，2020)。

8、因此，本发明的一个目的是规避现有技术的缺点并提供改进的技术(例如方法和试剂盒)，用于生物样品中包含的靶核酸的基于扩增的检测。

9、另一目的是提供一种能够使用基于扩增的方法检测是否存在病原体(例如sars病毒)的方法，该方法避免了预先核酸纯化，同时确保扩增反应的良好灵敏度。具体地，需要避免耗时的预处理步骤的快速方法。因此，本发明的另一个目的在于，还提供一种基于快速、直接扩增的方法，该方法不需要纯化病原体核酸(例如sars-cov-2rna)，并且避免了复杂的预处理步骤。在实施方式中，此类方法还应允许将尽可能多的粗制生物样品直接添加至扩增反应而不损害检测灵敏度。

技术实现思路

1、本发明克服了现有技术的核心缺陷。具体地，本发明提供了解决上述问题和困难的方法和试剂盒，如本文实施例所证明和解释。

2、具体地，提供了快速方法和有用的试剂盒，其允许从粗制生物样品(包括包含在运输介质中的样品)中直接检测靶核酸，尤其是源自病原体的靶核酸，而不需要预先提取靶核酸。本文描述的技术基于用专门设计的提取组合物对粗制生物样品进行预处理，使生物样品无需预先进行核酸纯化就可用于直接扩增。如实施例所证明的，使用本发明的预处理技术提高了直接扩增方案的灵敏度。本文公开的直接扩增技术是快速的并且不仅避免了扩增前的核酸纯化，也省略了耗时或损害样品的预处理步骤(例如过滤或离心)。此外，本文公开的预处理方案允许对大量经预处理的粗制生物样品进行扩增反应，由此可以增加后续扩增的灵敏度。根据本发明的方法可与标准的热循环和等温扩增程序兼容并且可以有利地在单个反应容器中进行。因此，标准扩增的益处(例如标准逆转录扩增(例如定量逆转录pcr))，与直接检测的益处相结合。由于其快速和直接的工作流程，根据本发明的方法和试剂盒尤其适用于处理大量粗制生物样品以进行快速病原体检测，例如在大流行情况下需要的那样。因此，本发明极大改进了生物样品中病原体的检测。如本文实施例所示，该方法尤其适用于检测呼吸道样品(例如拭子样品)中是否存在rna病毒(例如sars-cov-2)。因此，本发明对本领域做出了重要贡献。

3、根据第一方面，提供了一种制备生物样品的方法，该生物样品用于在无需预先纯化靶核酸的情况下对该生物样品中包含的至少一种靶核酸进行基于扩增的检测，其包括

4、-使生物样品与提取组合物接触，所述提取组合物包含：

5、(a)至少一种表面活性剂，

6、(b)至少一种核酸酶抑制剂，和

7、(c)任选地至少一种还原剂，

8、和

9、-孵育包含与提取组合物接触的生物样品的混合物以提供用于基于扩增检测靶核酸的制备的生物样品。

10、根据第一方面所述的方法尤其适合制备粗制生物样品(例如包含在运输介质中的生物介质)，其用于基于直接扩增检测生物样品中是否存在病原体。如本文所公开，病原体可以是rna病毒(例如具体是冠状病毒)。如本文所公开，该方法尤其适用于制备生物样品，该生物样品用于检测生物样品(例如呼吸道试样)中是否存在sars-cov-2。

11、根据第二方面，提供了一种在无需预先纯化靶核酸的情况下基于扩增检测生物样品中包含的至少一种靶核酸的方法，其包括

12、(a)制备用于基于扩增检测靶核酸的生物样品，其中所述制备包括

13、-使生物样品与提取组合物接触，所述提取组合物包含

14、(a)至少一种表面活性剂，

15、(b)至少一种核酸酶抑制剂，和

16、(c)任选地至少一种还原剂，

17、和

18、-孵育包含与提取组合物接触的生物样品的混合物，以提供制备的生物样品；

19、(b)使制备的生物样品的至少等分部分或全部进行扩增反应并扩增至少一种靶核酸，任选地，其中在扩增前进行逆转录反应以将rna逆转录为cdna。如本文所公开，步骤(a)优选使用根据本文所述第一方面的方法进行。有利地，并且与许多现有技术方法不同，在扩增反应之前不进行核酸纯化。不同的是，将已如本文所述制备的粗制样品用于扩增反应。

20、根据第三方面，提供了一种用于基于扩增源自病原体的至少一种靶核酸来检测生物样品中病原体是否存在的方法，其包括

21、(a)制备用于基于扩增检测靶核酸的生物样品，其中所述制备包括

22、-使生物样品与提取组合物接触，所述提取组合物包含：

23、(a)至少一种表面活性剂，

24、(b)至少一种核酸酶抑制剂，和

25、(c)任选地至少一种还原剂，

26、和

27、-孵育包含与提取组合物接触的生物样品的混合物，以提供制备的生物样品；

28、(b)使制备的生物样品的至少等分部分或全部进行扩增反应并扩增至少一种靶核酸，任选地，其中在扩增前进行逆转录反应以将rna逆转录为cdna。同样，步骤(a)优选使用根据本文所述第一方面的方法进行。有利地，可以避免扩增前的核酸纯化，从而使该方法消耗更少的时间和资源。

29、根据第二和第三方面的方法尤其适用于检测生物样品中是否存在病原体(例如病毒)。如本文所公开，病原体可以是rna病毒(例如具体是冠状病毒)。如本文所公开，所述方法尤其适用于检测各种生物样品(例如具体是呼吸道试样)中是否存在sars-cov-2。

30、根据第四方面，提供了一种试剂盒，其包含(a)根据本发明所述的提取组合物。详细公开了该提取组合物结合根据第一方面所述的方法。根据本发明的试剂盒适用于进行根据第一、第二或第三方面所述的方法。因此，试剂盒还可包括用于进行此类方法的说明。第四方面的试剂盒还可包括一种或多种或优选全部以下组分：

31、(b)dna聚合酶；

32、(c)逆转录酶；

33、(d)扩增反应缓冲液，其包含mg2+源、缓冲剂和任选的其他添加剂；

34、(e)dntp混合物；和

35、(f)用于扩增至少一种靶核酸的引物。

36、根据第五方面，本公开涉及根据第四方面所述的试剂盒在根据第一、第二和/或第三方面所述的方法中的用途。

37、通过以下描述和所附权利要求书，本技术的其他目的、特征、优点和方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求书和具体实施例尽管示出了本技术的优选实施方式，但它们仅以示例性说明的方式给出。