具有受控的分区孔隙度的填装床生物反应器的制作方法

本公开内容大体上涉及填装床构造中的细胞培养基材以及细胞培养的系统和方法。具体来说，本公开内容涉及具有受控和可变孔隙度的限定区的填装床细胞培养基材以及结合了此类基材的生物反应器系统和采用此类基材的细胞培养方法。

背景技术：

1、在生物加工行业，出于生产激素、酶、抗体、疫苗和细胞疗法的目的进行大规模细胞培养。细胞和基因治疗市场正在快速增长，有希望的治疗进入临床试验并迅速走向商业化。然而，一次细胞治疗剂量可能需要数十亿个细胞或数万亿个病毒。由此，能够在短时间内提供大量细胞产品对于临床成功是至关重要的。

2、生物加工中使用的大部分细胞都依赖于锚点，这意味着细胞需要表面来粘附从而进行生长和发挥功能。传统上，粘附细胞的培养是在二维(2d)细胞粘附表面上进行的，所述细胞粘附表面整合在多种容器形式中的一种，例如：t型瓶、培养皿、细胞工厂、细胞堆叠容器、辊瓶以及容器。这些方案会具有明显缺陷，包括难以实现高到足以使得可用于治疗或细胞的大规模生产的细胞密度。

3、已经建议有替代方法来增加培养细胞的体积密度。这些包括在搅拌罐中进行的微载体培养。在这种方案中，附着到微载体表面的细胞经受恒定剪切应力，导致对增殖和培养性能的明显影响。高密度细胞培养系统的另一个例子是空心纤维生物反应器，其中，当他们在纤维空间之间的空间中增殖时，细胞可以形成大的三维聚集体。然而，由于缺乏营养物，细胞生长和性能受到明显抑制。为了缓解这个问题，将这些生物反应器制造成小的并且不适合大规模生产。

4、用于锚定依赖细胞的高密度培养系统的另一个例子是填装床生物反应器系统。在这种类型的生物反应器中，使用细胞基材来提供粘附细胞的附着表面。介质沿表面或通过半多孔基材灌注，以提供细胞生长所需的营养物和氧气。例如，先前的美国专利第4,833,083号、第5,501,971号以及第5,510,262号已经公开了含有支撑或基质系统的填装床来俘获细胞的填装床生物反应器系统。填装床基质通常是由多孔颗粒作为基材或者聚合物的非织造微纤维来制造得到的。此类生物反应器起到了再循环流通式生物反应器的功能。明显问题之一在于，此类生物反应器在填装床内的细胞分布不是均匀的。例如，填装床起到了深度过滤器的功能，细胞主要俘获在入口区域处，导致接种步骤期间的细胞分布的梯度。此外，由于无规纤维填装，填装床的横截面的流动阻力以及细胞俘获效率不是均匀的。例如，介质快速流动通过具有低的细胞填装密度的区域，而缓慢流动通过由于较高数量的俘获细胞导致较高阻力的区域。这产生了通道效应，其中，营养物和氧气被更有效地传递到具有较低体积细胞密度的区域，而具有较高细胞密度的区域则维持在非最优培养条件下。

5、现有技术公开的填装床系统的另一个明显缺陷在于，无法在培养过程结束时高效地收获完整的活细胞。如果最终产品是细胞或者如果生物反应器被用作“接种序列”的一部分(其中，细胞群体在一个容器中生长，然后转移到另一个容器以使得群体进一步生长)的话，那么细胞的收获是至关重要的。美国专利第9,273,278号公开了改善细胞收获步骤期间从填装床回收细胞的效率得到改善的生物反应器设计。其基于疏松填装床基质以及填装床颗粒的振动或搅拌来实现多孔基质碰撞并由此分离细胞。然而，这种方案是费力的，并且可能导致明显细胞破坏，从而降低了整体细胞存活率。

6、目前市场上的填装床生物反应器的例子是pall有限公司生产的icellis使用由以非织造布置的无规取向纤维构成的细胞基材材料的小条。将这些条填装到容器中以产生填装床。然而，如同市场上类似的解决方案那样，这种类型的填装床基材存在缺陷。具体来说，基材条的非均匀填装产生了填装床内视觉可见的通道，导致优先和非均匀的介质流动以及填装床的营养物分布。对的研究已经注意到“细胞的系统性非均质分布，它们的数量从固定床的顶部到底部发生增加”以及“营养物梯度……导致限制了细胞生长和生产”，这全都导致“可能影响转染效率的细胞的不均分布”。(rationalplasmid design and bioprocess optimization to enhance recombinant adeno-associated virus(aav)productivity in mammalian cells(合理的质粒设计和生物过程优化，以提高哺乳动物细胞中重组腺相关病毒(aav)的生产力)，生物技术期刊，2016年11月，290-297页)。研究注意到填装床的搅拌可以改善分布，但是会具有其他缺陷(即，“在接种和转染过程中为了更好地分散而进行的必要搅拌会诱发剪切应力的增加，这进而导致细胞活力降低”，同上)。的另一项研究注意到：细胞的不均匀分布使得使用生物量传感器监测细胞群体是困难的(“……如果细胞分布不均匀，则顶部载体上细胞的生物量信号可能无法显示整个生物反应器的全貌”。process development of adenoviral vectorproduction in fixed bed bioreactor:from bench to commercial scale(固定床生物反应器中腺病毒载体生产的工艺开发：从实验室到商业规模)，人类基因治疗，第26卷，第8期，2015年)。

7、此外，由于纤维在基材条中的无规排布以及的一个填装床与另一个之间的条填装中的变化，消费者可能难以预测细胞培养性能，因为培养之间的基材是不同的。此外，的填装基材非常难以或不可能高效地收获细胞，因为相信细胞被填装床所俘获。

8、虽然利用现有平台可以制造用于早期临床试验的病毒载体，但是需要能够以更大数量生产高质量产品的平台，以达到后期商业制造规模。如上文所述，现有的细胞培养平台依赖于随机和不受控的结构或孔隙度的粘附性细胞基材，由于随机填装、通道效应、细胞截留等导致不均匀并且甚至是不可预测的基材结构和性能。无论填装床基材基质是均匀或是随机的，对于按需控制流体流动通过填装床总会是困难的，这导致细胞培养各个方面中的困难，包括均匀细胞接种、细胞生长分布、细胞培养介质流动均匀性以及收获能力。

9、存在对于能够以高密度形式、均匀细胞分布、便于获得且增加收获产率以及可控填装床孔隙度的方式对细胞进行培养的填装床细胞培养基质、系统和方法的需求从而改善接种、培养和/或收获性能。

技术实现思路

1、根据本公开内容的实施方式，提供了用于细胞培养的填装床生物反应器系统。系统包括：细胞培养容器，其包含入口、出口和至少一个内部储器，所述内部储器流体连接到且布置在入口与出口之间的流体路径中；布置在储器中的细胞培养基质，所述细胞培养介质包括结构受限定的基材，具有限定了多个孔的基材材料，其中，基材材料用于使得细胞粘附到其；以及在一部分的细胞培养基质中的至少一个渗透区。所述至少一个渗透区的渗透性高于所述至少一个渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性。渗透区包括基材中的开口，其中，开口的直径大于所述多个孔中的任一个。

2、根据一个或多个实施方式的方面，细胞培养基质包括多层基材。所述多层基材中的每层可以包括有序且基本均匀的孔阵列。渗透区包括所述多层中具有开口的多个层。在至少一部分的所述多个层中的开口的细胞培养基质的水平横截面的面积可以不同于所述多个层中的至少一个中的开口。具有开口的所述多个层中的每一个可以具有相同的开口布置。具有开口的所述多个层中的至少一部分可以相对于具有开口的所述多个层中的至少一个转动，其中，转动是绕着细胞培养基质的纵轴。在另一个方面中，所述多层中的一个或多个具有基材中的多个开口。具有多个开口的所述多层中的一个或多个可以绕着细胞培养基质的纵轴具有旋转对称性。

3、在一些方面中，开口所具有的形状包括以下至少一种：矩形、正方形、圆形、椭圆形、圆形、圆弧和三角形。开口可以从基材的边缘朝向基材的中心延伸。在一些实施方式中，系统还包括：布置在入口与细胞培养基质之间的流动分配板，其中，入口和流动分配板布置成使得经由入口进入内部储器的流体在内部储器的宽度上以不同速度流动通过流动分配板，以及细胞培养基质的渗透区设计成补偿来自流动分配板的不同速度，从而使得通过细胞培养基质的灌注速度曲线在细胞培养基质的宽度上是均匀的。

4、根据本公开内容的另一个实施方式，提供了用于生物反应器中的基于培养粘附细胞的细胞培养基质。细胞培养基质包括结构受限定的基材，基材材料限定了多个孔，所述基材材料构造成使得细胞粘附到其；以及在一部分的细胞培养基质中的至少一个渗透区，所述至少一个渗透区的渗透性高于所述至少一个渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性。渗透区包括基材中的开口，其中，开口的直径大于所述多个孔中的任一个。

5、作为一些实施方式的方面，细胞培养基质可以包括多层基材。所述多层基材中的每层可以具有有序且基本均匀的孔阵列。渗透区可以包括所述多层中具有开口的多个层。在至少一部分的所述多个层中的开口的细胞培养基质的水平横截面的面积可以不同于所述多个层中的至少一个中的开口。包含开口的所述多个层中的每一个包括相同的开口布置。具有开口的所述多个层中的至少一部分可以相对于具有开口的所述多个层中的至少一个转动，其中，转动是绕着细胞培养基质的纵轴。所述多层中的一个或多个可以具有基材中的多个开口。具有多个开口的所述多层中的一个或多个可以绕着细胞培养基质的纵轴具有旋转对称性。开口可以具有以下至少一种形状：矩形、正方形、圆形、椭圆形、圆形、圆弧和三角形。

6、在以下详细描述、附图和任一权利要求中部分地提出了本公开内容的其他方面，它们部分会源自详细描述或者可以通过实施本公开内容来习得。要理解的是，前面的一般性描述和以下的具体描述这两者都只是示例性和解释性的，不构成对所揭示的本公开内容的限制。