用于冷冻保存工程化Treg的方法与流程

本发明涉及冷冻保存调节性t细胞(treg)的方法。特别地，本发明涉及在冷冻保存之前增加treg中foxp3表达的方法，以保留冷冻保存后treg的抑制功能。本发明还涉及冷冻保存的工程化treg、包含该冷冻保存的工程化treg的药物组合物及其治疗用途。

背景技术：

1、近年来，人们对在过继细胞治疗(act)的临床环境中使用调节性t细胞(treg)来治疗一系列不同的病症越来越感兴趣。已经提出treg基于其免疫抑制功能被用于控制不希望的免疫应答。例如，treg已经用于治疗自身免疫性疾病或过敏性疾病，用于移植中的免疫调节，并且用于改善和/或预防炎性病症中的免疫介导的器官损伤。另外，已经对treg进行了基因工程改造以表达具有新特异性的t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)，从而提供了提供靶向免疫抑制的优点。各种i期试验已经显示treg治疗是安全和有效的，并且目前正在进行若干ii期试验。

2、用于治疗用途的treg的主要来源是来自患者自身的血液(直接从血管抽取或作为白细胞分离的产物抽取)或者来自脐带血。来自这些来源的treg的数目是低的，并且需要大量数量来有效抑制免疫系统。因此，必须进行离体扩增以获得足够数量的treg用于输注到患者体内。遵循良好生产规范(gmp)指南的典型的分离和扩增方案需要从大约九天直到二十一天。如果这些细胞可以以足够的量加工和冷冻，在需要时准备用于患者，并且避免可能对treg质量有不利影响的延长的加工，则将是非常有利的。这种方法将允许在计划治疗方面和输注时间方面具有更大的灵活性，并且将允许随后的treg输注并允许在药物治疗之前收集细胞。因此，冷冻保存treg的能力是至关重要的。

3、冷冻和解冻对treg细胞群的影响尚未明确。几个研究小组已经报道了冷冻保存可能对treg具有有害影响并且可能降低treg存活率，引起异常的细胞因子分泌，并且改变合适的treg抑制功能和迁移所必需的表面标志物的表达。

4、特别地，florek等(florek等,plos one,2015,doi:10.137/journal.pone.0145763)已经显示treg的冷冻-解冻导致cd62l(l-选择蛋白)表达的丧失并导致保护免受移植物抗宿主病(gvhd)的能力受损。解冻的treg显示与cd62l结合配偶体madcam1结合的能力降低并且通向次级淋巴器官的归巢受损。其他研究已经显示，在冷冻保存后，t细胞上的cd62l(l-选择蛋白)和ccr5表达丧失(de boer等,bone marrowtransplant,1998,22:1103-10和hattori等,exp hematol,2001,29:114-22)。缺乏cd62l表达的treg具有降低的运输能力、降低的定位以及因此treg控制的免疫应答的区室化(sakaguchi等,cell,2008,133:775-87)。解冻后cd62l表达的丧失可以通过过夜培养来逆转(de boer等,1998和hattori等,2001)。然而，以这种方式静息细胞对于临床应用可能是不切实际的，临床应用中解冻通常在床边进行并且因此进一步培养是不可能的。

5、golab等(golab等,oncotarget,2018,第9卷,(第11期),第9728-9740页)评价了treg治疗的两种细胞库策略，即，用于随后的treg分离/扩增的cd4+细胞的冷冻保存和离体扩增的treg(cd4+cd25hicd127lo/-细胞)的冷冻保存。发现离体扩增的treg比cd4+细胞对冷冻保存过程更敏感，其解冻后细胞存活率低得多并且treg标志物表达降低(即，具有表型cd4+cd25hicd127-和cd4+foxp3+的细胞的频率降低)。通过在随后的离体扩增13天期间再刺激treg来克服解冻后的差的treg存活率和受损的表型。类似地，peters等(peters等,plosone,2008,3:e3161)显示解冻后treg抑制能力可以通过刺激和扩增10天来恢复。

6、然而，如上所述，在临床环境中，这些额外的培养和扩增步骤也是不可行的，原因在于其花费时间，带来增加的风险，并且抵消了使用冷冻保存的treg与新鲜分离的细胞相比的益处。因此，仍然需要改进的冷冻保存方法，其中冷冻保存的treg可以在解冻后立即施用于患者，而不需要实验室目前需要的冗长的解冻后拯救步骤。

技术实现思路

1、在这方面，发明人惊奇地发现了外源foxp3表达对冷冻保存后的treg表型提供保护作用。发明人已经确定用foxp3转导的treg在冷冻和解冻后维持cd62l(或l-选择蛋白)表达。由于cd62l表达对于treg的迁移和归巢功能是必需的，因此cd62l表达对于treg的免疫抑制功能是重要的。因此，在冷冻保存(例如，作为细胞的必需加工的一部分)之前用foxp3转导treg得到treg，该treg在解冻后仍维持其免疫调节和抑制功能，从而允许所述细胞在患者中立即使用。因此，发明人提供了一种针对与treg的冷冻保存相关的问题的解决方案，该解决方案避免了细胞的进一步培养，并且提供了一种产生可有效用于临床的treg治疗的途径。

2、因此，本发明提供了一种工程化treg，该工程化treg在冷冻保存后保持其免疫抑制特性，并且因此具有增强的临床功效和安全性。冷冻保存的treg可以用于多种治疗用途，包括诱导受试者对移植物的耐受性或者用于治疗和/或预防移植排斥、移植物抗宿主病、炎症、自身免疫性疾病、过敏性疾病、神经炎性疾病比如肌萎缩性侧索硬化症(als)、代谢疾病比如i型糖尿病、或者用于抑制免疫应答。

3、在第一方面，本发明提供了一种将cd62l表达保存在已经冷冻保存的调节性t细胞(treg)群或treg中的方法，包括在冷冻保存之前将编码foxp3多肽的多核苷酸引入treg群或treg中。

4、所述treg群或treg可以在冷冻保存后具有相比于冷冻保存后的对应非工程化treg群或treg(即，未用编码foxp3的多核苷酸转导的treg群或treg)更高的cd62l表达。

5、该方法还可以包括冷冻保存所述treg群或treg的步骤，因此，本发明还可以提供一种将cd62l表达保存在用于冷冻保存的调节性t细胞(treg)群或treg中的方法，包括以下步骤：(a)将编码foxp3多肽的多核苷酸引入treg群或treg中；和(b)冷冻保存所述treg群或treg。

6、替代性地，本发明可以提供一种用于冷冻保存treg(或treg群)的方法，包括：(a)将编码foxp3的多核苷酸引入treg或treg群中；和(b)冷冻保存所述treg或treg群，其中所述冷冻保存的treg或treg群具有相比于相应的非工程化treg或treg群更高的cd62l表达水平。

7、在另一方面，本发明提供了一种用于产生冷冻保存的treg或treg群的方法，所述冷冻保存的treg或treg群具有与对应的非冷冻保存的treg或treg群相当的cd62l水平，该方法包括：(a)将编码foxp3的多核苷酸引入treg或treg群中；和(b)冷冻保存所述treg或treg群。

8、技术人员将理解的是，本文所描述的方法步骤通常以其动作顺序提供，例如，步骤(a)应当在步骤(b)之前执行。

9、本发明的方法还可以包括以下任何一个或多个附加步骤：在将编码foxp3的多核苷酸引入所述treg或treg群之前，将treg或treg群从样品中分离，解冻所述treg或treg群和/或向受试者施用解冻的treg或treg群。该方法还可以包括在冷冻保存之前扩增treg群或treg的步骤。替代性地，本发明的treg或treg群在被扩增之前可以不冷冻保存。本发明的冷冻保存的treg或treg群可以立即用作现成的治疗产品，而不需要进一步的扩增、修饰或替代的额外培养步骤。

10、在这方面，本发明还提供了一种将cd62l表达保存在已经从冷冻保存状态解冻的treg或treg群中的方法，包括在冷冻保存和解冻之前将编码foxp3多肽的多核苷酸引入treg或treg群中。

11、替代性地，本发明提供了一种将cd62l表达保存在从冷冻保存状态解冻后的treg或treg群中的方法，包括：(a)将编码foxp3的多核苷酸引入treg或treg群中，(b)冷冻保存所述treg或treg群，和(c)解冻所述treg或treg群。所述treg或treg群可以在解冻后/期间立即使用，而不需要额外的扩增。该方法还可以包括以下步骤：(i)在步骤(a)之前，从怀疑含有treg的样品中富集treg，以产生富含treg的样品，和(ii)在步骤(a)之后但在步骤(b)之前，从富含treg的样品中扩增treg或treg群，以产生工程化的扩增的treg或treg群。步骤(i)还可以包括耗竭cd8+细胞。

12、在另一方面，本发明提供了一种用于产生解冻的treg或treg群的方法，所述解冻的treg或treg群具有与非冷冻保存的treg或treg群相当的cd62l水平，该方法包括：(a)将编码foxp3的多核苷酸引入treg或treg群中，(b)冷冻保存所述treg或treg群，和(c)解冻所述treg或treg群。所述treg或treg群可以在解冻后/期间立即使用，而不需要额外的扩增。该方法还可以包括以下步骤：(i)在步骤(a)之前，从怀疑含有treg的起始细胞样品中富集treg，以产生富含treg的样品，和(ii)在步骤(a)之后但在步骤(b)之前，从富含treg的样品中扩增treg或treg群，以产生工程化的扩增的treg或treg群。步骤(i)还可以包括耗竭cd8+细胞。

13、样品(也称为含有treg细胞的样品或简称为含有细胞的样品)可以包含全血、脐带血、白细胞锥、血锥、外周血单核细胞(pbmc)或白细胞团(leukopak)，或者可以由全血、脐带血、白细胞锥、血锥、外周血单核细胞(pbmc)或白细胞团组成。通常，样品可以包含白细胞锥或一个或多个白细胞团，或者由白细胞锥或一个或多个白细胞团组成。通常，样品来自人类供体。供体可以是健康的或者可以患有疾病比如神经发生性疾病(比如，als)或自身免疫性疾病(例如，i型糖尿病)或者可以是移植患者。

14、所述treg群(或treg)的冷冻保存可以包括以下步骤：(bi)将所述treg群悬浮在冷冻保存培养基中；(bii)冷冻来自步骤(bi)的treg群；和(biii)在低于-130℃的温度储存来自步骤(bii)的所述treg群。合适的冷冻保存培养基可以是本领域已知的任何冷冻保存培养基，如以下详细论述的。优选地，冷冻保存培养基将含有一种或多种冷冻保护剂，合适的冷冻保护剂将在下面论述。优选地，冷冻保存培养基和冷冻保护剂将符合良好生产规范(gmp)标准。

15、本发明的方法还可以包括以下任何一个或多个步骤：在冷冻保存(步骤(b))之前，将所述treg群(或treg)，和/或在任何冷冻保存步骤中待使用的任何一种或多种(并且优选地所有)试剂或装置进行预冷却；以约-1℃/分钟的受控冷冻速率来冷冻(根据步骤(b))的所述treg群(或treg)；和/或在步骤(biii)之前将treg群(或treg)在-80℃下储存长达24小时。“试剂”可以包括例如冷冻保存培养基，“装置”可以包括例如保持受控冷冻速率的任何冷冻装置。合适的试剂和装置可以是本领域已知的用于冷冻保存的任何试剂或装置。优选地，这样的试剂和装置将符合gmp标准。

16、步骤(biii)可以包括将所述treg群储存在液氮中。液氮的温度可以是约-196℃。

17、解冻所述treg群(或treg)的步骤可以包括将treg组合物从低于-130℃的温度温热至介于约0至10℃之间的温度，可选地其中温热treg群包括将treg组合物置于维持在约37℃的水浴中。

18、冷冻保存步骤和/或解冻步骤可以根据gmp标准在封闭系统或a级环境中进行。

19、可以通过选择cd4+cd25+cd127-细胞和/或cd4+cd25+cd127low细胞或者通过选择cd4+cd25hicd127-细胞和/或cd4+cd25+cd127low细胞将treg群从样品中分离。可以通过选择cd45ra+细胞、优选地cd4+cd25+cd127lowcd45ra+细胞将treg群分离。因此，本发明的冷冻保存的treg群可以包含至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的cd4+cd25+cd127-、cd4+cd25+cd127low treg细胞和/或cd4+cd25+cd127lowcd45ra+treg细胞。

20、此外，冷冻保存treg群可以包含少于20％的cd8+细胞、少于10％的cd8+细胞，优选地少于5％的cd8+细胞，更优选地少于2％的cd8+细胞。在这方面，本发明的方法可以包括在转导步骤之前(即，在上述方法的步骤(a)之前，其包括将编码foxp3的多核苷酸引入treg或treg群中)耗竭cd8+细胞的步骤。

21、在第二方面，本发明提供了一种编码foxp3的外源多核苷酸在将cd62l表达保存在已经冷冻保存或用于冷冻保存的treg群或treg中的用途。特别地，如上所讨论的，外源多核苷酸被引入treg群或treg中，并且其表达对treg群或treg内的cd62l表达水平提供保护作用。

22、本发明的第三方面提供了一种冷冻保存的工程化treg群或treg，其包含编码foxp3多肽的外源多核苷酸，其中所述工程化treg群或treg在冷冻保存后具有相比于冷冻保存后的对应的非工程化treg群或treg更高的cd62l表达水平。

23、本发明还提供了一种通过本发明的方法可获得的或获得的treg群或treg(例如冷冻保存或解冻的细胞)。替代性地，本发明提供了一种解冻的treg或treg群，其包含编码foxp3多肽的外源多核苷酸，其中工程化treg或treg群在解冻后具有相比于解冻后的相应非工程化treg或treg群更高的cd62l表达水平。

24、foxp3多肽可以包含与seq id no.1或其功能片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。编码foxp3的多核苷酸可以在表达载体内。

25、该方法还可以包括将编码外源t细胞受体(tcr)的多核苷酸或者编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸引入treg群或treg中，或者冷冻保存的工程化treg群或treg可以包含编码外源t细胞受体(tcr)的多核苷酸或者编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸。编码foxp3多肽的多核苷酸和编码外源tcr或car的多核苷酸可以由单一表达载体提供。

26、tcr或car可以针对任何所需的靶分子，尤其针对在靶细胞上表达的靶分子。合适的tcr和car在下面论述。在一个实施方式中，car针对hla抗原例如hla-a2。

27、载体可以包含编码foxp3多肽的第一多核苷酸和编码外源tcr或car的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸可操作地连接至相同的启动子，并且其中所述第一多核苷酸在所述第二多核苷酸的上游。在编码foxp3的多核苷酸与编码外源tcr或car的多核苷酸之间可以存在内部自剪切序列。合适的启动子和自剪切序列在下面论述。

28、本发明的方法还可以包括将编码包含自杀部分的安全开关的多核苷酸引入treg群或treg中，或者本发明的冷冻保存的工程化treg群或treg可以包含含有自杀部分的安全开关。因此，在一个实施方式中，编码foxp3和可选的car/tcr的多核苷酸/核酸分子也可以编码包含自杀部分的安全开关。特别地，核酸分子和构建体可以被设计成在单个核酸分子或构建体中编码单独的组分(例如，三种组分(例如，foxp3、外源tcr或car、和安全开关))，使得这些组分可以在细胞中作为单独的组分，即作为离散实体(即，彼此不连接并且在物理上不同)产生。因此，由核酸分子编码的表达组分可以作为单独的和不同的或离散的功能多肽而分别位于细胞中或细胞上。这是通过在核酸分子中编码剪切序列、特别是在编码各自组分的核苷酸序列之间的自剪切序列来实现的。

29、本文公开的多核苷酸(例如，编码foxp3和/或外源tcr或car和/或安全开关)可以通过病毒转导、优选逆转录病毒或慢病毒转导，而引入treg群或treg中。

30、在第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的冷冻保存的工程化treg群或treg，或解冻的treg或treg群。

31、在第五方面，本发明提供了一种如本文所述的冷冻保存的工程化treg群或treg，如本文所述的解冻的treg或treg群或如本文所述的药物组合物，用于预防和/或治疗疾病。

32、在第六方面，本发明提供了一种如本文所述的冷冻保存的工程化treg群或treg、如本文所述的解冻的treg或treg群或如本文所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。

33、在第七方面，本发明提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括向受试者施用如本文所述的冷冻保存的工程化treg群或treg、如本文所述的解冻的treg或treg群或如本文所述的药物组合物。

34、所述疾病可以是自身免疫性疾病、过敏性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病、炎症、神经炎性疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化症(als))或代谢疾病(例如，糖尿病(例如，i型糖尿病))。本发明还涉及如本文所述的冷冻保存的工程化treg群或treg或如本文所述的药物组合物用于抑制免疫应答，或如本文所述的冷冻保存的工程化treg群或treg或药物组合物在抑制免疫应答中的用途。

35、在一个实施方式中，提供了一种与冷冻保存后的对应的非工程化treg或treg群相比提高冷冻保存后treg或treg群对次级淋巴器官的归巢能力的方法，包括在冷冻保存前将编码foxp3多肽的多核苷酸引入treg或treg群的步骤。

36、在另一实施方式中，提供了一种用于删除如本文所定义的冷冻保存的treg或treg群的方法，所述冷冻保存的treg或treg群包含核酸分子/多核苷酸、表达构建体或编码foxp3的载体，以及安全开关，该方法包括将冷冻保存的treg或treg群暴露于单独的细胞删除剂(比如，抗体)的步骤，所述细胞删除剂识别所述安全开关内的自杀部分。通过与自杀部分结合，细胞删除剂可以靶向待删除的细胞。该方法可以是体外方法。

37、本发明还可以提供一种提高在冷冻保存后treg或treg群的稳定性和/或抑制功能的方法，包括在冷冻保存前将本文提供的核酸分子/多核苷酸、表达构建体或载体引入细胞的步骤。

38、本发明的方法提供了一种离体扩增的冷冻保存的治疗treg或treg群，其在解冻后并且无需进一步扩增，保持了在冷冻保存前扩增的工程化treg或treg群中所见的高存活率、纯度和效力。因此，本发明的细胞可以用作现成的治疗剂。

39、本发明要求的保护由权利要求书限定。