工程化半乳糖氧化酶变体酶的制作方法

发明领域本发明提供了工程化半乳糖氧化酶(go酶)、具有go酶活性的多肽和编码这些酶的多核苷酸，以及载体和包含这些多核苷酸和多肽的宿主细胞。还提供了用于产生go酶的方法。本发明还提供了包含所述go酶的组合物和使用所述工程化go酶的方法。本发明在药物化合物和其他化合物的产生中特别有用。对序列表、表格或计算机程序的引用序列表的正式副本作为ascii格式的文本文件经由efs-web与说明书同时提交，文件名为“cx2-208wo1_st25.txt”，创建日期为2021年9月30日，且大小为1.26mb。经由efs-web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

背景技术：

0、发明背景

1、将醇氧化成醛是合成有机化学中所需的关键转化。有几种化学试剂能够进行这种类型的反应；然而，使用这些方法有若干缺点。化学氧化途径是非化学选择性的方法，当使用时，需要对非靶向反应性基团进行保护。这些氧化方法中的氧化状态很难控制，因为一些化学试剂能够使靶醇过氧化。另外，在氧化条件下进行的反应提供了可能导致爆炸和对人员和财产造成严重的物理伤害的危险条件。氧化试剂及其副产物是对环境有害的反应性物质。因此，本领域对产生能够进行选择性氧化化学同时减少或消除这些严重缺点的受控剂(controlled agents)仍然存在需要。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供了对伯醇具有温和氧化活性以对映选择性方式产生相应的醛的工程化半乳糖氧化酶(go酶)、多肽、和编码这些酶的多核苷酸、以及载体和包含这些多核苷酸和多肽的宿主细胞。还提供了用于产生go酶的方法。本发明还提供了包含所述go酶的组合物和使用所述工程化go酶的方法。本发明在药物化合物和其他化合物的产生中特别有用。

2、本发明提供了工程化半乳糖氧化酶，所述工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:4、6、38、50、114、226和/或262具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:4、6、38、50、114、226和/或262编号。在工程化半乳糖氧化酶的一些另外的实施方案中，多肽序列与seq id no:4具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：19/547/564、47、111、196、196/327、196/408/462、196/442、196/442/462/583、218、292、329、407、408和442，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:4编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：19f/547n/564g、47t、111e、196q、196r、196r/327l、196r/408n/462a、196r/442y、196r/442y/462a/583s、218t、218v、292r、329w、407g、408n和442y，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：c19f/i547n/w564g、n47t、t111e、e196q、e196r、e196r/r327l、e196r/d408n/g462a、e196r/f442y、e196r/f442y/g462a/t583s、r218t、r218v、s292r、l329w、q407g、d408n和f442y，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:4编号。

3、在一些另外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：291、407、437和437/486，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:6编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：291f、407e、407s、437n和437n/486v，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:6编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：y291f、q407e、q407s、l437n和l437n/k486v，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:6编号。

4、在一些此外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:38具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：8/29/192/196/274/295、8/63/224/274/291/295/296、8/173/192/224/291/295/296、8/274/291/295、29/56/192/197/219/224/291/295/296、43/192/274/291/296、56/274/291、56/274/295、63/173/192/274、63/192/295、63/291/295、111/462、173/291、197/220/426、220/295、220/375/426、220/426/567、243/274/291/295/637、291、291/408/437、291/408/462、291/429、291/437、291/437/462、291/462、297/462、408/462、437/462、438和462，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:38编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：8s/29n/192n/196e/274q/295v、8s/63t/224k/274q/291f/295v/296f、8s/173a/192n/224k/291f/295v/296f、8s/274q/291f/295v、29n/56y/192n/197r/219v/224k/291f/295v/296f、43f/192n/274q/291f/296f、56y/274q/291f、56y/274q/295v、63t/173a/192n/274q、63t/192n/295v、63t/291f/295v、111s/462a、173a/291f、197g/220v/426l、220v/295r、220v/375n/426l、220v/426l/567s、243t/274q/291f/295v/637r、291f、291f/408n/437n、291f/408n/462a、291f/429i、291f/437n、291f/437n/462a、291f/462a、297l/462a、408n/462a、437n/462a、438a和462a，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:38编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：v8s/i29n/q192n/r196e/n274q/q295v、v8s/v63t/g224k/n274q/y291f/q295v/v296f、v8s/s173a/q192n/g224k/y291f/q295v/v296f、v8s/n274q/y291f/q295v、i29n/i56y/q192n/d197r/t219v/g224k/y291f/q295v/v296f、q43f/q192n/n274q/y291f/v296f、i56y/n274q/y291f、i56y/n274q/q295v、v63t/s173a/q192n/n274q、v63t/q192n/q295v、v63t/y291f/q295v、t111s/g462a、s173a/y291f、d197g/s220v/s426l、s220v/q295r、s220v/d375n/s426l、s220v/s426l/m567s、s243t/n274q/y291f/q295v/n637r、y291f、y291f/d408n/l437n、y291f/d408n/g462a、y291f/t429i、y291f/l437n、y291f/l437n/g462a、y291f/g462a、e297l/g462a、d408n/g462a、l437n/g462a、f438a和g462a，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq idno:38编号。

5、在又一些此外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:50具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24/52/311/550、46/158/192/217/297/556、46/158/192/367/375/556、46/192、46/192/217/274/556、46/192/274/304/367/637、46/192/274/437/556、46/192/304/367、46/192/367/408、46/192/367/556、46/192/375/437、46/274/367/375/437/637、46/297/304/367/437/637、158/192/217/556、158/192/274/304、158/192/274/437/556、158/192/274/556、158/192/304/408/556/637、158/192/367/375、158/192/367/556、158/192/408/556、158/637、192、192/217/295/297/367/556、192/217/367/375/556、192/217/556、192/274、192/274/304/426、192/274/367/556、192/274/367/637、192/274/375、192/295、192/295/304、192/295/367/375、192/297/367/644、192/297/437、192/304、192/304/365/437、192/304/367、192/304/637、192/367、192/367/375/556、192/367/408/426/437/556、192/437/556、192/637、217/304/437、274/304/367/426/556、304/426/556、311/343/550、367、367/556、375、426、437和550，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:50编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24e/52l/311a/550v、46a/158e/192n/217e/297l/556k、46a/158e/192n/367l/375n/556k、46a/192n、46a/192n/217e/274q/556k、46a/192n/304e/367l、46a/192n/367l/556k、46a/274q/367l/375n/437n/637r、46a/297l/304e/367l/437n/637r、46t/192n、46t/192n/274q/304e/367l/637r、46t/192n/274q/437n/556k、46t/192n/274q/437y/556k、46t/192n/367l/408n、46t/192n/375n/437n、158e/192n/217e/556k、158e/192n/274q/304e、158e/192n/274q/437n/556k、158e/192n/274q/556k、158e/192n/304e/408n/556k/637r、158e/192n/367l/375n、158e/192n/367l/556k、158e/192n/408n/556k、158e/637r、192n、192n/217e/295v/297l/367l/556k、192n/217e/367l/375n/556k、192n/217e/556k、192n/274q、192n/274q/304e/426l、192n/274q/367l/556k、192n/274q/367l/637r、192n/274q/375n、192n/295v、192n/295v/304e、192n/295v/367l/375n、192n/297l/367l/644s、192n/297l/437n、192n/304e、192n/304e/365g/437n、192n/304e/367l、192n/304e/637r、192n/367l、192n/367l/375n/556k、192n/367l/408n/426l/437y/556k、192n/437n/556k、192n/637r、217e/304e/437n、274q/304e/367l/426l/556k、304e/426l/556k、311a/343e/550l、367l、367l/556k、375n、426l、437y和550l，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:50编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：s24e/p52l/t311a/t550v、v46a/g158e/q192n/d217e/e297l/v556k、v46a/g158e/q192n/k367l/d375n/v556k、v46a/q192n、v46a/q192n/d217e/n274q/v556k、v46a/q192n/s304e/k367l、v46a/q192n/k367l/v556k、v46a/n274q/k367l/d375n/l437n/n637r、v46a/e297l/s304e/k367l/l437n/n637r、v46t/q192n、v46t/q192n/n274q/s304e/k367l/n637r、v46t/q192n/n274q/l437n/v556k、v46t/q192n/n274q/l437y/v556k、v46t/q192n/k367l/d408n、v46t/q192n/d375n/l437n、g158e/q192n/d217e/v556k、g158e/q192n/n274q/s304e、g158e/q192n/n274q/l437n/v556k、g158e/q192n/n274q/v556k、g158e/q192n/s304e/d408n/v556k/n637r、g158e/q192n/k367l/d375n、g158e/q192n/k367l/v556k、g158e/q192n/d408n/v556k、g158e/n637r、q192n、q192n/d217e/q295v/e297l/k367l/v556k、q192n/d217e/k367l/d375n/v556k、q192n/d217e/v556k、q192n/n274q、q192n/n274q/s304e/s426l、q192n/n274q/k367l/v556k、q192n/n274q/k367l/n637r、q192n/n274q/d375n、q192n/q295v、q192n/q295v/s304e、q192n/q295v/k367l/d375n、q192n/e297l/k367l/g644s、q192n/e297l/l437n、q192n/s304e、q192n/s304e/d365g/l437n、q192n/s304e/k367l、q192n/s304e/n637r、q192n/k367l、q192n/k367l/d375n/v556k、q192n/k367l/d408n/s426l/l437y/v556k、q192n/l437n/v556k、q192n/n637r、d217e/s304e/l437n、n274q/s304e/k367l/s426l/v556k、s304e/s426l/v556k、t311a/k343e/t550l、k367l、k367l/v556k、d375n、s426l、l437y和t550l，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:50编号。

6、在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:114具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：161/564、221、263、296、308、361、373、481/597、518、537、553、564、570和596，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:114编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：161c/564s、221e、221s、263e、263v、296a、308g、361t、373r、481r/597s、518t、537v、553s、553t、564r、570r、596r和596v，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:114编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：r161c/w564s、t221e、t221s、p263e、p263v、v296a、k308g、s361t、q373r、q481r/n597s、d518t、s537v、q553s、q553t、w564r、s570r、t596r和t596v，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:114编号。

7、在一些另外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:226具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24/47/382/408/570、24/79/308/367、24/250/308/596、24/250/408/568/570、24/308/309、24/309/408/570、24/367/408/596、24/367/570、24/596、69、250、250/570、309、443和570，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq idno:226编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24d/47g/382s/408e/570t、24d/79t/308g/367l、24d/250v/308g/596v、24d/250v/408e/568q/570t、24d/308g/309m、24d/309m/408e/570t、24d/367l/408e/596v、24d/367l/570t、24d/596v、69i、250v、250v/570t、309m、443s和570t，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:226编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：s24d/n47g/a382s/d408e/s570t、s24d/q79t/k308g/k367l、s24d/k250v/k308g/t596v、s24d/k250v/d408e/s568q/s570t、s24d/k308g/t309m、s24d/t309m/d408e/s570t、s24d/k367l/d408e/t596v、s24d/k367l/s570t、s24d/t596v、l69i、k250v、k250v/s570t、t309m、h443s和s570t，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:226编号。

8、在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:262具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：239/408、318、335/408、338和408，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:262编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：239m/408d、318i、335p/408d、338a和408d，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:262编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：q239m/e408d、v318i、h335p/e408d、l338a和e408d，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:262编号。

9、在一些另外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:262具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：335/408、338和408，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:262编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：335p/408d、338a和408d，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq idno:262编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：h335p/e408d、l338a和e408d，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:262编号。

10、在一些另外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:262具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且其中工程化半乳糖氧化酶在多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：28/239、28/239/274/408、28/239/291/408、28/239/371/408、28/371、239、239/274/291/359/513、239/274/291/408、239/291/408、239/408、239/408/523、291、291/408、318、335/408、338和408，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:262编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：28g/239m、28g/239m/274n/408d、28g/239m/291y/408d、28g/239m/371i/408d、28g/371i、239l/274h/291y/408d、239l/408d、239m、239m/274n/291y/359f/513r、239m/291y/408d、239m/408d、239m/408d/523p、291y、291y/408d、318i、335p/408d、338a和408d，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:262编号。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：c28g/q239m、c28g/q239m/q274n/e408d、c28g/q239m/f291y/e408d、c28g/q239m/k371i/e408d、c28g/k371i、q239l/q274h/f291y/e408d、q239l/e408d、q239m、q239m/q274n/f291y/y359f/g513r、q239m/f291y/e408d、q239m/e408d、q239m/e408d/h523p、f291y、f291y/e408d、v318i、h335p/e408d、l338a和e408d，其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:262编号。

11、在又一些另外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与表2.1、表3.1、表4.1、表5.1、表6.1、表7.1、表8.1、表8.2和/或表8.3中列出的至少一种工程化半乳糖氧化酶变体的序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的多肽序列。在仍一些此外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:4、6、38、50、114、226和/或262中列出的至少一种工程化半乳糖氧化酶变体的序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的多肽序列。在一些实施方案中，工程化半乳糖氧化酶是seq id no:4、6、38、50、114、226和/或262中列出的变体工程化多肽。在一些此外的实施方案中，所述工程化半乳糖氧化酶包含与seq id no:4-334中的偶数编号序列中列出的至少一种工程化半乳糖氧化酶变体的序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的多肽序列。在仍一些另外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶包含seq id no:4-334中的偶数编号序列中列出的多肽序列。在一些此外的实施方案中，与野生型禾谷镰刀菌(f.graminearium)半乳糖氧化酶相比，工程化半乳糖氧化酶包含至少一种改进的特性。在一些实施方案中，改进的特性包括对底物的改进的活性。在一些另外的实施方案中，底物包括伯醇。在一些此外的实施方案中，底物包括具有一个或更多个另外的官能团的含醇底物。在一些此外的实施方案中，底物包括含醇的磷酸化底物。在又一些此外的实施方案中，改进的特性包括改进的立体选择性。在又一些另外的实施方案中，工程化半乳糖氧化酶是纯化的。

12、本发明还提供了包含至少一种本文提供的工程化半乳糖氧化酶的组合物。在一些实施方案中，组合物包含本文提供的一种工程化半乳糖氧化酶。

13、本发明还提供了编码本文提供的工程化半乳糖氧化酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码多于一种本文提供的工程化半乳糖氧化酶。本发明还提供了编码至少一种工程化半乳糖氧化酶的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列包含与seq id no:3、5、37、49、113、225和/或261的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中工程化半乳糖氧化酶的多核苷酸序列在一个或更多个位置处包含至少一个取代。在一些另外的实施方案中，编码至少一种工程化半乳糖氧化酶或其功能片段的多核苷酸序列包含与seq id no:3、5、37、49、113、225和/或261的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列可操作地连接到控制序列。在一些另外的实施方案中，多核苷酸序列是密码子优化的。在一些又另外的实施方案中，多核苷酸包含seq id no:1-333中的奇数编号序列。本发明还提供了包含编码本文提供的至少一种半乳糖氧化酶的至少一种多核苷酸序列的表达载体。本发明还提供了包含本文提供的至少一种表达载体的宿主细胞。本发明还提供了包含至少一种编码本文提供的至少一种半乳糖氧化酶的多核苷酸序列的宿主细胞。

14、本发明还提供了在宿主细胞中产生工程化半乳糖氧化酶的方法，该方法包括在合适的条件下培养宿主细胞，从而产生本文提供的至少一种工程化半乳糖氧化酶。在一些实施方案中，该方法还包括从培养物和/或宿主细胞回收至少一种工程化半乳糖氧化酶。在一些另外的实施方案中，该方法还包括纯化本文提供的至少一种工程化半乳糖氧化酶的步骤。

15、发明描述

16、本发明提供了对伯醇(例如2-乙炔基甘油)和具有另外的官能团的含醇底物(包括含醇磷酸化底物(例如2-磷酸乙炔基甘油))具有选择性氧化活性的工程化半乳糖氧化酶(go酶)、多肽、和编码这些酶的多核苷酸、以及载体和包含这些多核苷酸和多肽的宿主细胞。这些go酶变体以选择性方式起作用，使对非靶向醇的官能团保护操作的需要最小化，以及提供期望的醛立体异构体(例如，r-对映体)。还提供了用于产生go酶的方法。本发明还提供了包含所述go酶的组合物和使用所述工程化go酶的方法。本发明在药物化合物和其他化合物的产生中特别有用。

17、除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。通常，本文使用的命名法和下文描述的细胞培养、分子遗传学、微生物学、有机化学、分析化学和核酸化学中的实验程序是本领域熟知的并且普遍地采用的那些。这样的技术是熟知的，并且在本领域技术人员熟知的许多教科书和参考著作中进行了描述。对于化学合成和化学分析使用了标准技术或其修改形式。本文(上文和下文两者)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，特此通过引用明确并入本文。

18、尽管本发明的实践中可使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何合适的方法和材料，但本文也描述了一些方法和材料。应理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以根据本领域技术人员使用它们的情况而改变。因此，下文紧接着定义的术语通过参考本发明作为整体而被更充分地描述。

19、应理解，上文的一般描述和下文的详细描述仅是示例性的和说明性的，而不是限制本发明。本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。数值范围包括限定该范围的数字。因此，本文公开的每个数值范围意图涵盖落在这样的较宽数值范围内的每个较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文被全部明确地书写。还意图本文公开的每个最大的(或最小的)数值限制包括每个较低(或较高)的数值限制，如同这样的较低(或较高)数值限制在本文被明确地书写。

20、缩写

21、用于遗传编码的氨基酸的缩写是常规的，并且如下：丙氨酸(ala或a)、精氨酸(arg或r)、天冬酰胺(asn或n)、天冬氨酸(asp或d)、半胱氨酸(cys或c)、谷氨酸(glu或e)、谷氨酰胺(gln或q)、组氨酸(his或h)、异亮氨酸(ile或i)、亮氨酸(leu或l)、赖氨酸(lys或k)、甲硫氨酸(met或m)、苯丙氨酸(phe或f)、脯氨酸(pro或p)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、色氨酸(trp或w)、酪氨酸(tyr或y)和缬氨酸(val或v)。

22、当使用三字母缩写时，除非前面具体地有“l”或“d”，或者从使用缩写的上下文清楚看出，否则氨基酸可以是关于α-碳(cα)的l-构型或d-构型。例如，“ala”表示丙氨酸而不指定关于α-碳的构型，而“d-ala”和“l-ala”分别表示d-丙氨酸和l-丙氨酸。当使用单字母缩写时，大写字母表示关于α-碳的l-构型的氨基酸，并且小写字母表示关于α-碳的d-构型的氨基酸。例如，“a”表示l-丙氨酸并且“a”表示d-丙氨酸。当多肽序列以一串单字母或三字母缩写(或其混合)呈现时，根据常规惯例将序列呈现为氨基(n)至羧基(c)方向。

23、用于遗传编码核苷的缩写是常规的并且如下：腺苷(a)；鸟苷(g)；胞苷(c)；胸苷(t)；和尿苷(u)。除非具体描述，否则缩写的核苷可以是核糖核苷或2’-脱氧核糖核苷。核苷可以单独地或总体地指定为核糖核苷或2’-脱氧核糖核苷。当核酸序列以单字母缩写串表示时，序列按照常规惯例呈现为5’至3’方向，并且不示出磷酸。

24、定义

25、参考本发明，本文描述中使用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有具体定义。因此，以下术语旨在具有以下含义。

26、除非上下文另外清楚地指示，否则如本文使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如对“多肽(a polypeptide)”的提及包括多于一种多肽。

27、类似地，“包含(comprise、comprises、comprising)”、“包括(include、includes和including)”是可互换的，而不意图是限制性的。因此，如本文使用的，术语“包含(comprising)”及其同根词以其包含性含义被使用(即，等同于术语“包括(including)”及其相应的同根词)。

28、还应当理解，在各种实施方案的描述中使用术语“包含(comprising)”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用“基本上由...组成(consistingessentially of)”或“由...组成(consisting of)”的语言可选择地描述实施方案。

29、如本文使用的，术语“约”意指特定值的可接受误差。在一些实例中，“约”意指在给定值范围的0.05％、0.5％、1.0％或2.0％内。在一些实例中，“约”意指在给定值的1、2、3或4个标准偏差内。

30、如本文使用的，“ec”编号是指生物化学和分子生物学国际联合命名委员会(nomenclature committee of the international union of biochemistryandmolecular biology)(nc-iubmb)的酶命名法。该iubmb生化分类是基于酶催化的化学反应的酶数字分类系统。

31、如本文使用的，“atcc”是指美国典型培养物保藏中心(american typeculturecollection)，其生物保藏收集物包括基因和菌株。

32、如本文使用的，“ncbi”是指美国国家生物信息中心(national centerforbiological information)和其中提供的序列数据库。

33、如本文使用的，“半乳糖氧化酶”(“go酶”；ec 1.1.3.9)是铜依赖性酶，其在存在双分子氧的情况下，催化伯醇和具有另外的官能团的含醇底物(诸如含醇磷酸化底物)氧化成相应的醛或磷酸醛。它们以既区域特异性又对映体特异性的方式选择性地起作用，导致合成方法需要很少或不需要官能团保护，并产生期望的立体异构体。氧化的方式是温和且受控的，使得活性不会导致醇过氧化成其相应的羧酸。术语“半乳糖氧化酶”包括天然存在的酶和工程化的酶两者，并且可以包括与天然存在的或工程化的参考多肽相比具有改变的催化特性(包括比活性、底物特异性等的变化)的多肽。

34、如本文使用的，“辣根过氧化物酶”(hrp，ec 1.11.1.7)是铁依赖性酶，其通过使正常go酶催化循环期间发生的活性位点的非活性氧化还原状态氧化来激活和维持go酶催化活性。在本文所包括的实例中，i型hrp以催化方式被特定使用，然而这并不意味着该作用是排他的，因为存在这种酶类的其他亚型和可以实现这种作用的化学试剂。

35、如本文使用的，“过氧化氢酶”是指作用于过氧化氢的铁依赖性酶(ec1.11.1.6)，过氧化氢是go酶氧化的副产物，其可使go酶在过氧化氢超过一定水平时失活。具体地，在本文的实施例中，过氧化氢酶被用作催化维持酶，而在一些实施方案中，它可以被其他方法(诸如过氧化氢的电化学分解)替代。

36、“氨基酸”通过其通常已知的三字母符号或通过iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号在本文被提及。同样地，核苷酸可以通过其通常可接受的单字母代码被提及。

37、如本文使用的，“亲水氨基酸或残基”是指根据eisenberg等人(eisenberg等人,j.mol.biol.,179:125-142[1984])的归一化共有疏水性标度，具有表现出小于零的疏水性的侧链的氨基酸或残基。遗传编码的亲水氨基酸包括l-thr(t)、l-ser(s)、l-his(h)、l-glu(e)、l-asn(n)、l-gln(q)、l-asp(d)、l-lys(k)和l-arg(r)。

38、如本文使用的，“酸性氨基酸或残基”是指当氨基酸被包含在肽或多肽中时，具有表现出小于约6的pka值的侧链的亲水氨基酸或残基。由于失去氢离子，酸性氨基酸在生理ph通常具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括l-glu(e)和l-asp(d)。

39、如本文使用的，“碱性氨基酸或残基”是指当氨基酸被包含在肽或多肽中时，具有表现出大于约6的pka值的侧链的亲水氨基酸或残基。由于与水合氢离子的缔合，碱性氨基酸在生理ph通常具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括l-arg(r)和l-lys(k)。

40、如本文使用的，“极性氨基酸或残基”是指具有在生理ph不带电荷但具有其中两个原子共同共有的电子对被其中一个原子更紧密地保持(heldmore closely)的至少一个键的侧链的亲水氨基酸或残基。遗传编码的极性氨基酸包括l-asn(n)、l-gln(q)、l-ser(s)和l-thr(t)。

41、如本文使用的，“疏水氨基酸或残基”是指根据eisenberg等人(eisenberg等人,j.mol.biol.,179:125-142[1984])的归一化共有疏水性标度，具有表现出大于零的疏水性的侧链的氨基酸或残基。遗传编码的疏水氨基酸包括l-pro(p)、l-ile(i)、l-phe(f)、l-val(v)、l-leu(l)、l-trp(w)、l-met(m)、l-ala(a)和l-tyr(y)。

42、如本文使用的，“芳香族氨基酸或残基”是指具有包含至少一个芳香族环或杂芳香族环的侧链的亲水或疏水氨基酸或残基。遗传编码的芳香族氨基酸包括l-phe(f)、l-tyr(y)和l-trp(w)。尽管由于其杂芳香族氮原子的pka，l-his(h)有时被归类为碱性残基，或因为其侧链包括杂芳香族环而被归类为芳香族残基，但在本文中，组氨酸被归类为亲水残基或为“受限残基(constrained residue)”(参见下文)。

43、如本文使用的，“受限氨基酸或残基”是指具有受限几何形状的氨基酸或残基。本文中，受限残基包括l-pro(p)和l-his(h)。组氨酸具有受限的几何形状，因为它具有相对小的咪唑环。脯氨酸具有受限的几何形状，因为它也具有五元环。

44、如本文使用的，“非极性氨基酸或残基”是指具有在生理ph不带电荷并具有其中两个原子共同共有的电子对通常由两个原子各自同等地保持(即侧链不是极性的)的键的侧链的疏水氨基酸或残基。遗传编码的非极性氨基酸包括l-gly(g)、l-leu(l)、l-val(v)、l-ile(i)、l-met(m)和l-ala(a)。

45、如本文使用的，“脂肪族氨基酸或残基”是指具有脂肪族烃侧链的疏水氨基酸或残基。遗传编码的脂肪族氨基酸包括l-ala(a)、l-val(v)、l-leu(l)和l-ile(i)。值得注意的是，半胱氨酸(或“l-cys”或“[c]”)是不常见的，因为它可以与其他l-cys(c)氨基酸或其他含磺酰基或巯基的氨基酸形成二硫桥。“半胱氨酸样残基”包括半胱氨酸和含有可用于形成二硫桥的巯基部分的其他氨基酸。l-cys(c)(和具有含-sh侧链的其他氨基酸)以还原的游离-sh或氧化的二硫桥接形式存在于肽中的能力影响l-cys(c)对肽贡献净疏水特征还是亲水特征。虽然根据eisenberg的归一化共有标度(eisenberg等人，1984，上文)，l-cys(c)表现出0.29的疏水性，但是应当理解，为了本公开内容的目的，l-cys(c)被分类为其自身独特的组。

46、如本文使用的，“小氨基酸或残基”是指具有包括总计三个或更少的碳原子和/或杂原子(不包括α-碳和氢)的侧链的氨基酸或残基。根据上文的定义，小氨基酸或残基可以被进一步分类为脂肪族、非极性、极性或酸性小氨基酸或残基。遗传编码的小氨基酸包括l-ala(a)、l-val(v)、l-cys(c)、l-asn(n)、l-ser(s)、l-thr(t)和l-asp(d)。

47、如本文使用的，“含羟基的氨基酸或残基”是指含有羟基(-oh)部分的氨基酸。遗传编码的含羟基的氨基酸包括l-ser(s)、l-thr(t)和l-tyr(y)。

48、如本文使用的，“多核苷酸”和“核酸”是指共价连接在一起的两个或更多个核苷酸。多核苷酸可以完全包含核糖核苷酸(即rna)、完全包含2’脱氧核糖核苷酸(即dna)或包含核糖核苷酸和2’脱氧核糖核苷酸的混合物。虽然核苷通常将经由标准磷酸二酯键连接在一起，但多核苷酸可以包含一个或更多个非标准键。多核苷酸可以是单链或双链的，或者可以包含单链区域和双链区域二者。此外，虽然多核苷酸通常将包含天然存在的编码核苷碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)，但它还可以包含一种或更多种经修饰和/或合成的核苷碱基，诸如例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤等。在一些实施方案中，这样的经修饰或合成的核苷碱基是编码氨基酸序列的核苷碱基。

49、如本文使用的，“编码序列”是指核酸(例如基因)编码蛋白的氨基酸序列的部分。

50、如本文使用的，术语“生物催化(biocatalysis)”、“生物催化(biocatalytic)”、“生物转化”和“生物合成”是指使用酶来对有机化合物进行化学反应。

51、如本文使用的，“野生型”和“天然存在的”指在自然界中发现的形式。例如，野生型多肽或多核苷酸序列为生物体中存在的序列，其可从天然来源分离且未通过人为操作被有意识地修饰。

52、如本文使用的，当关于细胞、核酸或多肽使用时，“重组”、“工程化”、“变体”和“非天然存在的”是指已经以自然界原本不存在的方式修饰的材料或相应于该材料的天然或自然形式的材料。在一些实施方案中，该细胞、核酸或多肽与天然存在的细胞、核酸或多肽相同，但由合成材料和/或通过使用重组技术操纵产生或衍生。非限制性实例包括，除其他以外，表达自然(非重组)形式的细胞中未发现的基因或表达原本以不同水平表达的自然基因的重组细胞。

53、术语“序列同一性百分比(％)”在本文中用于指多核苷酸或多肽之间的比较，并通过比较比较窗中两条最佳对齐的序列确定，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参考序列相比可以包含添加或缺失(即，空位)，以用于两个序列的最佳对齐。百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。可选择地，百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员理解，存在许多可用于比对两个序列的已建立的算法。用于比较的序列的最佳比对可以通过任何合适的方法进行，包括但不限于smith和waterman的局部同源性算法(smith和waterman,adv.appl.math.,2:482[1981])，通过needleman和wunsch的同源性比对算法(needleman和wunsch,j.mol.biol.,48:443[1970])，通过pearson和lipman的相似性搜索方法(pearson和lipman,proc.natl.acad.sci.usa 85:2444[1988])，通过这些算法的计算机化实现(例如，gcg wisconsin软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta)，或者通过目视检查，如本领域已知的。适合于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例包括但不限于blast和blast 2.0算法，由altschul等人描述(分别参见altschul等人,j.mol.biol.,215:403-410[1990]；和altschul等人,nucl.acids res.,3389-3402[1977])。公众可通过美国国家生物技术信息中心网站获得用于进行blast分析的软件。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度w的短字来鉴定高评分序列对(hsp)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值的阀值评分t。t被称为邻近字评分阈值(参见，altschul等人，上文)。这些最初的邻近字击中(word hit)充当启动搜索的种子以找到包含它们的更长hsp。然后字击中沿着每个序列的两个方向延伸直到累积比对评分不能增加的程度。对于核苷酸序列，累积评分使用参数m(用于匹配残基对的奖励评分；总是＞0)和n(用于错配残基的惩罚评分；总是＜0)计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积评分。在以下情况时，停止字击中在每一个方向的延伸：累积比对评分从其最大达到值下降了量x；由于累积了一个或更多个负评分残基比对，累积得分达到0或小于0；或到达任一序列末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度。blastn程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认值：字长(w)为11、期望值(e)为10、m＝5、n＝-4、以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序使用以下作为默认值：字长(w)为3，期望值(e)为10和blosum62评分矩阵(参见，henikoff和henikoff,proc.natl.acad.sci.usa 89:10915[1989])。序列比对与％序列同一性的示例性确定可以使用gcg wisconsin软件包(accelrys,madison wi)中的bestfit或gap程序，使用提供的默认参数。

54、如本文使用的，“参考序列”是指用作序列和/或活性比较的基础的定义序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段。通常，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基的长度、至少25个残基的长度、至少50个残基的长度、至少100个残基的长度或核酸或多肽的全长。因为两个多核苷酸或多肽可以各自(1)包含在两个序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)，和(2)可以还包含在两个序列之间趋异的(divergent)序列，所以两个(或更多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过比较两个多核苷酸或多肽在“比较窗”上的序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。在一些实施方案中，“参考序列”可以基于一级氨基酸序列，其中参考序列是可以在一级序列中具有一个或更多个变化的序列。

55、如本文使用的，“比较窗”是指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念性区段，其中序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参考序列进行比较，并且其中序列在比较窗中的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包含20％或更少的添加或缺失(即，空位)以用于两个序列的最佳比对。比较窗可以比20个连续残基更长，并任选地包括30、40、50、100或更长的窗。

56、如本文使用的，当在对给定氨基酸或多核苷酸序列进行编号的上下文中使用时，“对应于”、“参考”和“相对于”是指当给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比较时对指定参考序列的残基进行编号。换言之，给定聚合物的残基编号或残基位置关于参考序列被指定，而不是通过给定氨基酸或多核苷酸序列内残基的实际数字位置被指定。例如，给定氨基酸序列，诸如工程化半乳糖氧化酶的氨基酸序列可以通过引入空位以与参考序列对齐，来优化两个序列之间的残基匹配。在这些情况中，尽管存在空位，但对给定氨基酸或多核苷酸序列中的残基关于与其比对的参考序列进行编号。

57、如本文使用的，“大体同一性”是指在至少20个残基位置的比较窗中、通常在至少30个-50个残基窗中，与参考序列相比，具有至少80％序列同一性、至少85％同一性、至少89％至95％之间序列同一性，或更通常至少99％序列同一性的多核苷酸或多肽序列，其中序列同一性的百分比通过在比较窗上比较参考序列和包含总计为参考序列的20％或更少的缺失或添加的序列来计算。在应用于多肽的一些具体实施方案中，术语“大体同一性”意指当诸如通过程序gap或bestfit使用默认空位权重进行最佳比对时，两个多肽序列共享至少80％的序列同一性，优选地至少89％的序列同一性、至少95％的序列同一性或更高(例如，99％的序列同一性)。在一些实施方案中，在所比较的序列中不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。

58、如本文使用的，“氨基酸差异”和“残基差异”是指在多肽序列的一个位置处氨基酸残基相对于参考序列中对应位置处的氨基酸残基的差异。在一些情况下，参考序列具有组氨酸标签，但相对于没有组氨酸标签的等同参考序列，编号维持不变。本文中氨基酸差异的位置通常被称为“xn”，其中n是指残基差异所基于的参考序列中的对应位置。例如，“与seqid no:4相比位置x93处的残基差异”是指对应于seq id no:4的位置93的多肽位置处的氨基酸残基的差异。因此，如果参考多肽seq id no:4在位置93处具有丝氨酸，则“与seq idno:4相比位置x93处的残基差异”是指在对应于seq id no:4的位置93的多肽位置处的除了丝氨酸以外的任何残基的氨基酸取代。在本文的大多数实例中，在一个位置处的具体氨基酸残基差异指示为“xny”，其中“xn”指定如上文描述的对应位置，并且“y”是在工程化多肽中发现的氨基酸(即，与参考多肽中不同的残基)的单字母标识符。在一些实例中(例如，在实施例中呈现的表格中)，本发明还提供由常规符号“anb”表示的具体氨基酸差异，其中a为参考序列中的残基的单字母标识符，“n”为参考序列中的残基位置的编号，并且b为工程化多肽的序列中残基取代的单字母标识符。在一些实例中，本发明的多肽可以相对于参考序列包含一个或更多个氨基酸残基差异，其由相对于参考序列存在残基差异的一列指定位置指示。在一些实施方案中，在多于一个氨基酸可以用于多肽的具体残基位置中时，可以使用的各种氨基酸残基由“/”分开(例如，x307h/x307p或x307h/p)。斜线也可用于指示给定变体内的多于一个取代(即，在给定序列中诸如在组合变体中存在多于一个取代)。在一些实施方案中，本发明包括含有一个或更多个氨基酸差异的工程化多肽序列，所述氨基酸差异包括保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。在一些另外的实施方案中，本发明提供了包含保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代二者的工程化多肽序列。

59、如本文使用的，“保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的不同残基取代残基，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。例如但不限于，在一些实施方案中，具有脂肪族侧链的氨基酸被另一种脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)取代；具有羟基侧链的氨基酸被另一种具有羟基侧链的氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)取代；具有芳香族侧链的氨基酸被另一种具有芳香族侧链的氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)取代；具有碱性侧链的氨基酸被另一种具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸和精氨酸)取代；具有酸性侧链的氨基酸被另一种具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代；和/或疏水氨基酸或亲水氨基酸分别被另一种疏水氨基酸或亲水氨基酸取代。

60、如本文使用的，“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链性质的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以使用定义的组之间而不是之内的氨基酸，并且影响(a)取代区域中的肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链体积。例如但不限于，示例性非保守取代可以是用碱性或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳香族氨基酸；和用疏水氨基酸取代亲水氨基酸。

61、如本文使用的，“缺失”是指通过从参考多肽去除一个或更多个氨基酸对多肽进行的修饰。缺失可以包括去除1个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或者20个或更多个氨基酸、多达组成参考酶的氨基酸总数的10％或多达氨基酸总数的20％，同时保留酶活性和/或保留工程化半乳糖氧化酶的改进的性质。缺失可以涉及多肽的内部部分和/或末端部分。在多种实施方案中，缺失可以包括连续的区段或可以是不连续的。氨基酸序列中的缺失通常用“-”表示。

62、如本文使用的，“插入”是指通过将一个或更多个氨基酸添加到参考多肽对多肽进行的修饰。插入可以处于多肽的内部部分或者可以是插入到羧基或氨基末端。如本文使用的插入包括如本领域已知的融合蛋白。插入可以是氨基酸的连续区段或由天然存在的多肽中的一个或更多个氨基酸分开。

63、术语“氨基酸取代集”或“取代集”是指与参考序列相比，多肽序列中的一组氨基酸取代。取代集可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，取代集是指在实施例中提供的表格中列出的任何变体半乳糖氧化酶中存在的氨基酸取代的集合。

64、“功能片段”和“生物活性片段”在本文可互换使用，以指如下多肽：所述多肽具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失和/或内部缺失，但其中剩余的氨基酸序列与和它进行比较的序列(例如，本发明的全长工程化半乳糖氧化酶)中的对应位置相同，并且保留全长多肽的基本上全部活性。

65、如本文使用的，“分离的多肽”是指与天然伴随其的其他污染物(例如，蛋白、脂质和多核苷酸)基本上分开的多肽。该术语包括已经从它们天然存在的环境或表达系统(例如，在宿主细胞内或经由体外合成)中取出或纯化的多肽。重组半乳糖氧化酶多肽可以存在于细胞内，存在于细胞培养基中，或以各种形式(诸如裂解物或分离的制品)制备。因此，在一些实施方案中，重组半乳糖氧化酶可以是分离的多肽。

66、如本文使用的，“基本上纯的多肽”或“纯化的蛋白”是指如下组合物，在所述组合物中多肽物质是存在的主要物质(即，在摩尔或重量基础上，它比该组合物中的任何其他单独的大分子物质更丰富)，并且当目标物质构成存在的大分子物质的按摩尔或％重量计至少约50％时，通常是基本上纯化的组合物。然而，在一些实施方案中，包含半乳糖氧化酶的组合物包含少于50％纯的(例如，约10％、约20％、约30％、约40％或约50％)的半乳糖氧化酶。通常，基本上纯的半乳糖氧化酶组合物构成该组合物中存在的所有大分子物质的按摩尔或％重量计约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多以及约98％或更多。在一些实施方案中，将目标物质纯化至基本同质(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测出污染物物质)，其中该组合物基本上由单一大分子物质组成。溶剂物质、小分子(<500道尔顿)和元素离子物质不被认为是大分子物质。在一些实施方案中，分离的重组半乳糖氧化酶多肽为基本上纯的多肽组合物。

67、如本文使用的，“改进的酶性质”是指酶的至少一种改进的性质。在一些实施方案中，本发明提供了与参考半乳糖氧化酶多肽和/或野生型半乳糖氧化酶多肽和/或另一种工程化半乳糖氧化酶多肽相比表现出任何酶性质的改进的工程化半乳糖氧化酶多肽。因此，可以确定并比较各种半乳糖氧化酶多肽，包括野生型以及工程化半乳糖氧化酶之间的“改进”的水平。改进的性质包括但不限于诸如以下的性质：增加的蛋白表达、增加的热活性、增加的热稳定性、增加的ph活性、增加的稳定性、增加的酶活性、增加的底物特异性或亲和力、增加的比活性、增加的对底物或终产物抑制的抗性、增加的化学稳定性、改进的化学选择性、改进的溶剂稳定性、增加的对酸性ph的耐受性、增加的对蛋白水解活性的耐受性(即，降低的对蛋白水解的敏感性)、降低的聚集、增加的溶解度和改变的温度谱(temperatureprofile)。在另外的实施方案中，该术语用于指半乳糖氧化酶的至少一种改进的性质。在一些实施方案中，本发明提供了与参考半乳糖氧化酶多肽和/或野生型半乳糖氧化酶多肽和/或另一种工程化半乳糖氧化酶多肽相比表现出任何酶性质的改进的工程化半乳糖氧化酶多肽。因此，可以确定并比较各种半乳糖氧化酶多肽，包括野生型以及工程化半乳糖氧化酶之间的“改进”的水平。

68、如本文使用的，“增加的酶活性”和“增强的催化活性”是指工程化多肽的改进的性质，可以被表示为与参考酶相比，比活性(例如，产生的产物/时间/重量蛋白)的增加或将底物转化成产物的转化百分比(例如，在指定的时间段使用指定量的酶，将起始量的底物转化成产物的转化百分比)的增加。在一些实施方案中，这些术语是指本文提供的工程化半乳糖氧化酶多肽的改进的性质，可以被表示为与参考半乳糖氧化酶相比，比活性(例如，产生的产物/时间/重量蛋白)的增加或将底物转化成产物的转化百分比(例如在指定时间段使用指定量的半乳糖氧化酶，将起始量的底物转化成产物的转化百分比)的增加。在一些实施方案中，这些术语用于指本文提供的改进的半乳糖氧化酶。在实施例中提供了确定本发明的工程化半乳糖氧化酶的酶活性的示例性方法。可以影响与酶活性相关的任何性质，包括典型的酶性质km、vmax或kcat，它们的变化可以导致增加的酶活性。例如，酶活性的改进可以是对应野生型酶的酶活性的约1.1倍到相比于天然存在的半乳糖氧化酶或半乳糖氧化酶多肽所源自的另一种工程化半乳糖氧化酶的多达2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更大的酶活性。

69、如本文使用的，“转化”是指将底物酶促转化(或生物转化)成对应的产物。“转化百分比”是指在指定条件下在一定时间段内被转化成产物的底物的百分比。因此，半乳糖氧化酶多肽的“酶活性”或“活性”可以被表示为在特定时间段内底物转化成产物的“转化百分比”。

70、具有“通用型特性(generalist properties)”的酶(或“通用型酶”)指与亲本序列相比，对宽范围的底物表现出改进的活性的酶。通用型酶不必对每种可能的底物表现出改进的活性。在一些实施方案中，本发明提供了具有通用型特性的半乳糖氧化酶变体，因为它们相对于亲本基因对宽范围的空间和电子不同的底物表现出相似或改进的活性。另外，本文提供的通用型酶被工程化为跨越宽范围的不同的分子被改进以增加代谢物/产物的产生。

71、术语“严格杂交条件”在本文中用于指在该条件下核酸杂交体是稳定的条件。如本领域技术人员已知的，杂交体的稳定性反映在杂交体的解链温度(tm)中。通常，杂交体的稳定性随着离子强度、温度、g/c含量和离液剂的存在而变化。多核苷酸的tm值可以使用用于预测解链温度的已知方法来计算(参见例如baldino等人,meth.enzymol.,168:761-777[1989]；bolton等人,proc.natl.acad.sci.usa 48:1390[1962]；bresslauer等人,proc.natl.acad.sci.usa 83:8893-8897[1986]；freier等人,proc.natl.acad.sci.usa83:9373-9377[1986]；kierzek等人,biochem.,25:7840-7846[1986]；rychlik等人,nucl.acids res.,18:6409-6412[1990](勘误,nucl.acids res.,19:698[1991])；sambrook等人,上文；suggs等人,1981,在developmental biologyusing purified genes中,brown等人.[编著],第683-693页,academic press,cambridge,ma[1981]；以及wetmur,crit.rev.biochem.mol.biol.26:227-259[1991])。在一些实施方案中，多核苷酸编码本文公开的多肽，并且在限定的条件下，诸如中度严格或高度严格条件下，与编码本发明的工程化半乳糖氧化酶的序列的互补序列杂交。

72、如本文使用的，“杂交严格性”是指核酸杂交中的杂交条件，诸如洗涤条件。通常，杂交反应在较低严格性的条件下进行，随后是不同的但较高严格性的洗涤。术语“中度严格杂交”是指允许靶dna结合以下互补核酸的条件，所述互补核酸与靶dna具有约60％同一性，优选地约75％同一性，约85％同一性，与靶多核苷酸具有大于约90％同一性。示例性中度严格条件是等同于在50％甲酰胺、5×denhart溶液、5×sspe、0.2％sds中在42℃杂交，随后在0.2×sspe、0.2％sds中在42℃洗涤的条件。“高严格性杂交”通常是指与如对限定的多核苷酸序列在溶液条件下确定的热解链温度tm相差约10℃或更小的条件。在一些实施方案中，高严格性条件是指仅允许在0.018m nacl中在65℃形成稳定杂交体的那些核酸序列的杂交的条件(即，如果杂交体在0.018m nacl中在65℃是不稳定的，它在如本文预期的高严格性条件下将是不稳定的)。可以提供高严格性条件，例如，通过在等同于50％甲酰胺、5×denhart溶液、5×sspe、0.2％sds在42℃的条件杂交，然后在0.1×sspe和0.1％sds中在65℃洗涤提供。另一种高严格性条件是在等同于在含有0.1％(w/v)sds的5x ssc中在65℃杂交的条件进行杂交和在含有0.1％sds的0.1×ssc中在65℃洗涤。其他高严格性杂交条件以及中度严格条件在上文引用的参考文献中描述。

73、如本文使用的，“密码子优化的”是指编码蛋白的多核苷酸的密码子改变为在特定生物体中优先使用的那些密码子，使得编码的蛋白在感兴趣的生物体中有效地表达。尽管遗传密码是简并的，即大多数氨基酸由被称为“同义”(“synonyms”)或“同义”(“synonymous”)密码子的若干密码子代表，但熟知的是，特定生物体的密码子使用是非随机的和对于特定的密码子三联体是有偏倚的。就给定基因、具有共同功能或祖先起源的基因、高表达的蛋白对比低拷贝数蛋白和生物体的基因组的聚集蛋白编码区而言，这种密码子使用偏倚可能更高。在一些实施方案中，可以对编码半乳糖氧化酶的多核苷酸进行密码子优化，用于在选择用于表达的宿主生物体中的优化产生。

74、如本文使用的，“优选的”、“最佳的”、和“高密码子使用偏倚”密码子在单独或组合使用时，可以互换地指在蛋白编码区中的以高于编码相同氨基酸的其他密码子的频率使用的密码子。优选的密码子可以根据单个基因、具有共同功能或起源的一组基因、高表达基因中的密码子使用、整个生物体的聚集蛋白编码区中的密码子频率、相关生物体的聚集蛋白编码区中的密码子频率，或它们的组合来确定。其频率随着基因表达的水平而增加的密码子通常是用于表达的最佳密码子。用于确定特定生物体中密码子频率(例如密码子使用、相对同义密码子使用)和密码子偏好的各种方法是已知的，包括多变量分析，例如使用聚类分析或相关性分析，和基因中使用的密码子的有效数目(参见例如，gcg codonpreference,genetics computergroup wisconsin package；codonw,peden,university ofnottingham；mcinerney,bioinform.,14:372-73[1998]；stenico等人,nucl.acids res.,222437-46[1994]；以及wright,gene 87:23-29[1990])。许多不同的生物体的密码子使用表是可用的(参见例如，wada等人,nucl.acids res.,20:2111-2118[1992]；nakamura等人,nucl.acids res.,28:292[2000]；duret等人,上文；henaut和danchin,于escherichia coli and salmonella中,neidhardt等人.(编著),asm press,washington d.c.,第2047-2066页[1996])。用于获得密码子使用的数据源可以依赖于能够编码蛋白的任何可获得的核苷酸序列。这些数据集包括实际已知编码表达的蛋白的核酸序列(例如，完整的蛋白编码序列-cds)、表达的序列标签(ests)，或基因组序列的预测编码区(参见例如，mount,bioinformatics:sequence and genomeanalysis,第8章,cold spring harborlaboratory press,cold spring harbor,n.y.[2001]；uberbacher,meth.enzymol.,266:259-281[1996]；以及tiwari等人,comput.appl.biosci.,13:263-270[1997])。

75、如本文使用的，“控制序列”包括对本发明的多核苷酸和/或多肽的表达是必需或有利的所有组分。每一个控制序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外来的。这样的控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列、起始序列和转录终止子。在最小程度上，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。控制序列可以与接头一起被提供，以用于导入促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区域的连接的特定限制性位点的目的。

76、“可操作地连接”在本文被定义为如下配置：在所述配置中控制序列适当地放置(即，以功能关系)在相对于感兴趣的多核苷酸的位置处，使得控制序列指导或调节感兴趣的多核苷酸和/或多肽的表达。

77、“启动子序列”指被宿主细胞识别用于感兴趣的多核苷酸诸如编码序列的表达的核酸序列。启动子序列包括介导感兴趣的多核苷酸的表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因来获得。

78、措辞“合适的反应条件”是指酶促转化反应溶液中的那些条件(例如，酶载量、底物载量、温度、ph、缓冲液、助溶剂等的范围)，在所述条件下本发明的半乳糖氧化酶多肽能够将底物转化为期望的产物化合物。在本文提供了一些示例性的“合适的反应条件”。

79、如本文使用的，“载量”，诸如在“化合物载量”或“酶载量”中，指在反应起始时组分在反应混合物中的浓度或量。

80、如本文使用的，在酶促转化反应过程上下文中的“底物”是指本文提供的工程化酶(例如，工程化半乳糖氧化酶多肽)所作用于的化合物或分子。

81、如本文使用的，当反应中存在的特定组分(例如，半乳糖氧化酶)导致与在相同条件下用相同的底物和其他取代物但不存在感兴趣的组分进行的反应相比更多的产物产生时，出现反应中产物(例如，3-磷酸乙炔基甘油醛的r-对映体)产量的“增加”。

82、如果与参与催化反应的其他酶相比，特定酶的量少于约2％、约1％、或约0.1％(wt/wt)，则该反应被称为“基本上不含”该酶。

83、如本文使用的，使液体(例如，培养肉汤)“分级分离”意指应用分离过程(例如，盐沉淀、柱色谱、尺寸排阻和过滤)或这些过程的组合以提供这样的溶液：其中期望的蛋白占溶液中的总蛋白的百分比比在初始液体产物中的更大。

84、如本文使用的，“起始组合物”是指包含至少一种底物的任何组合物。在一些实施方案中，起始组合物包含任何合适的底物。

85、如本文使用的，在酶促转化过程的上下文中的“产物”是指从酶多肽对底物的作用产生的化合物或分子。

86、如本文使用的，“平衡”如本文使用的是指在化学或酶促反应(例如，两种物质a和b的相互转化)中导致化学物质稳定状态浓度的过程，包括立体异构体的相互转化，由化学或酶促反应的正向速率常数和反向速率常数确定。

87、如本文使用的，“辅因子”是指催化反应中与酶组合作用的非蛋白化合物。

88、如本文使用的，“烷基(alkyl)”是指具有从1至18个碳原子(包括端点)的，直链的或支链的，更优选地从1个至8个碳原子(包括端点)，并且最优选地1个至6个碳原子(包括端点)的饱和烃基团。具有指定数目的碳原子的烷基在括号中表示(例如(c1-c4)烷基是指1个至4个碳原子的烷基)。

89、如本文使用的，“烯基”是指具有从2个至12个碳原子(包括端点)的、直链或支链的、包含至少一个双键但任选地包含多于一个双键的基团。

90、如本文使用的，“炔基”是指具有从2个至12个碳原子(包括端点)的、直链或支链的、包含至少一个三键但任选地包含多于一个三键，并且另外任选地包含一个或更多个双键键合部分的基团。

91、如本文使用的，“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”是指其中一个或更多个碳原子各自独立地被相同或不同的杂原子或杂原子基团替代的如本文定义的烷基、烯基和炔基。可以替代碳原子的杂原子和/或杂原子基团包括但不限于-o-、-s-、-s-o-、-nrα-、-ph-、-s(o)-、-s(o)2-、-s(o)nrα-、-s(o)2nrα-等，包括其组合，其中每个rα独立地选自氢、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烃基、芳基和杂芳基。

92、如本文使用的，“烷氧基”是指基团-orβ，其中rβ是如上文定义的烷基基团，包括还如本文定义的任选地被取代的烷基基团。

93、如本文使用的，“芳基”是指具有单环(例如，苯基)或多于一个稠环(例如，萘基或蒽基)的具有从6个至12个碳原子(包括端点)的不饱和芳族碳环基团。示例性芳基包括苯基、吡啶基、萘基等。

94、如本文使用的，“氨基”是指基团-nh2。被取代的氨基是指基团-nhrδ、nrδrδ和nrδrδrδ，其中每个rδ独立选自被取代的或未被取代的烷基、环烷基、环杂烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、酰基、烷氧基羰基、硫烷基、亚硫酰基、磺酰基等。典型的氨基基团包括但不限于二甲基氨基、二乙基氨基、三甲基铵、三乙基铵、甲基磺酰基氨基、呋喃基-氧基-磺氨基等。

95、如本文使用的，“氧/氧代(oxo)”是指＝o。

96、如本文使用的，“氧基”是指二价基团-o-，其可以具有各种取代基以形成不同的氧基基团，包括醚和酯。

97、如本文使用的，“羧基”是指-cooh。

98、如本文使用的，“羰基”是指-c(o)-，其可以具有各种取代基以形成不同的羰基基团，包括酸、酸性卤化物、醛、酰胺、酯和酮。

99、如本文使用的，“烷基氧基羰基”是指-c(o)orε，其中rε是如本文定义的烷基基团，其可以被任选地取代。

100、如本文使用的，“氨基羰基”是指-c(o)nh2。被取代的氨基羰基是指-c(o)nrδrδ，其中氨基基团nrδrδ是如本文定义的。

101、如本文使用的，“卤素(halogen)”和“卤代(halo)”是指氟、氯、溴和碘。

102、如本文使用的，“羟基”是指-oh。

103、如本文使用的，“氰基”是指-cn。

104、如本文使用的，“杂芳基”是指在环内具有1至10个碳原子(包括端点)和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子(包括端点)的芳族杂环基团。这样的杂芳基基团可以具有单环(例如，吡啶基或呋喃基)或多于一个稠环(例如，吲嗪基(indolizinyl)或苯并噻吩基)。

105、如本文使用的，“杂芳基烷基”是指被杂芳基取代的烷基(即，杂芳基-烷基-基团)，优选地在烷基部分中具有从1个至6个碳原子(包括端点)并且在杂芳基部分中具有从5个至12个环原子(包括端点)。这样的杂芳基烷基基团的实例是吡啶基甲基等。

106、如本文使用的，“杂芳基烯基”是指被杂芳基取代的烯基(即，杂芳基-烯基-基团)，优选地在烯基部分中具有从2个至6个碳原子(包括端点)并且在杂芳基部分中具有从5个至12个环原子(包括端点)。

107、如本文使用的，“杂芳基炔基”是指被杂芳基取代的炔基(即，杂芳基-炔基-基团)，优选地在炔基部分中具有从2个至6个碳原子(包括端点)并且在杂芳基部分中具有从5个至12个环原子(包括端点)。

108、如本文使用的，“杂环”、“杂环的”和可互换的“杂环烃基(heterocycloalkyl)”是指具有单环或多于一个稠环的、具有从2个至10个碳环原子(包括端点)和在环内的选自氮、硫或氧的从1个至4个杂环原子(包括端点)的饱和的或不饱和基团。这样的杂环基团可以具有单环(例如，哌啶基或四氢呋喃基)或多于一个稠环(例如，二氢吲哚基、二氢苯并呋喃或奎宁环基(quinuclidinyl))。杂环的实例包括但不限于呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪(quinolizine)、异喹啉、喹啉、酞嗪(phthalazine)、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑(carbazole)、咔啉(carboline)、菲啶(phenanthridine)、吖啶、菲咯啉(phenanthroline)、异噻唑、吩嗪(phenazine)、异噁唑、吩噁嗪(phenoxazine)、吩噻嗪(phenothiazine)、四氢咪唑(imidazolidine)、咪唑啉(imidazoline)、哌啶、哌嗪、吡咯烷、二氢吲哚等。

109、如本文使用的，“元环”意图涵盖任何环状结构。术语“元”之前的数字表示构成环的主链原子的数目。因此，例如环己基、吡啶、吡喃和噻喃是6元环，并且环戊基、吡咯、呋喃和噻吩是5元环。

110、除非另有指定，否则在前述基团中被氢占据的位置可以用以下取代基进一步取代，所述取代基例如但不限于：羟基、氧代、硝基、甲氧基、乙氧基、烷氧基、被取代的烷氧基、三氟甲氧基、卤代烷氧基、氟、氯、溴、碘、卤代、甲基、乙基、丙基、丁基、烷基、烯基、炔基、被取代的烷基、三氟甲基、卤代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、硫基、烷硫基、酰基、羧基、烷氧基羰基、甲酰氨基、被取代的甲酰氨基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基氨基、磺酰氨基、被取代的磺酰氨基、氰基、氨基、被取代的氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氨基烷基、酰基氨基、脒基、脒肟基(amidoximo)、羟基甲酰基(hydroxamoyl)、苯基、芳基、被取代的芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、吡啶基、咪唑基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂芳氧基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、被取代的环烷基、环烷基氧基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉代、杂环、(杂环)氧基和(杂环)烷基((heterocycle)alkyl)；并且优选的杂原子是氧、氮和硫。应理解，当在这些取代基上存在开放化合价时，它们可以进一步被烷基、环烷基、芳基、杂芳基和/或杂环基团取代，当碳上存在这些开放化合价时，它们可以进一步被卤素和被氧-、氮-或硫-键合的取代基取代，并且当存在多于一个这样的开放化合价时，这些基团可以通过直接形成键或通过与新的杂原子(优选地，氧、氮或硫)键合形成键而连接以形成环。还应理解，可以进行上文的取代，条件是用取代基替代氢不会对本发明的分子带来不可接受的不稳定性，并且在其他方面在化学上是合理的。

111、如本文使用的术语“培养”指微生物细胞群体在任何合适的条件(例如，使用液体、凝胶或固体培养基)下的生长。

112、重组多肽可以使用本领域已知的任何合适的方法产生。编码感兴趣的野生型多肽的基因可以在载体诸如质粒中克隆，并在期望的宿主诸如大肠杆菌等中表达。重组多肽的变体可以通过本领域已知的各种方法产生。事实上，存在本领域的技术人员熟知的各种各样的不同的诱变技术。另外，诱变试剂盒还从许多商业分子生物学供应商可得。方法可用于做出在指定的氨基酸(定点)的特定取代、在基因的局部区域中的特异性(区域特异性)或随机突变、或在整个基因内的随机诱变(例如，饱和诱变)。本领域技术人员已知产生酶变体的许多合适的方法，包括但不限于使用pcr对单链dna或双链dna进行定点诱变、盒式诱变、基因合成、易错pcr、改组和化学饱和诱变或本领域已知的任何其他合适的方法。诱变和定向演化的方法可以容易地应用于编码酶的多核苷酸，以生成可以被表达、筛选和测定的变体库。任何合适的诱变和定向演化方法都可以在本发明中使用，并且是本领域已知的(参见例如美国专利第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号、第5,837,458号、第5,928,905号、第6,096,548号、第6,117,679号、第6,132,970号、第6,165,793号、第6,180,406号、第6,251,674号、第6,265,201号、第6,277,638号、第6,287,861号、第6,287,862号、第6,291,242号、第6,297,053号、第6,303,344号、第6,309,883号、第6,319,713号、第6,319,714号、第6,323,030号、第6,326,204号、第6,335,160号、第6,335,198号、第6,344,356号、第6,352,859号、第6,355,484号、第6,358,740号、第6,358,742号、第6,365,377号、第6,365,408号、第6,368,861号、第6,372,497号、第6,337,186号、第6,376,246号、第6,379,964号、第6,387,702号、第6,391,552号、第6,391,640号、第6,395,547号、第6,406,855号、第6,406,910号、第6,413,745号、第6,413,774号、第6,420,175号、第6,423,542号、第6,426,224号、第6,436,675号、第6,444,468号、第6,455,253号、第6,479,652号、第6,482,647号、第6,483,011号、第6,484,105号、第6,489,146号、第6,500,617号、第6,500,639号、第6,506,602号、第6,506,603号、第6,518,065号、第6,519,065号、第6,521,453号、第6,528,311号、第6,537,746号、第6,573,098号、第6,576,467号、第6,579,678号、第6,586,182号、第6,602,986号、第6,605,430号、第6,613,514号、第6,653,072号、第6,686,515号、第6,703,240号、第6,716,631号、第6,825,001号、第6,902,922号、第6,917,882号、第6,946,296号、第6,961,664号、第6,995,017号、第7,024,312号、第7,058,515号、第7,105,297号、第7,148,054号、第7,220,566号、第7,288,375号、第7,384,387号、第7,421,347号、第7,430,477号、第7,462,469号、第7,534,564号、第7,620,500号、第7,620,502号、第7,629,170号、第7,702,464号、第7,747,391号、第7,747,393号、第7,751,986号、第7,776,598号、第7,783,428号、第7,795,030号、第7,853,410号、第7,868,138号、第7,783,428号、第7,873,477号、第7,873,499号、第7,904,249号、第7,957,912号、第7,981,614号、第8,014,961号、第8,029,988号、第8,048,674号、第8,058,001号、第8,076,138号、第8,108,150号、第8,170,806号、第8,224,580号、第8,377,681号、第8,383,346号、第8,457,903号、第8,504,498号、第8,589,085号、第8,762,066号、第8,768,871号、第9,593,326号和所有相关的美国以及pct和非美国对应案；ling等人,anal.biochem.,254(2):157-78[1997]；dale等人,meth.mol.biol.,57:369-74[1996]；smith,ann.rev.genet.,19:423-462[1985]；botstein等人,science,229:1193-1201[1985]；carter,biochem.j.,237:1-7[1986]；kramer等人,cell,38:879-887[1984]；wells等人gene,34:315-323[1985]；minshull等人,curr.op.chem.biol.,3:284-290[1999]；christians等人,nat.biotechnol.,17:259-264[1999]；crameri等人,nature,391:288-291[1998]；crameri等人,nat.biotechnol.,15:436-438[1997]；zhang等人,proc.nat.acad.sci.u.s.a.,94:4504-4509[1997]；crameri等人,nat.biotechnol.,14:315-319[1996]；stemmer,nature,370:389-391[1994]；stemmer,proc.nat.acad.sci.usa,91:10747-10751[1994]；wo 95/22625、wo 97/0078、wo 97/35966、wo 98/27230、wo 00/42651、wo 01/75767和wo 2009/152336，所有这些都通过引用并入本文)。

113、在一些实施方案中，诱变处理后获得的酶克隆通过使酶制品经受指定的温度(或其他测定条件)并测量热处理或其他合适的测定条件后剩余的酶活性的量进行筛选。然后从基因分离含有编码多肽的多核苷酸的克隆，将其测序以鉴定核苷酸序列变化(如果有)，并且用于在宿主细胞中表达酶。测量来自表达文库的酶活性可以使用本领域已知的任何合适的方法(例如，标准生物化学技术，诸如hplc分析)来进行。

114、在变体产生之后，可以对它们筛选任何期望的特性(例如，高或增加的活性或低或降低的活性、增加的热活性、增加的热稳定性和/或酸性ph稳定性等)。在一些实施方案中，可使用“重组半乳糖氧化酶多肽”(在本文中还被称为“工程化半乳糖氧化酶多肽”、“变体半乳糖氧化酶”、“半乳糖氧化酶变体”和“半乳糖氧化酶组合变体”)。在一些实施方案中，可使用“重组半乳糖氧化酶多肽”(还被称为“工程化半乳糖氧化酶多肽”、“变体半乳糖氧化酶”、“半乳糖氧化酶变体”和“半乳糖氧化酶组合变体”)。

115、如本文使用的，“载体”为用于将dna序列导入到细胞中的dna构建体。在一些实施方案中，载体为被可操作地连接至能够实现dna序列中编码的多肽在合适宿主中的表达的合适的控制序列的表达载体。在一些实施方案中，“表达载体”具有可操作地连接至dna序列(例如，转基因)以驱动在宿主细胞中表达的启动子序列，并且在一些实施方案中，还包含转录终止子序列。

116、如本文使用的，术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还包括多肽从细胞的分泌。

117、如本文使用的，术语“产生”指蛋白和/或其他化合物由细胞的产生。意图是，该术语包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还包括多肽从细胞的分泌。

118、如本文使用的，如果氨基酸或核苷酸序列(例如，启动子序列、信号肽、终止子序列等)与它被可操作地连接至其的另一个序列在自然界中未缔合，则这两个序列为异源的。例如“异源”多核苷酸是通过实验室技术被引入宿主细胞的任何多核苷酸，并且包括从宿主细胞中取出、进行实验室操作并且然后重新引入宿主细胞的多核苷酸。

119、如本文使用的，术语“宿主细胞”和“宿主菌株”指包含本文提供的dna(例如，编码半乳糖氧化酶变体的多核苷酸)的表达载体的合适的宿主。在一些实施方案中，宿主细胞为已用使用如本领域已知的重组dna技术构建的载体转化或转染的原核细胞或真核细胞。

120、术语“类似物”意指与参考多肽具有多于70％序列同一性，但少于100％序列同一性(例如，多于75％、78％、80％、83％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的多肽。在一些实施方案中，类似物意指这样的多肽，所述多肽包含一个或更多个非天然存在的氨基酸残基以及天然存在的氨基酸，所述一个或更多个非天然存在的氨基酸残基包括但不限于高精氨酸、鸟氨酸和正缬氨酸。在一些实施方案中，类似物还包括一个或更多个d-氨基酸残基和两个或更多个氨基酸残基之间的非肽键。

121、术语“有效量”意指足以产生期望的结果的量。本领域普通技术人员可以通过使用常规实验确定有效量。

122、术语“分离的”和“纯化的”用于指从与其天然缔合的至少一种其他组分分开的分子(例如，分离的核酸、多肽等)或其他组分。术语“纯化的”不要求绝对纯度，而是意图作为相对定义。

123、如本文使用的，“立体选择性”是指在化学或酶促反应中一种立体异构体相比另一种立体异构体优先形成。立体选择性可以是部分的，其中一种立体异构体的形成优于另一种，或者其可以是完全的，其中只形成一种立体异构体。当立体异构体是对映异构体时，立体选择性被称为对映选择性，即二者的总和中一种对映体的分数(通常以百分比报告)。本领域通常可选地报告其为根据下式从中计算的对映体过量(“e.e.”)(通常为百分比)：[主要对映异构体-次要对映异构体]/[主要对映异构体+次要对映异构体]。当立体异构体是非对映异构体时，立体选择性被称为非对映选择性，即两种非对映异构体的混合物中一种非对映异构体的分数(通常报告为百分比)，通常可选地报告为非对映异构体过量(“d.e.”)。对映异构体过量和非对映体过量是立体异构过量的类型。

124、如本文使用的，“区域选择性”和“区域选择性反应”是指其中一个键形成或断裂方向优先于所有其他可能方向发生的反应。如果区分是完全的，则反应可以是完全(100％)区域选择性的；如果一个位点的反应产物相比其他位点的反应产物占主导地位，则是基本上区域选择性的(至少75％)，或者部分区域选择性的(x％，其中百分比取决于感兴趣的反应设置)。

125、如本文使用的，“化学选择性”是指在化学或酶促反应中一种产物相比另一种产物优先形成。

126、如本文使用的，“ph稳定的”是指与未处理的酶相比，在暴露于高或低ph值(例如，4.5-6或8-12)一段时间(例如，0.5小时-24小时)后半乳糖氧化酶多肽仍保持相似活性(例如，多于60％至80％)。

127、如本文使用的，“热稳定的”是指与暴露在相同的升高的温度的野生型酶相比，在暴露于升高的温度(例如，40℃-80℃)一段时间(例如，0.5h-24h)后半乳糖氧化酶多肽仍保持相似活性(例如，多于60％至80％)。

128、如本文使用的，“溶剂稳定的”是指与暴露于相同浓度的相同溶剂的野生型酶相比，在暴露于不同浓度(例如，5％-99％)的溶剂(乙醇、异丙醇、二甲基亚砜[dmso]、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、甲苯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚等)一段时间(例如，0.5h-24h)后半乳糖氧化酶多肽保持相似活性(多于例如，60％至80％)。

129、如本文使用的，“热和溶剂稳定的”是指半乳糖氧化酶多肽是既热稳定又溶剂稳定的。

130、如本文使用的，“任选的”和“任选地”意指随后描述的事件或情形可以发生或可以不发生，并且意指该描述包括当该事件或情形发生的情况和其中该事件或情形不发生的情况。本领域普通技术人员将理解，对于被描述为含有一种或更多种任选的取代基的任何分子，仅意在包括空间上可实现的和/或合成上可行的化合物。

131、如本文使用的，“任选地被取代的”是指术语或一系列化学基团中的所有后续修饰对象(modifier)。例如，在术语“任选地被取代的芳基烷基”中，分子的“烷基”部分和“芳基”部分可以被取代或可以不被取代，并且对于一系列“任选地被取代的烷基、环烷基、芳基和杂芳基”，烷基、环烷基、芳基和杂芳基基团彼此独立地可以被取代或可以不被取代。

132、如本文使用的，“保护基团”是指当附接至分子中的反应性官能团时掩蔽、降低或阻止官能团的反应性的一组原子。通常地，保护基团可以在合成的过程期间如期望的被选择性地去除。保护基团的实例是本领域熟知的。可具有保护基团的官能团包括但不限于羟基、氨基和羧基基团。代表性氨基保护基团包括但不限于甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄基氧基羰基(“cbz”)、叔丁氧基羰基(“boc”)、三甲基甲硅烷基(“tms”)、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(“ses”)、三苯甲基和取代的三苯甲基基团、烯丙基氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(“fmoc”)、硝基-藜芦基氧基羰基(“nvoc”)等。代表性羟基保护基团包括但不限于其中羟基基团被酰化的那些(例如，甲基和乙基酯、乙酸酯或丙酸酯基团或二醇酯)或其中羟基基团被烷基化的那些，诸如苄基和三苯甲基醚，以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚(例如，tms或tipps基团)和烯丙基醚。其他保护基团可以见于本文描述的参考文献。