过氧化氢进化的宿主细胞的制作方法

本披露涉及过氧化氢(h2o2)进化的宿主细胞以及用于制备和使用(h2o2)进化的宿主细胞的方法，并且特别地，涉及使用(h2o2)进化的宿主细胞产生感兴趣的蛋白质的方法。

背景技术：

1、在欧盟和美国，超过100种治疗性蛋白质被批准用于临床应用，其中大部分是重组产生的(dimitrov,ds(2012)“therapeutic proteins[治疗性蛋白质].”methodsmol.biol.[分子生物学方法]899:1-26)。具有非天然形式的工程化蛋白质，诸如双特异性抗体、多特异性融合蛋白和抗体缀合物也正在开发中。尽管基于蛋白质的疗法取得了巨大的成功，但有效的开发仍然具有挑战性。特别是，蛋白质过表达可能影响宿主细胞代谢，并且大规模细胞培养可能导致细胞应激，从而降低宿主细胞生产率表现。

2、活性氧物种(ros)是有氧代谢的天然副产品，当其以高水平存在时，可能干扰细胞生长和生产率。(chevallier等人(2019)“oxidative stress-alleviating strategies toimprove recombinant protein production in cho cells[改善cho细胞中重组蛋白产生的氧化应激缓解策略]”.biotechnol bioeng.[生物技术与生物工程]117(4):1172-1186；zeeshan等人(2016)“endoplasmic reticulum stress and associated ros[内质网应激与相关ros]”.int j mol sci.[国际分子科学杂志]17(3):327；turrens jf.(2003)“mitochondrial formation of reactive oxygen species[活性氧物种的线粒体形成]”.j physiol.[生理学杂志]552(pt2):335-44；santos等人(2009)“mechanisms andimplications of reactive oxygen species generation during the unfoldedprotein response:roles of endoplasmic reticulum oxidoreductases,mitochondrialelectron transport,and nadph oxidase[未折叠蛋白响应过程中活性氧物种生成的机制和意义：内质网氧化还原酶、线粒体电子转运和nadph氧化酶的作用]”.antioxid redoxsignal.[抗氧化剂与氧化还原信号]11(10):2409-27)。近年来，对于细胞氧化还原状态对重组蛋白生产的影响的认识有所增加。(handlogten等人(2017)“glutathione andthioredoxin systems contribute to recombinant monoclonal antibody interchaindisulfide bond reduction during bioprocessing[谷胱甘肽和硫氧还蛋白系统有助于生物加工过程中的重组单克隆抗体链间二硫键还原]”.biotechnol bioeng.[生物技术与生物工程]114(7):1469-77；handlogten等人(2018)“intracellular response toprocess optimization and impact on productivity and product aggregates for ahigh-titer cho cell process[针对工艺优化的细胞内响应以及对高滴度cho细胞工艺的生产率和产品聚集的影响]”.biotechnol bioeng.[生物技术与生物工程]115(1):126-38；orellana等人(2015)“high-antibody-producing chinese hamster ovary cells up-regulate intracellular protein transport and glutathione synthesis[高抗体产生的中国仓鼠卵巢细胞上调细胞内蛋白质转运和谷胱甘肽合成]”.j proteome res.[蛋白质组研究杂志]14(2):609-18；以及handlogten等人(2020)“online control of cellculture redox potential prevents antibody interchain disulfide bond reduction[细胞培养氧化还原电位的在线控制防止抗体链间二硫键还原]”。biotechnol bioeng.[生物技术与生物工程]117(5):1329-1336)。

3、中国仓鼠卵巢(cho)细胞经常用于表达单克隆抗体(mab)和其他非天然生物制药分子，诸如双特异性抗体(bisab)。(kim等人(2012)“cho cells in biotechnology forproduction of recombinant proteins:current state and further potential[用于生产重组蛋白的生物技术中的cho细胞：当前状态和进一步的潜力]”.appl microbiolbiotechnol.[应用微生物学与生物技术]93(3):917-30；以及wang等人(2019)“design andproduction of bispecific antibodies[双特异性抗体的设计与生产]”.antibodies.[抗体]8(3):43。然而，据信cho细胞在大规模细胞培养期间产生高水平的ros，这可能导致氧化应激、次优的细胞培养性能和较低的抗体滴度。(handlogten等人(2018)“intracellularresponse of cho cells to oxidative stress and its influence on metabolism andantibody production[cho细胞对氧化应激的细胞内响应及其对代谢和抗体产生的影响]”.biochemical engineering journal.[生物化学工程杂志]133:12-20)。特别是，新型抗体形式(诸如双特异性抗体)的开发可能受到与高水平细胞应激(包括氧化应激)相关(chevallier等人(2019)“oxidative stress-alleviating strategies to improverecombinant protein production in cho cells[改善cho细胞中重组蛋白产生的氧化应激缓解策略]”.biotechnol bioeng.[生物技术与生物工程]117(4):1172-11)的低产物产量的阻碍(spiess等人(2015)“alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies[双特异性抗体的替代分子形式和治疗应用]”.mol immunol.[分子免疫学]67(2pt a):95-106)。

4、涉及通过过表达或靶向基因切除来改变亚细胞过程的特定基因操纵的基因工程化方法已被实施，以缓解生产瓶颈并产生更可预测和更稳健的细胞系。迄今为止，这种策略已被用于改变各种亚细胞过程，包括细胞周期(fussenegger等人(1998)“controlledproliferation by multigene metabolic engineering enhances the productivity ofchinese hamster ovary cells[通过多基因代谢工程化控制增殖提高中国仓鼠卵巢细胞的生产率]”.nat biotechnol.[自然生物技术]16(5):468-72)、代谢(fogolin等人(2004)“impact of temperature reduction and expression of yeast pyruvate carboxylaseon hgm-csf-producing cho cells[降温和酵母丙酮酸羧化酶表达对产生hgm-csf的cho细胞的影响]”.jbiotechnol.[生物技术杂志]109(1-2):179-91)、蛋白质分泌(mohan等人(2007)“effect of doxycycline-regulated protein disulfide isomerase expressionon the specific productivity of recombinant cho cells:thrombopoietin andantibody[强力霉素调节的蛋白质二硫键异构酶表达对重组cho细胞的比生产率的影响：血小板生成素和抗体]”.biotechnol bioeng.[生物技术与生物工程]98(3):611-5)以及细胞氧化还原(orellana等人(2017)“overexpression of the regulatory subunit ofglutamate-cysteine ligase enhances monoclonal antibody production in chocells[谷氨酸-半胱氨酸连接酶的调节亚基的过表达增强cho细胞中的单克隆抗体产生]”.biotechnol bioeng.[生物技术与生物工程]114(8):1825-36；banmeyer等人(2004)“overexpression of human peroxiredoxin 5in subcellular compartments ofchinese hamster ovary cells:effects on cytotoxicity and dna damage caused byperoxides[人过氧化物氧还蛋白5在中国仓鼠卵巢细胞的亚细胞区室中的过表达：对由过氧化物引起的细胞毒性和dna损伤的影响]”.free radic biol med.[自由基生物学与医学]36(1):65-77；warner等人(1993)“expression of human mn sod in chinese hamsterovary cells confers protection from oxidant injury[人mn sod在中国仓鼠卵巢细胞中的表达赋予免受氧化剂损伤的保护]”.am j physiol.[美国生理学杂志]264(6pt 1):l598-605)。尽管这些基因工程化策略取得了一定的成功，但靶向特定生化途径来操纵特定基因可能并不像最初假设的那样有效。因此，仍然需要在细胞培养过程中具有改善性能的细胞系，例如，当表达异源蛋白质或具有非天然形式的蛋白质诸如双特异性抗体时。

技术实现思路

1、本发明涉及用于产生感兴趣的重组蛋白的方法，该重组蛋白包括例如，抗体、抗原结合抗体片段或双特异性抗体，并且特别涉及使用过氧化氢(h2o2)进化的哺乳动物宿主细胞产生感兴趣的重组蛋白的方法。

2、在一方面，提供了能够表达感兴趣的蛋白质的过氧化氢(h2o2)进化的哺乳动物宿主细胞。在一方面，h2o2进化的宿主细胞具有抗氧化防御系统，其中当与亲代对照相比时，该抗氧化防御系统的一种或多种组分的水平有所增加。在一方面，抗氧化防御系统的一种或多种组分选自谷胱甘肽(gsh)、氧化型谷胱甘肽(gssg)、谷胱甘肽合成酶(gss)；谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基(gclm)；过氧化氢酶；半胱氨酸/谷氨酸反向转运体轻链(xct)；谷胱甘肽过氧化物酶-1(gpx-1)；及其组合。在一方面，当与亲代对照相比时，h2o2进化的宿主细胞对细胞应激具有增强的抗性。在一方面，当与亲代对照相比时，h2o2进化的宿主细胞对氧化应激具有增强的抗性。

3、在一方面，当与亲代对照相比时，h2o2进化的宿主细胞具有增加的总谷胱甘肽水平。在一方面，h2o2进化的宿主细胞具有比亲代对照高约1％至约25％、约2％至约20％、或约3％至约10％、或至少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、或约20％的gsh水平。在一方面，当与亲代对照相比时，h2o2进化的宿主细胞具有增加的总谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽(gssg)比率(gsh:gssg)。在一方面，与亲代对照相比，总谷胱甘肽与gssg比率(gsh:gssg)增加了约1％至约15％、或约2％至约10％、或至少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、或约15％。在一方面，总谷胱甘肽与gssg比率(gsh:gssg)为约2.5:1至约3:1、或至少约2.5:1、约2.6:1、约2.7:1、约2.8:1、约2.9:1或约3:1。

4、在一方面，与亲代对照相比，h2o2进化的宿主细胞的一个或多个抗氧化防御基因被上调。在一方面，一个或多个抗氧化防御基因选自：谷胱甘肽合成酶(gss)；谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基(gclm)；过氧化氢酶；半胱氨酸/谷氨酸反向转运体轻链(xct)；谷胱甘肽过氧化物酶-1(gpx-1)；及其组合。在一方面，与亲代对照相比，gss表达增加了约10％至约300％、或约25％至约200％、或至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％以及高达约150％、约200％、约250％或约300％。在一方面，与亲代对照相比，gclm表达增加了约10％至约100％、或约25％至约75％、或至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、或约75％。在一方面，与亲代对照相比，过氧化氢酶表达增加了约10％至约100％、或约25％至约75％、或至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、或约75％。在一方面，与亲代对照相比，xct表达增加了约10％至约50％、或至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％。在一方面，与亲代对照相比，gpx-1表达增加了约10％至约100％、或约10％至约50％、或至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％。

5、在一方面，h2o2进化的宿主细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。

6、在一方面，h2o2进化的宿主细胞包含编码感兴趣的蛋白质的异源基因。在一方面，异源基因被稳定整合到宿主细胞dna中。在一方面，异源基因编码抗体或抗原结合抗体片段。在一方面，异源基因编码双特异性抗体。

7、在一方面，提供了过氧化氢(h2o2)进化的中国仓鼠卵巢(cho)细胞，其能够表达感兴趣的治疗性蛋白质。在一方面，h2o2进化的宿主细胞具有抗氧化防御系统，其中当与亲代对照相比时，该抗氧化防御系统的选自谷胱甘肽(gsh)、氧化型谷胱甘肽(gssg)、谷胱甘肽合成酶(gss)；谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基(gclm)；过氧化氢酶；半胱氨酸/谷氨酸反向转运体轻链(xct)；谷胱甘肽过氧化物酶-1(gpx-1)；或其组合的一种或多种组分的水平有所增加。

8、在一方面，提供了包括本文所述的h2o2进化的宿主细胞的细胞群体。在一方面，与亲代对照细胞群体相比，h2o2进化的细胞群体具有改善的性能。在一方面，h2o2进化的细胞具有改善的性能，包括以下中的一种或多种：

9、(a)增加的活细胞密度；

10、(b)增加的存活率；

11、(c)降低的乳酸盐水平；

12、(d)增加的滴度；

13、(e)增加的比生产率(qp)；

14、或其组合。

15、在一方面，当在补料分批培养过程中培养时，细胞群体包括与亲代对照细胞群体相比具有改善性能的h2o2进化的细胞。在一方面，当表达感兴趣的蛋白质时，细胞群体包括与亲代对照细胞群体相比具有改善性能的h2o2进化的细胞。在一方面，细胞群体表达感兴趣的蛋白质，该蛋白质是双特异性抗体。

16、在一方面，与亲代对照细胞群体相比，h2o2进化的细胞群体具有增加的活细胞密度。在一方面，h2o2进化的细胞群体具有约15x 106个细胞/ml至约25x 106个细胞/ml、或至少约15x 106个细胞/ml、约16x 106个细胞/ml、约17x 106个细胞/ml、约18x 106个细胞/ml、或约19x 106个细胞/ml，以及高达约20x 106个细胞/ml的峰值活细胞密度。

17、在一方面，与亲代对照细胞群体相比，h2o2进化的细胞群体具有降低的乳酸盐水平。在一方面，h2o2进化的细胞群体的乳酸盐积累小于未进化的亲代对照培养物的乳酸盐积累的约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％或约20％。

18、在一方面，与亲代对照细胞群体相比，细胞群体以增加至少约1.5倍至3.5倍、或至少约1.5倍、约1.75倍、约2.0倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3.0倍、约3.25倍、或约3.5倍的滴度表达感兴趣的蛋白质。在一方面，细胞群体表达感兴趣的蛋白质，该蛋白质是双特异性抗体。在一方面，双特异性抗体的滴度为约0.5g/l至约1.5g/l、或约0.5g/l至约1.1g/l、或约0.50g/l、约0.55g/l、约0.60g/l、约0.65g/l、约0.70g/l、约0.75g/l、约0.80g/l、约0.85g/l、约0.90g/l、约0.95g/l，以及高达约1.0g/l、约1.1g/l、约1.2g/l、约1.3g/l、约1.4g/l、或约1.5g/l。在一方面，双特异性抗体的滴度为至少约0.5g/l、约0.6g/l、约0.7g/l、约0.8g/l、约0.9g/l、或约1.0g/l以及高达约1.0g/l。

19、在一方面，与亲代对照细胞群体相比，h2o2进化的细胞群体具有增加至少约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、或约2.0倍的比生产率(qp)。

20、在一方面，提供了一种产生感兴趣的蛋白质的方法。在一方面，该方法包括在允许感兴趣的蛋白质表达的条件下培养如本文所述的h2o2进化的宿主细胞。在一方面，感兴趣的蛋白质是异源蛋白质。在一方面，感兴趣的蛋白质是抗体或抗原结合抗体片段。在一方面，抗体是双特异性抗体。在一方面，该方法包括分离感兴趣的蛋白质。在一方面，提供了一种组合物，其包含分离的感兴趣的蛋白质和药学上可接受的载体。

21、在一方面，本文提供了如本文所述的h2o2进化的宿主细胞用于产生感兴趣的蛋白质的用途。在一方面，感兴趣的蛋白质是抗体或抗原结合抗体片段。在一方面，抗体是双特异性抗体。

22、在一方面，提供了一种分离的宿主细胞，其在过氧化氢(h2o2)存在下具有改善的存活率。在一方面，在暴露于约2mm至约50mm h2o2、约10mm至约40mm h2o2、约20mm至约40mmh2o2、约30mm至约40mm h2o2、或约35mm至约40mm h2o2后，宿主细胞在约1至约15天后具有至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的存活率。在一方面，宿主细胞与至少约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm以及高达约40mm、约45mm或约50mm h2o2接触。在一方面，宿主细胞与约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm或约40mm h2o2接触。

23、在一方面，当用过氧化氢攻击时，与亲代对照细胞群体相比，h2o2进化的细胞群体具有至少约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％增加的存活率。在一方面，用至少约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm或约35mm，以及高达约40mm的过氧化氢攻击h2o2进化的细胞群体。在一方面，用约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm、或约40mm的过氧化氢攻击h2o2进化的细胞群体。在一方面，在用过氧化氢攻击后，h2o2进化的细胞的存活率改善保持了至少约50、约60、约70、约80、约90或约100倍的群体倍增(pdl)。在一方面，提供了一种用于产生对细胞应激具有增强抗性的哺乳动物宿主细胞进化群体的方法。在一方面，提供了一种用于产生对氧化应激具有增强抗性的哺乳动物宿主细胞进化群体的方法。在一方面，该方法包括在约5mm至约20mm、或约10mm至约15mm过氧化氢(h2o2)的存在下多轮培养细胞群体，并允许细胞恢复，直到细胞可以在约20mm至约40mm h2o2的存在下存活。在一方面，该方法包括：

24、(a)提供细胞群体；

25、(b)在细胞培养基中培养细胞群体；

26、(c)使该细胞群体与约5mm至约20mm h2o2接触，以提供移行细胞群体；

27、(d)将移行细胞重悬于不含h2o2的新鲜细胞培养基中，并培养直到细胞达到至少约70％的存活率；

28、(e)重复步骤(c)-(d)以获得当与约20mm至约40mm h2o2接触并孵育约30分钟至约1小时时能够存活的h2o2进化的细胞群体。

29、在一方面，将(b)中产生的细胞群体培养至至少约70％、约80％或约90％的存活率。在一方面，使(c)中产生的细胞群体与约5mm至约10mm、约10至约15mm、或约15至约20mmh2o2接触。在一方面，使(c)中产生的细胞群体与约10mm、约11mm、约11.5mm、约12mm、约12.5mm、约13mm、约13.5mm、约14mm、约14.5mm、约15mm、约15.5mm、约16mm、约16.5mm、约17mm、约17.5mm、约18mm、约18.5mm、约19mm、约19.5mm，以及高达约20mm h2o2接触。在一方面，在(c)中产生的细胞群体包括将细胞群体与h2o2一起孵育至少约30min、约45min或约60min以及长达约90min、或约120min。在一方面，重复步骤(c)-(d)至少约3次、约4次、或约5次以及多达约6次、约7次、约8次、约9次或约10次。

30、在一方面，提供了一种用于产生中国仓鼠卵巢(cho)细胞进化群体的方法。

31、在一方面，提供了一种用于产生哺乳动物宿主细胞的进化群体的方法，这些哺乳动物宿主细胞包含编码感兴趣的蛋白质的异源基因。在一方面，异源基因被稳定整合到宿主细胞dna中。在一方面，异源基因编码抗体或抗原结合抗体片段。在一方面，异源基因编码双特异性抗体。

32、在一方面，提供了一种用于产生哺乳动物宿主细胞的进化群体的方法，其中当在悬浮液中培养时，这些细胞与未进化的对照相比具有改善的性能。

33、在一方面，在至少约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、或约100以及多达约120次群体倍增(pdl)后，当与约20mm至约40mm h2o2接触时，进化的细胞群体可以存活。

34、在一方面，细胞培养基包含约1mm至约10mm、或约2mm至约8mm、或约4mm至约6mm的l-谷氨酰胺。

35、在一方面，提供了一种通过本文所述方法产生的进化的宿主细胞。

36、在一方面，提供了用编码感兴趣的蛋白质的异源基因稳定转染的h2o2进化的宿主细胞，其中宿主细胞在转染后约9至约12天内具有约70％至约85％的存活率。在一方面，在转染后至少约9天、约10天、约11天或约12天，宿主细胞具有约70％至约85％的存活率。在一方面，在转染后至少约9天、10天、11天或12天，宿主细胞具有约1.0×106个细胞/ml至约1.6×106个细胞/ml的活细胞密度(vcd)。在一方面，h2o2进化的宿主细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一方面，稳定转染包括电穿孔，随后是甲硫氨酸亚砜亚胺(msx)选择。在一方面，异源基因编码抗体。在一方面，异源基因编码双特异性抗体。