用于多重和多模式单细胞分析的方法和组合物与流程

背景技术：

1、目前，必须使用不同的试剂来富集/分选细胞，例如通过荧光激活细胞分选，并且在更深的测定中进行分析，例如通过单细胞基因组学进行。类似地，必须使用不同的试剂对细胞和细胞组分进行成像，并在更深的测定中进行分析，例如通过单细胞基因组学方法进行。然而，还没有在一个实验或单个样品中将这些测量模式组合在一起的方法。换句话讲，没有适合多模式使用的单一试剂。

2、为了便于阅读，本领域当前状态的讨论通常集中在单细胞测量和模式上，因为单细胞是健康和疾病的基本单位，但是应当理解，在以下详细描述中公开的改进也可应用于对组织(例如，成像)或大量组织(由单细胞组成)进行的测量。

3、dna条形码化(也称为“特征条形码化”)是将已知的dna序列附接到其他分子上以便随后使用例如下一代测序(ngs)技术鉴定每个分子的过程。当进行基因测序时，dna条形码可用于单细胞分析以从样品中的许多细胞中唯一地鉴定单个细胞。另外，dna条形码可附接到与细胞表面受体结合的抗体，从而允许使用高通量测序技术观察细胞内的基因组序列和细胞表面上的受体。

4、确定性条形码使用特定的已知dna序列来标记分子，其中用户精确地知道使用哪个dna条形码来标记每个分子。相比之下，随机条形码依赖于概率论(泊松统计)来唯一地标记感兴趣的分子。例如，用户可能希望在许多细胞的样品中检查单个细胞中的特定基因。用户无需进行用该预定dna序列特异性地设计和标记每个感兴趣的基因的劳动密集型任务，而是依靠大量已知的dna序列来推测地(随机地)用dna序列标记给定细胞的所有基因。这种方法要求可用dna序列的数目远大于样品中单个细胞的数目，这样任何dna序列与多于一个细胞结合的概率就很小。

5、存在许多测量单个细胞中的基因组物质的模式。转录组(rna)的测量检查由单个细胞表达的所有基因，并且越来越多地检查这些rna分子自身的剪接状态/同种型(例如，在人类基因组中估计的10,000个蛋白质编码基因)，检查通过例如如下方式进行：全转录组分析(wta)，其广泛地分析单个细胞，其中进行所有蛋白质编码基因的调查；或靶向测序，其中测定基因的“面板”，例如，用聚焦方法测定400个基因(例如，400个基因的免疫面板，检查参与免疫应答的400个基因)。越来越多地，这些方法也可用于验证给定基因是否有任何变化，例如，通过基因编辑(crispr)发生的变化。对表观基因组(dna可及性和染色质)的测量说明，对于待转录的rna，在dna中编码的基因首先需要是可及的。这可通过各种手段测量，包括测定dna本身或通过检查染色质。有多种进行这种测量的方法，包括对大量或单细胞样品进行的chip-seq和atac-seq。

6、还存在许多目的在于测定基因组(dna)的应用，包括例如在癌细胞中的突变程度、例如在t细胞受体或b细胞受体的情况下的重组(大批进行，但也可针对单个免疫细胞进行)；基因编辑，例如检查由于crispr或其他基因编辑模式(例如，锌指核酸酶)引起的种系变化；或通过各种模式经由基因疗法的基因添加/替换/编辑。

7、越来越多地，包括上述那些模式的多种模式被组合以形成从dna到rna并最终到蛋白质的单个细胞的综合图像。

8、除了所有这些不同的核酸测量之外，最重要的是单细胞蛋白质组。虽然上述所有测量在性质上都是基因组的，但是在细胞上和细胞内完成细胞的工作并实现许多不同的功能(例如，相互作用、酶活性、通讯、定位、稳定、运动性等)的是蛋白质。根据定义，它们也是引起和/或定义健康和疾病的功能单元。因此，尽管基因组测量很重要，但可以认为最重要的是蛋白质组。细胞内或细胞表面上的蛋白质既定义了细胞身份，又是细胞的功能性组分。例如，记忆性t细胞可通过其对ccr7的表达来鉴定，但ccr7也是一种趋化因子受体，其功能是定位记忆性t细胞，例如定位于淋巴结的特定部分中，从而使记忆性t细胞能够对进入的抗原进行监视并迅速发挥作用。

9、然而，与可使用基于dna的引物和pcr工具箱(逆转录酶、加热、退火等)测定的转录组、表观基因组和基因组不同，由于构成这些组中的每一者的碱基的互补性，蛋白质需要另一种测定模式，其中另一种蛋白质(例如抗体或其变体，包括但不限于适体、fab片段等)特异性结合另一种蛋白质的表位。就单细胞基因组学而言，这些抗体可与条形码(例如，带序列标签的抗体)结合，从而能够在测序测定中检测到它们(图1)。

10、单细胞转录组测量存在“漏失”问题。由于除了非常高度表达的基因如管家基因之外，大多数rna分子以个位数拷贝存在，因此具有更大的测序深度以确保检测到的零是“真正的”零是至关重要的。测序深度(又称为覆盖率)是在重建序列中包含给定核苷酸的独特读段的数目。rna测序通常需要更大的深度。由于免疫细胞表达非常低拷贝的rna，有时表达它们所定义的蛋白质的零拷贝的rna，因此这个问题变得更加严重。例如，定义为在其表面上具有cd4共受体的cd4+辅助t细胞通常在rna中表达零拷贝的cd4基因。因此，测定细胞，特别是免疫细胞，需要更深的测序(即，更多读段)，这导致成本更高。

11、测序深度能够检查单个细胞的更多特征。重要的是，在发现实验中，通常完全不知道更多的测序是否会导致发现更多的特征。通常，这会导致逐步实验，其中对富集的细胞群运行wta，随后越来越多地运行具有更深深度的基因的靶向面板。由于某些细胞类型非常罕见，运行更多的细胞或运行更多的测序运行(对于额外的深度，例如，在rna同种型的检测或转录后加工中)对每个细胞的成本有显著的影响(万维网网址：satijalab.org/costpercell)，因此每个实验的细胞数目因成本而受到限制。事实上，基于目前的“1000美元基因组”的标准(这实际上意味着大约1.5倍的cnv覆盖率)，任何带序列标签的抗体实验的成本呈线性增长，远远超过流式细胞术实验的成本。反过来，在目前的“1000美元基因组阶段”，用于细胞富集的分选是绝对关键的，大多数罕见的细胞分析仍然必须通过流式细胞术进行，而采用带序列标签的抗体的单细胞技术的应用距离用于临床诊断还有很长的路要走。

12、为此，伴随着发现更具特异性的细胞表型和更罕见细胞的巨大压力，测序成本也越来越高，科学家几乎总是在将这些单细胞用于下游组学测定之前先富集感兴趣的细胞群。这可通过两种不同的方式或其组合来实现。首先，磁性(或气泡)富集，其中可使用与抗体缀合的市售金属颗粒或微泡进行正富集或负富集。第二，分选(荧光激活细胞分选，facs)，其中在任何单细胞实验之前的大多数细胞富集使用facs和荧光团标记的抗体来分选感兴趣的细胞群以供下游分析。

13、最后一个重要的成本动因是带序列标签的抗体本身的成本，它们以非常高的平均销售价格出售，并且必须经常与荧光标记的抗体结合使用以进行分选。图2示出了目前可用的使用带序列标签的抗体的单细胞测序工作流程。

14、单细胞测序使得每个细胞所测量的参数激增，从可用于检查细胞的整个转录组(wta，即每个rna)的基于液滴的方法到多模式测量。也就是说，有几种已知的单细胞“区室化”方法或分离方法，其代表性示例如表1所示。

15、表1.

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17、

18、星号(*)表示带序列标签的抗体已与这些技术组合使用。

19、此外，存在几种单细胞测量方法，其代表性示例如表2所示。

20、表2.

21、

22、

23、星号(*)表示带序列标签的抗体已与这些技术组合使用。

24、通常，免疫荧光(if)成像是可通过如下方法来检测感兴趣的蛋白质的过程：使用与荧光团共价缀合的一抗(直接检测)，或者先用未标记的一抗再用荧光团缀合的二抗的两步法(间接检测)。这两种方法都允许用户组合多种荧光团(多重分析)，使得if成为研究蛋白质共定位、亚细胞定位变化、细胞内蛋白质的差异活化、不同细胞亚群的鉴定和其他分析的理想选择。关键是，已经利用基因组材料作为染色的“velcro”创建了大量多重模式，或者已经开发了可与成像组合使用以获得关于细胞(成像)和这些细胞的组分基因表达(或区域)的表型和功能信息的基因组测定。这带来了基于位置的数据的添加，该数据可显示细胞和组织是如何组织的并且使细胞-细胞相互作用可视化。例如，对给定肿瘤抗原具有特异性的活化细胞毒性cd8+t细胞可存在于肿瘤组织中—单细胞测量方法(包括流式细胞术和上表1和表2中列出的方法)将显示这些细胞的存在。然而，这些细胞可能会与肿瘤物理隔离，从而使这些细胞变得无用。因此，人们通常会牺牲吞吐量(细胞数目)来获得对细胞位置的更多了解。表3示出了生命科学中使用的各种代表性组织成像模式。

25、表3.

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28、

29、图3示出了组合免疫荧光成像和基因表达的代表性当前工作流程。在概述的工作流程中，组织切片(或全组织)上的蛋白质和全转录组的分析在独立的步骤中进行，但是该工作流程与当前用于组织分析的组织学实验室方法和工具整合。

30、然而，需要试剂和方法来组合各种模式和/或工作流程，或在测量后保留选择性，以对随后要进行的分析做出决策。

技术实现思路

1、本文提供了使用包含荧光标记组分和特异性决定分子组分两者的带序列标签的荧光标记特异性决定分子缀合物将细胞富集、细胞分选和/或免疫荧光细胞标记与基因组分析组合的方法，其中该缀合物的一种或多种组分用于细胞富集、细胞分选和/或免疫荧光细胞标记，并且同一缀合物的一种或多种组分用于基因组分析。本文提供的方法包括(a)对细胞和/或细胞样品进行细胞富集、细胞分选和/或免疫荧光细胞标记，以及(b)使用荧光标记的带序列标签的特异性决定分子缀合物对相同的细胞和/或细胞样品进行基因组分析。在某些实施方案中，特异性决定分子组分是带序列标签的。在某些实施方案中，该方法首先包括使细胞和/或细胞样品与荧光标记的带序列标签的特异性决定分子缀合物接触。并且，在某些实施方案中，基因组分析发生在细胞富集、细胞分选和/或免疫荧光细胞标记之后。

2、本文还提供了带序列标签的荧光标记的特异性决定分子缀合物，其包含缀合至荧光标记组分的特异性决定分子组分，其中所述缀合物适用于本公开的一种或多种方法。在某些实施方案中，特异性决定分子组分是带序列标签的。在某些实施方案中，该荧光标记组分通过核酸接头附接到特异性决定分子组分，其中该核酸接头包含双链片段。在某些实施方案中，核酸接头是完全双链的。在某些实施方案中，核酸接头为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个核苷酸长中的任一者至约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸长中的任一者。在某些实施方案中，核酸接头是双链的并且为30个至70个核苷酸。在某些实施方案中，特异性决定分子组分包含pcr引物区、条形码区和捕获序列。在某些实施方案中，特异性决定分子组分还包含用于附接荧光标记组分的寡核苷酸序列。在某些实施方案中，荧光标记组分是基因组荧光体(genomicfluor)。在某些实施方案中，基因组荧光体是包含荧光部分和独特鉴定序列的多模式标记。

3、某些实施方案涉及用于进行本公开的方法的试剂盒。

4、某些实施方案涉及验证带序列标签的抗体的方法，该方法包括使包含核酸接头的基因组荧光体与带序列标签的抗体接触，并通过流式细胞术运行样品以评估抗体与其靶标的结合。

5、本文提供了一种调节本公开的多核苷酸修饰的生物分子生物缀合物的亮度的方法，该方法包括i)改变核酸接头的总长度，ii)改变核酸接头的完全双链区的长度，iii)改变核酸接头的单链部分的长度，和/或iv)使单链部分包含poly(a)、poly(t)、poly(g)、poly(c)序列和/或独特的核酸序列。