热稳定性优秀的阿洛酮糖差向异构酶变异体、其制备方法及利用其的阿洛酮糖的制备方法与流程

本发明涉及阿洛酮糖差向异构酶变异体等，更详细地涉及相比于来源于普氏梭杆菌(flavonifractor plautii)的d-阿洛酮糖3-差向异构酶，从果糖到阿洛酮糖的转换率及热稳定性得到提高的阿洛酮糖差向异构酶变异体及由此衍生的多种发明。

背景技术：

1、d-阿洛酮糖(d-allulose)作为果糖(fructose)3号碳的差向异构体(epimer)，也被称为d-psicose。d-阿洛酮糖(d-allulose)相比于砂糖，具有70％甜度(oshima2006)，但能量只有0.3％，因而是可适用为减肥食品的低热量甜味料的功能性单糖类(matsuo etal，2002)。并且，d-阿洛酮糖(d-allulose)具有吸收葡萄糖及抑制血糖的功能，可应用于糖尿病患者用饮食品、保护身体用饮食品等，可通过抑制参与肝中脂质合成的酶活性，抑制腹部脂肪堆积，因而可用于保健食品等多种功能性食品等(matsuo et al.2001；iida etal.2008；hayashi et al.2010；hossain et al.2011)。

2、由于如上所述的特征，阿洛酮糖为可代替砂糖的优选的原料，但属于作为极少存在于自然界的单糖类的稀少糖，因而为了适用于食品产业，需要有效生产阿洛酮糖的方法。现有的阿洛酮糖生产方法中主要经过化学过程生产。bilik等提议利用钼酸离子的催化作用将果糖转换为阿洛酮糖的方法。mcdonald从1,2：4,5-二-δ-异亚丙基-β-d-吡喃果糖(1,2：4,5-di-δ-isopropylidene-beta-d-fructopyranose)中通过3步骤的化学处理过程生产阿洛酮糖。并且，doner与乙醇和三甲胺一同加热果糖来生产阿洛酮糖。但是，这些化学生产方法存在消耗费用多，而其效率低，且产生相当多的副产物的缺点。

3、作为生物学阿洛酮糖生产方法，提议利用微生物的细胞反应从半乳糖醇(galactitol)、d-塔格糖或d-塔罗糖醇等中生产阿洛酮糖的方法(ken izumori)。但是该方法中底物属于稀少糖，因而难以应用于产业生产。产业化最有效的方法为寻找d-酮糖3-差向异构酶群中将果糖转换为阿洛酮糖的酶的方法。现有发表内容为将来源于解纤维梭菌h(10)(mu et al.2011)、根癌土壤杆菌(kim et al.2006)、菊苣假单胞菌(itoh atal.1994)、球形根瘤菌(zhang et al.2009)的d-塔格糖3-差向异构酶插入于大肠杆菌来转化之后，使用转化的大肠杆菌中表达的d-塔格糖3-差向异构酶从果糖中生产阿洛酮糖。

4、与使用酶从果糖中生产阿洛酮糖的技术相关地，在韩国授权专利公报第10-0744479号中公开利用来源于根癌土壤杆菌的阿洛酮糖差向异构酶的阿洛酮糖的生产方法，在韩国授权专利公报第10-0832339号中公开具有将果糖转换为阿洛酮糖的活性的中华根瘤菌属(sinorhizobium)yb-58kctc 10983bp和利用其将果糖转换为阿洛酮糖的方法，在韩国授权专利公报第10-1106253号中公开包含对具有催化从果糖到阿洛酮糖的转换的活性的根癌土壤杆菌c58的阿洛酮糖3-差向异构酶进行编码的多核苷酸的大肠杆菌及利用其从果糖中生产阿洛酮糖的方法，在韩国授权专利公报第10-1339443号中公开来源于属于根瘤菌属(genus rhizobium)的微生物的酮糖3-差向异构酶(ketose 3-epimerase)及利用其将果糖转换为阿洛酮糖的方法，在韩国授权专利公报第10-1318422号中公开来源于闪烁梭菌(clostridium scindens)的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及利用其从果糖中生产阿洛酮糖的方法，在韩国授权专利公报第10-1473918号中公开来源于普氏梭杆菌(flavonifractorplautii)的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及利用其从果糖中生产阿洛酮糖的方法。

5、但是，对于来源于微生物的野生型(wild type)的d-阿洛酮糖3-差向异构酶而言，从果糖到阿洛酮糖的转换率不高，热稳定性低，在最佳活性温度中失活的速度快，不适合产业化。因此，需要开发相比于来源于微生物的野生型(wild type)的d-阿洛酮糖3-差向异构酶，从果糖到阿洛酮糖的转换率或热稳定性得到提高的新的d-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。与d-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体相关地，在韩国公开专利公报第10-2014-0021974号中公开在基因水平上诱导突变来使高温中的阿洛酮糖转换速度变快，呈现稳定性的来源于原始介属密螺旋体zas-1的d-阿洛酮糖3-差向异构酶，在韩国授权专利公报第10-1203856号中公开通过来源于根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)的野生型阿洛酮糖差向异构酶的变异获取的热稳定性得到提高的阿洛酮糖差向异构酶变异体。并且，在韩国授权专利公报第10-2254411号中公开作为存在于来源于普氏梭杆菌(flavonifractorplautii)的野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列中第216位的氨基酸残基的甘氨酸(gly)由丝氨酸(ser)取代的新的阿洛酮糖差向异构酶变异体，在韩国公开专利公报第10-2021-0132405号中公开存在于来源于普氏梭杆菌(flavonifractor plautii)的野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列中第29位的色氨酸(trp)由赖氨酸(lys)取代，存在于第216位的甘氨酸(gly)由丝氨酸(ser)取代，同时存在于第234位的蛋氨酸(met)由异亮氨酸(ile)取代的新的阿洛酮糖差向异构酶变异体。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明在以往的背景下导出，本发明的第一个目的在于，提供相比于来源于普氏梭杆菌(flavonifractor plautii)的野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶，从果糖到阿洛酮糖的转换率及热稳定性得到提高的新的d-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。

3、本发明的第二个目的在于，提供制备新的d-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体的方法或制备新的d-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体所需的多种因素。

4、本发明的第三个目的在于，提供从果糖中制备阿洛酮糖的方法或从果糖中制备阿洛酮糖所需的多种因素。

5、技术方案

6、本发明的申请人曾专利申请作为存在于来源于普氏梭杆菌(flavonifractorplautii)的野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列中第216位的氨基酸残基的甘氨酸(gly)由丝氨酸(ser)取代的新的阿洛酮糖差向异构酶变异体，并被授权[韩国授权专利公报第10-2254411号(2021.05.14)]，专利申请存在于来源于普氏梭杆菌(flavonifractorplautii)的野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列中第29位的色氨酸(trp)由赖氨酸(lys)取代，存在于第216位的甘氨酸(gly)由丝氨酸(ser)取代，同时存在于第234位的蛋氨酸(met)由异亮氨酸(ile)取代的新的阿洛酮糖差向异构酶变异体[韩国公开专利公报第10-2021-0132405号(2021.11.04)]。在上述韩国授权专利公报第10-2254411号及韩国公开专利公报第10-2021-0132405号中公开的阿洛酮糖差向异构酶变异体相比于来源于普氏梭杆菌(flavonifractor plautii)的野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶，热稳定性得到改善，但当在60℃以上的高温中长时间进行从果糖到阿洛酮糖的转换反应时，酶活性降低，在用于大量生产阿洛酮糖的产业化观点上仍然需要改善。本发明的发明人为了提高在韩国公开专利公报第10-2021-0132405号中公开的阿洛酮糖差向异构酶变异体的从果糖到阿洛酮糖的转换率及热稳定性，利用蛋白质结构预测技术追加导出预测将与提高转换率及热稳定性相关的氨基酸残基位置候补，确认仅在使其中特定位置的氨基酸残基由另一个氨基酸残基取代时从果糖到阿洛酮糖的转换率及热稳定性得到提高，完成本发明。

7、为了解决上述第一个目的，本发明提供由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体。

8、为了解决上述第二个目的，本发明提供对由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体进行编码的多核苷酸。并且，本发明提供包含对由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体进行编码的多核苷酸的重组载体。并且，本发明提供对由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体进行编码的多核苷酸或利用包含上述多核苷酸的重组载体转化的重组菌株。并且，本发明提供阿洛酮糖差向异构酶变异体的制备方法，其包括：培养利用对由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体进行编码的多核苷酸或包含上述多核苷酸的重组载体转化的重组菌株来使阿洛酮糖差向异构酶变异体表达的步骤；以及从表达上述阿洛酮糖差向异构酶变异体的重组菌株的破碎物中分离阿洛酮糖差向异构酶变异体的步骤。

9、为了解决上述第三个目的，本发明提供包含由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体的阿洛酮糖生产用组合物。并且，本发明提供利用对由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体进行编码的多核苷酸或包含上述多核苷酸的重组载体转化的重组菌株、包含上述重组菌株的培养物或上述重组菌株的破碎物的阿洛酮糖生产用组合物。并且，本发明提供包括使果糖与由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体或包含上述阿洛酮糖差向异构酶变异体的组合物进行反应的步骤的阿洛酮糖的制备方法。并且，本发明提供包括使果糖与利用对由序列号5的氨基酸序列形成的阿洛酮糖差向异构酶变异体进行编码的多核苷酸或包含上述多核苷酸的重组载体转化的重组菌株、包含上述重组菌株的培养物、上述重组菌株的破碎物或这些中的一种以上的组合物进行反应的步骤的阿洛酮糖的制备方法。

10、发明的效果

11、本发明的新的阿洛酮糖差向异构酶变异体相比于来源于普氏梭杆菌(flavonifractor plautii)的野生型d-阿洛酮糖3-差向异构酶或d-阿洛酮糖差向异构酶变异体w29k/g216s/m234i，从果糖到阿洛酮糖的转换活性高，尤其在60℃以上的高温条件下热稳定性非常优秀，因而当进行用于大量生产阿洛酮糖的产业化水平的酶转换反应时，可防止污染，可缩短生产时间，可节减生产费用。