靶向颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸的制作方法

本发明涉及改变颗粒蛋白前体的剪接模式的反义寡核苷酸，以及它们在治疗神经系统疾患中的用途。此类反义寡核苷酸可以上调或恢复细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达。

背景技术：

1、颗粒蛋白前体(pgrn)是一种高度保守的分泌蛋白，在多种细胞类型中表达，在cns和外周组织中均存在。

2、中枢神经系统中分泌蛋白颗粒蛋白前体的缺乏导致神经退行性疾病额颞叶痴呆(ftd)。致病性颗粒蛋白前体突变通过单倍剂量不足导致颗粒蛋白前体水平损失约50％，并且导致tdp-43蛋白在神经元内聚集。颗粒蛋白前体在大脑内的许多过程中以细胞自主性方式和非自主性方式两者发挥支持和保护作用，这些过程包括神经突起生长、突触生物学、对外源性应激源的应答、溶酶体功能、神经炎症和血管生成。

3、颗粒蛋白前体直接和通过转化为颗粒体蛋白来调节溶酶体功能、细胞生长、存活、修复和炎症。颗粒蛋白前体在调节cns中与溶酶体功能相关联的小胶质细胞应答中起主要作用。导致蛋白质单倍剂量不足的颗粒蛋白前体基因的常染色体显性突变与家族性额颞叶痴呆相关，伴神经病理性额颞叶变性(ftld)，与43kda(tdp-43)内含物(ftld-tdp)的tar-dna结合蛋白的积累相关。纯合子grn突变与神经元蜡样质脂褐质沉积症(ncl)相关(townley，等人，neurology，2018年6月12日；90(24)：1127)。

4、最近，颗粒蛋白前体基因中的突变已确定为所有ftd(包括一些散发性病例)的约5％的原因。最近使用小鼠模型进行的研究已经阐明了颗粒蛋白前体在大脑中的表达(petkau等人，2010)。颗粒蛋白前体在神经发育晚期表达，用成熟神经元的标志物进行定位。颗粒蛋白前体在大部分大脑区域中的神经元中表达，在丘脑、海马体和大脑皮层中的表达水平最高。小胶质细胞也表达颗粒蛋白前体，并且表达水平被小胶质细胞活化上调。在ftd中已经确定出大约70种不同的颗粒蛋白前体基因突变，并且所有突变均降低颗粒蛋白前体水平或导致颗粒蛋白前体功能丧失。

5、因此，迫切需要能够增加颗粒蛋白前体的表达和/或活性的治疗剂。

技术实现思路

1、保留内含子1的5′部分的颗粒蛋白前体的剪接变体在大脑中，诸如在神经元或小胶质细胞中表达(capell等人the journal of biological chemistry，2014，289(37)，25879-25889)。该剪接变体包括内含子1的5′末端271个核苷酸，其总共3823个核苷酸。内含子1的271个核苷酸片段包括外显子2中经典下游aug(开放阅读框)上游的两个aug位点。来自这两个上游aug位点的翻译不会编码颗粒蛋白前体蛋白，并且由于提前终止密码子，转录本可能会经历无义介导的mrna衰变(nmd)。

2、wo2020/191212描述了可以靶向颗粒蛋白前体mrna的特异性寡核苷酸。在此，发明人已确定减少保留内含子1的5′部分的剪接变体会增加外显子1和外显子2剪接变体，并且进一步增加颗粒蛋白前体蛋白表达。

3、本发明提供颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸。这些反义寡核苷酸能够改变颗粒蛋白前体的剪接模式，特别是反义寡核苷酸可以上调外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达，减少保留内含子1的5′部分的颗粒蛋白前体内含子1-外显子2剪接变体的产生、增加颗粒蛋白前体蛋白的表达。这些反义寡核苷酸可被描述为颗粒蛋白前体剪接的调节剂，或颗粒蛋白前体外显子1-外显子2的激动剂。

4、本发明的反义寡核苷酸可用于恢复或增强细胞中颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接变体的表达。

5、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。

6、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的外显子1、内含子1和外显子2序列的剪接调节位点互补，诸如完全互补。

7、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含一个长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体转录本互补，诸如完全互补，该人颗粒蛋白前体mrna前体转录本包含人颗粒蛋白前体mrna前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2序列(seq id no 276)。

8、颗粒蛋白前体外显子1、内含子1和外显子2序列如下所示为seq id no：276。颗粒蛋白前体外显子1序列(以大写字母表示)对应于基因组ensemble(www.ensemble.org)染色体17位置44,345,123；至位置44,345,334。内含子1对应于基因组ensemble染色体17位置44,345,335至44,349,157，并且外显子2序列(以大写字母表示)对应于基因组ensemble染色体17位置44,349,158至位置44,349,302。

9、人颗粒蛋白前体mrna前体的外显子1、内含子1和外显子2序列(seq id no：276)：

10、

11、

12、

13、本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。

14、本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为12个至16个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。

15、本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为12个至16个核苷酸并且包含长度为12个至16个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。

16、本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为12个至18个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。

17、本发明提供一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为12个至18个核苷酸并且包含长度为12个至18个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。

18、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体mrna前体的剪接调节位点互补，诸如完全互补。

19、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no：276内包含的核苷酸序列互补，诸如完全互补。

20、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no：276的核苷酸441至468内包含的核苷酸序列互补，诸如完全互补。

21、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no：276的核苷酸441至462内包含的核苷酸序列互补，诸如完全互补。

22、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列互补，诸如完全互补：seq id no 277、seq id no 278、seq id no 279和seq id no 280。

23、seq id no：71(seq id no 277)的靶位点

24、attcttgacccagctc

25、seq id no：73(seq id no 278)的靶位点

26、cacaccattcttgacc

27、seq id no：74(seq id no 279)的靶位点

28、gaccacaccattcttg

29、seq id no：75(seq id no 280)的靶位点

30、agggaccacaccattc

31、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no：276的核苷酸268至283内包含的核苷酸序列互补，诸如完全互补。

32、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与seq id no 281互补，诸如完全互补。

33、seq id no：134(seq id no：281)的靶位点

34、gccatgtgagcttgag

35、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列互补，诸如完全互补：seq id no：291和seq id no：292。

36、该反义寡核苷酸的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为8个至40个、12个至40个、12个至20个、10个至20个、14个至18个、12个至18个或16个至18个核苷酸。

37、连续核苷酸序列的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。在一些实施例中，连续核苷酸序列具有的长度为至少12个核苷酸，诸如长度为12个至16个核苷酸或12个至18个核苷酸的长度。

38、在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度与反义寡核苷酸的长度相同。

39、在一些实施例中，反义寡核苷酸由连续核苷酸序列组成。

40、在一些实施例中，反义寡核苷酸为连续核苷酸序列。

41、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：276内包含的核苷酸序列完全互补。

42、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：276的第441至468个核苷酸内包含的核苷酸序列完全互补。

43、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：276的第441至462个核苷酸内包含的核苷酸序列完全互补。

44、在一些实施例中，连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列互补：seq idno 277、seq id no 278、seq id no 279和seq id no 280。

45、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：277完全互补。

46、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：278完全互补。

47、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：279完全互补。

48、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：280完全互补。

49、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：276的第256至283个核苷酸内包含的核苷酸序列完全互补。

50、在一些实施例中，连续核苷酸序列与seq id no：281完全互补。

51、在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少8个连续核苷酸。

52、在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少9个连续核苷酸。

53、在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少10个连续核苷酸。

54、在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少11个连续核苷酸。

55、在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少12个连续核苷酸。

56、在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少13个连续核苷酸。

57、在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少14个连续核苷酸。

58、在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：seq id no51、seq id no 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no63、seq id no 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no100、seq id no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no 252，或其至少15个连续核苷酸。

59、在一些实施例中，连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：seq id no 51、seq idno 52、seq id no 53、seq id no 54、seq id no 55、seq id no 62、seq id no 63、seq idno 67、seq id no 71、seq id no 73、seq id no 74、seq id no 75、seq id no 100、seqid no 134、seq id no 135、seq id no 196、seq id no 220、seq id no 228和seq id no252。

60、在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 71。

61、在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 73。

62、在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 74。

63、在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 75。

64、在一些实施例中，连续核苷酸序列为seq id no 134。

65、本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：seq id no：289和seq id no：290。

66、本发明提供了一种被分离、纯化或制造的反义寡核苷酸。

67、在一些实施例中，反义寡核苷酸为反义寡核苷酸混聚物或全聚物或包含反义寡核苷酸混聚物或全聚物。在一些实施例中，连续核苷酸序列为混聚物或全聚物。

68、本发明提供了包含根据本发明的反义寡核苷酸以及与所述反义寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分的缀合物。

69、本发明提供了共价连接至至少一个缀合物部分的反义寡核苷酸。

70、本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用盐。

71、本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸呈药用盐的形式。在一些实施例中，药用盐为钠盐、钾盐或铵盐。

72、本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用钠盐。

73、本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用钾盐。

74、本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用铵盐。

75、本发明提供了药物组合物，其包含：本发明的反义寡核苷酸，或本发明的缀合物，以及药用的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

76、本发明提供药物组合物，其包含：本发明的反义寡核苷酸，或本发明的缀合物，以及药用盐。例如，该盐可以包含金属阳离子，诸如钠盐、钾盐或铵盐。

77、本发明提供了根据本发明的药物组合物，其中该药物组合物包含：本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物，或本发明的药用盐，以及水性稀释剂或溶剂。

78、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、或本发明的药用盐的溶液，诸如磷酸盐缓冲生理盐水。适当地，本发明的溶液诸如磷酸盐缓冲盐水溶液为无菌溶液。

79、本发明提供了一种用于增强表达颗粒蛋白前体的细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达的方法，该方法包括向该细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。在一些实施例中，该方法为体外方法。在一些实施例中，该方法为体内方法。

80、在一些实施例中，该细胞为人细胞或哺乳动物细胞。

81、本发明提供了用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患的方法，其包括向患有或易患颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。

82、本发明提供用于治疗或预防神经系统疾病的方法，其包括向患有或易患神经系统疾病的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。在一个实施例中，神经系统疾病可以为tdp-43病理状况。

83、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸，其用作药物。

84、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸，其用于疗法中。

85、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用作药物。

86、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于疗法中。

87、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于治疗神经系统疾病。在一个实施例中，神经系统疾病可以为tdp-43病理状况。

88、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。

89、本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防神经系统疾病。在一个实施例中，神经系统疾病可以为tdp-43病理状况。

90、本发明提供本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。

91、在一些实施例中，本发明的方法、用途或供使用的反义寡核苷酸用于治疗额颞叶痴呆(ftd)、神经病理性额颞叶变性或神经发炎。在其他实施例中，本发明的方法、用途或供使用的反义寡核苷酸用于治疗肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病、脊髓小脑共济失调3型、肌病或慢性创伤性脑病。

92、在一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no71对应的结构：

93、

94、在另一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no73对应的结构：

95、

96、在另一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no74对应的结构：

97、

98、在另一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no75对应的结构：

99、

100、在另一个方面中，本发明包括寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有与seq id no134对应的结构：

101、

102、在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物gagctgggtcaagaat(seq id no：71)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。

103、在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物ggtcaagaatggtgtg(seq id no：73)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。

104、在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物cagaatggtgtggtc(seq id no 74)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。

105、在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物gaatggtgtggtccc(seq id no 75)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。

106、在另一个方面中，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物ctcaagctcacatggc(seq id no 134)，其中大写字母代表β-d-氧基lna核苷，小写字母代表dna核苷，所有lna c均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键合均为硫代磷酸酯核苷间键合。