用于富养罗尔斯通氏菌菌株共培养的系统的制作方法

本发明涉及一种包含细菌富养罗尔斯通氏菌(ralstonia eutropha)(钩虫贪铜菌(cupriavidus necator))的两种不同菌株的共培养系统及其用于生产增值化合物的用途。

背景技术：

0、发明背景

1、共培养技术具有广泛的应用，并且在合成生物学中具有重要意义，因为人们普遍看到了多物种细胞联合体在生产新的和已知的工业或医学化合物方面具有巨大潜力，而且这些系统已被证明相对于其各自的单培养具有更高的生产力以及其他优势(bernstein等,2012)。

2、在某些情况下，菌株不容易单培养，因为菌株没有表现出所需的体内生理行为，例如代谢给定底物和/或合成目标产物的高效能力，但另一个细胞群的存在可能会改善培养成功性或细胞行为，例如通过转化复杂底物或去除累积代谢产物或培养基化合物的生长抑制作用。

3、例如，聚羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate，pha)是一组具有广泛工业应用的天然可生物降解聚酯，其已经用单一pha生产细菌菌株从广泛可得的碳源如蔗糖或水解的富含蔗糖的底物中生产得到(jian yu,2016；sen等,2019)。然而，该过程通常以完全消耗一种糖(葡萄糖)而累积另一种糖(果糖)而结束。之前曾报道了pha累积菌株对这两种糖的消耗率存在差异(raberg等2011；dalsasso等2019)。这种对单个糖的选择性消耗不仅影响底物产率，而且累积的较高糖浓度也抑制细菌菌株的生长和pha生产率。

4、一种公知的微生物生产平台菌株是土壤细菌富养罗尔斯通氏菌，也称为钩虫贪铜菌。已知野生型菌株富养罗尔斯通氏菌h16(钩虫贪铜菌h16，dsm 428)在暴露于过量的糖底物时会生产和螯合pha塑料，富养罗尔斯通氏菌h16已被用作工业生产pha和单细胞蛋白质的平台。由于广泛的底物利用和生长至高细胞密度的能力，该菌株在过去几十年中被深入研究和制备，成为一个稳健的微生物细胞工厂，类似于已经在工业水平上使用的其他微生物菌株，如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)或大肠杆菌(escherichia coli)。富养罗尔斯通氏菌h16能够自养和异养生长，它利用co2、h2、o2和合成气等气体、短链有机酸、糖、脂肪酸和脂质以及芳香族化合物。除了持续从不同环境中分离富养罗尔斯通氏菌种的新菌株之外，基因组序列、诱变、表达载体和启动子系统的可用性使这些菌株能够正确工程化以生产许多生物技术产物，如聚硫酯、中链长度的聚(3-羟基烷酸酯)、聚(2-羟基烷酸酯)、聚(4-羟基烷酸酯)、藻青素等生物聚合物，和增值化学品如(r)-羟基烷酸、2-甲基柠檬酸，以及不同的醇类和烯烃如丁醇、异丁醇或异丙醇。该菌株还用于生物能源生产，如燃料电池、光驱动氢，或生产非醇类生物燃料分子，如聚羟基烷酸酯的甲酯或甲基酮。此外，富养罗尔斯通氏菌具有成为用于重组蛋白质表达系统的强效宿主菌株的巨大潜力(lu等2016；raberg等2018)。

5、富养罗尔斯通氏菌的突变或工程化菌株可以利用更广泛的底物，尤其是混合糖或短链和中链脂肪酸，它们是通过农业和食品工业水解产生的，例如富含纤维素-富含脂肪-和富含蔗糖的料流。已经研究了将富养罗尔斯通氏菌菌株与芽孢杆菌、假单胞菌或酵母菌等其他微生物或细菌种共培养，以共同利用底物混合物并最大化该方法的产率和生产力(rebocho等,2020；tan等,2014)。然而，由于来自不同种的微生物菌株在其所需的和最佳的生长培养基和条件方面存在很大差异，因此提供一种不仅与给定单培养菌株的生长和培养基条件相容，而且还能够将其对所需化合物的生产量增加到比单培养更大的程度是极具挑战性的。此外，任何可能被发现与共培养相容的微生物菌株都可能产生一系列其他不需要的代谢产物，这些代谢产物可能会产生不希望的影响，例如需要额外的步骤来分离这些化合物。

6、因此，用于培养钩虫贪铜菌种的菌株或变体的改进共培养系统存在未满足的需求，该系统解决了培养条件、优化底物消耗、分离共同生产的代谢产物和提高目标化合物的生产率等问题。

技术实现思路

1、本发明涉及属于钩虫贪铜菌(富养罗尔斯通氏菌)种的两种细菌菌株的共培养系统，这两种菌株的不同之处在于它们利用和/或代谢不同碳源的能力不同。

2、事实上，本发明人已发现利用果糖的钩虫贪铜菌，例如钩虫贪铜菌h16(dsm 428)，和利用葡萄糖的钩虫贪铜菌，例如钩虫贪铜菌h1g+3(dsm 545)，可以使用水解蔗糖作为碳源一起培养。钩虫贪铜菌dsm 428是野生型且使用果糖作为碳源，而钩虫贪铜菌dsm 545是钩虫贪铜菌h16的突变体，相对于果糖更偏好使用葡萄糖作为碳源。与单独培养任一菌株相比，这样的共培养系统可以确保更高的产物产率和更高的生产力。通过避免累积的且未被细菌利用的糖的生长抑制作用获得更高的生产力。使用所公开的共培养系统已经获得70g/l细胞干重和甚至更高的pha产率。

3、本文公开的共培养系统和方法允许将总原材料最佳转化为最终产物。因此，废料，例如残留的果糖或葡萄糖，将最小化。

4、本公开的一个方面涉及用于生产单细胞蛋白质材料、丙酮酸酯(pyruvate)和/或丙酮酸酯的衍生产物的共培养系统，所述共培养系统包含微生物组分和底物，

5、其中微生物组分包含第一微生物细胞和第二微生物细胞或由第一微生物细胞和第二微生物细胞组成，其中第一微生物细胞和第二微生物细胞是钩虫贪铜菌种的不同菌株，其中所述底物包含至少第一碳源和第二碳源，第一碳源不同于第二碳源，

6、其中第一微生物细胞能够代谢第一碳源，并且

7、其中第二微生物细胞能够代谢第二碳源。

8、本公开的一个方面涉及一种生产钩虫贪铜菌的单细胞蛋白质材料的方法，所述方法包括：

9、a)提供原料；

10、b)提供本文定义的共培养系统的微生物组分；和

11、c)使原料与共培养系统的微生物组分接触，从而使原料发酵以获得包含丙酮酸酯和/或丙酮酸酯的衍生产物的发酵组合物。

12、本公开的一个方面涉及一种用于生产丙酮酸酯和丙酮酸酯的衍生产物的方法，所述方法包括：

13、a)提供原料；

14、b)提供本文定义的共培养系统的微生物组分；和

15、c)使原料与共培养系统的微生物组分接触，从而使原料发酵以获得包含丙酮酸酯和/或丙酮酸酯的衍生产物的发酵组合物。

16、本公开的一个方面涉及用于生产单细胞蛋白质材料、丙酮酸酯和/或丙酮酸酯的衍生产物的多部分试剂盒，该多部分试剂盒包含第一微生物细胞和第二微生物细胞以及使用说明或由第一微生物细胞和第二微生物细胞以及使用说明组成，其中第一微生物细胞和第二微生物细胞是钩虫贪铜菌种的不同菌株，

17、其中第一微生物细胞能够代谢第一碳源，并且其中第二微生物细胞能够代谢第二碳源，其中第一碳源不同于第二碳源。

18、本公开的一个方面涉及一种用于生产单细胞蛋白质材料、丙酮酸酯和/或丙酮酸酯的衍生产物的系统，所述系统包括发酵反应器，所述发酵反应器被配置用于执行本文所述的用于微生物生产生长相关代谢产物如丙酮酸酯和/或丙酮酸酯的衍生产物的方法，因此通过使用本文所述的共培养系统。

19、本公开的一个方面涉及包含通过本文公开的方法获得的天然聚羟基烷酸酯颗粒的组合物。pha生物塑料累积为细胞内颗粒，其可以以其天然颗粒形式进行生物提取和回收。

20、本公开的一个方面涉及通过本文公开的方法获得的天然聚羟基烷酸酯颗粒用于制造生物塑料的用途。

21、本公开的一个方面涉及包含本文公开的天然聚羟基烷酸酯颗粒的组合物用于制造生物塑料的用途。