基于荧光融合的异源肽生产

背景技术：

1、本发明涉及在宿主细胞中产生感兴趣异源多肽的方法，其中该方法包括在宿主细胞中表达包含感兴趣的异源多肽和荧光融合配偶体的融合蛋白，所述宿主细胞被修饰以包括在rna温度计(thermometer)的控制下编码裂解蛋白的核酸。本发明进一步涉及大肠杆菌细胞，其表达所述融合蛋白以及包括在rna温度计的控制下编码裂解蛋白的核酸。

2、肽在生理系统中无处不在，其履行着对生命至关重要的功能。仅在人类生理学中，肽就起到激素、神经递质、生长因子、离子通道配体或抗菌剂的作用，这使得肽成为有吸引力的治疗资源。

3、对新药和工业酶的需求越来越大，由于下一代测序的结果，正在创造一个研究人员观察肽或蛋白(他们希望测试其药学或工业特性)的市场。此外，目前有价值的重组蛋白的产生将总是会从能够提高产量和生产率的技术中获益。因此，蛋白合成和异源蛋白表达等技术正在获得应用。

4、感兴趣的肽和小蛋白通常是化学合成的，与异源表达相比，其产量要高得多。虽然异源表达是一种利用异源宿主的成熟技术，更适合高产量生产，但仍然受到指导蛋白折叠的或翻译后修饰的难以捉摸的物理定律的制约。因此，异源表达应该与化学合成携手合作，从基因蓝图中提供物理结构，这对这个领域的许多人来说是显而易见的。然而，生物活性蛋白由于其固有的物理特性，使其一开始就是良好的药物和酶的候选者，因此在表达方面具有挑战性。因此，这些蛋白质的表达需要特定的专业知识和技术，这往往导致人们倾向于采用多次反复的化学合成法或经典的纯化法。这两种方法都会导致药物特性所需时间和资源的增加。本发明旨在提供稳健且快速的平台，在目标品种和产量方面推动异源表达的界限。具体地，本技术的发明人开发了一种用于生产多种重组蛋白的方法。该方法依赖于三项关键技术相互关联，使其具有多功能性和成本效益，用于提高其生产的各种重组蛋白的产量。本发明的方法使用旨在能够实现稳定的肽表达的荧光蛋白融合配偶体，其通过猝灭毒性、增加溶解度和促进翻译后修饰而拓宽大肠杆菌的能力。通过提供前所未有的实时的体内和稳健的体外反馈，融合配偶体的自发荧光能够实现快速优化，这增加了产量。此外，自裂解的转录后温度调节减少了生产成本、时间和精力，使该方法比传统方法更快、更具成本效益。使用本发明的方法，发明人已经证明其能够：1)增加了之前认为不会有表达结果的重组蛋白的范围和产量；2)通过荧光融合蛋白的体内检测，简化了对表达的优化；3)通过在生产过程中的任何时候快速观察荧光蛋白的能力，减少了用于故障排除的时间；以及4)通过实施不需要昂贵诱导剂的自溶技术，降低了蛋白生产成本，提高了产量。

技术实现思路

1、本发明涉及用于在宿主细胞、优选大肠杆菌细胞中产生感兴趣的异源多肽的方法，包括在宿主细胞中表达包含感兴趣的异源多肽和荧光融合配偶体的融合蛋白。具体地，宿主细胞被修饰以包括编码裂解蛋白的核酸，其在rna温度计的控制下。本发明还涉及修饰的大肠杆菌细胞，其表达本发明的融合蛋白，以及包括在rna温度计的控制下编码裂解蛋白的核酸。

2、根据本发明的第一方面，提供在宿主细胞中产生一种或多种感兴趣的异源多肽的方法，该方法包括或由以下组成：

3、(i)提供编码融合蛋白的表达载体，所述融合蛋白包含所述感兴趣的异源多肽和荧光融合配偶体；

4、(ii)用步骤(i)的表达载体转化宿主细胞，其中宿主细胞和/或表达载体被修饰以包括编码启动子的核酸(可以是组成型的，例如静止期启动子，或诱导型的，例如t7启动子)，启动子可操作地连接至裂解蛋白和rna温度计，进一步地其中编码裂解蛋白的核酸的表达受启动子的调节，并且裂解蛋白的翻译受rna温度计的调节；

5、(iii)在宿主细胞中表达融合蛋白；

6、(iv)改变宿主细胞的温度以诱导裂解蛋白的表达，其中裂解蛋白的表达导致宿主细胞的裂解；以及

7、(v)从宿主细胞回收融合蛋白。

8、优选地，编码rna温度计的核酸转录地融合至启动子，转录地或翻译地融合至编码裂解蛋白的核酸。更优选地，编码rna温度计的核酸位于编码裂解蛋白的核酸的上游。此外，编码启动子、裂解蛋白和rna温度计的核酸可以包括被rna温度计识别的核苷酸序列，例如rna天然识别和控制的核苷酸序列。

9、在该方法的第一个实施方案中，融合蛋白可以包括纯化标签，该方法可以进一步包括纯化回收的融合蛋白的步骤。本领域技术人员将理解，可以使用任何已知的纯化标签。优选地，纯化标签可以是用于固定化金属亲和色谱法(imac)纯化的组氨酸(his)标签或用于pull-down测定法的谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签。可替选地，融合蛋白可以包含多于一个纯化标签，如用于imac纯化的组氨酸(his)标签和用于pull-down测定法的谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签。

10、根据本发明的方法的第二个实施方案，融合蛋白可以包括蛋白酶切割位点，该方法可以进一步包括在回收后从感兴趣的异源多肽上切割下荧光融合配偶体的步骤。本领域技术人员应当理解，可以考虑任何已知的蛋白酶切割位点用于通过蛋白酶进行切割。具体地，蛋白酶切割位点可以选自welqut位点、凝血酶或胰蛋白酶切割位点、nisp或胰蛋白酶切割位点、tev切割位点、因子xa切割位点及其任何组合，所述welqut位点具有由具有序列tgggaactgcag(seq id no:2)的核酸编码的氨基酸序列welq(seq id no:1)、所述凝血酶或胰蛋白酶切割位点具有由具有序列ctagtaccacgc(seq id no:4)的核酸编码的氨基酸序列lvpr(seq id no:3)、所述nisp或胰蛋白酶切割位点具有由具有序列gcgagcccgcgc(seq idno:6)的核酸编码的氨基酸序列aspr(seq id no:5)、所述tev切割位点具有由具有序列gaaaacttgtattttcaaggc(seq id no:8)的核酸编码的氨基酸序列enlyfqg(seq id no:7)、所述因子xa切割位点具有由具有序列attgaaggtcgt(seq id no:10)的核酸编码的氨基酸序列iegr(seq id no:9)。

11、在本发明的方法的第三个实施方案中，融合蛋白可以包括分泌肽。可以使用的信号肽可以包括，但不限于那些通过sec(一般分泌)、srp(信号识别颗粒)或tat(双精氨酸易位)途径指导分泌的信号肽。对于sec的依赖性分泌，可以使用来自lamb、male、ompa、ompf、ompt或phoa的序列。对于srp依赖性分泌，可以使用来自dsba、sfmc、tolb或tort的序列。对于tat依赖性分泌，信号肽可以是可变的，包含p-r-r-x-h-h基序(其中p、r、x和h分别表示极性残基、精氨酸、任何残基和疏水性残基)。信号肽可以与大肠杆菌同源，也可以是来自其他物种(如pelb(胡萝卜软腐欧文氏菌(erwinia carotovora))和spa(葡萄球菌(staphylococcus)))的异源序列。

12、根据本发明的方法的第四个实施方案，荧光融合配偶体优选是单体的，可以选自绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白和红色荧光蛋白。本领域技术人员应当理解，多种荧光融合蛋白是已知的，可以使用本领域已知的任何荧光融合蛋白。例如，荧光融合配偶体可以是具有seq id no:11的氨基酸序列的绿色荧光蛋白、或由具有seqid no:12的核苷酸序列的核酸编码的绿色荧光蛋白。可替选地，荧光融合配偶体可以是红色荧光蛋白，如具有seq id no:13的氨基酸序列的mcherry、或由具有seq id no:14的核苷酸序列的核酸编码的mcherry。本领域技术人员应当理解，本发明的方法可以包括在任意点检测荧光融合配偶体的步骤。

13、在本发明的方法的进一步的实施方案中，感兴趣的异源多肽可以是任何感兴趣的异源多肽，特别是选自以下的感兴趣的异源多肽：羊毛硫肽(lanthipeptide)，包括乳链菌肽(nisin)、epilancin 15x和pep5；细菌素，包括植物菌素(plantaricin)423和蒙氏菌素(mundticin)st4sa；李斯特菌溶血素o；acta；和自噬肽x。

14、在本发明的方法的另一个实施方案中，裂解蛋白可以是本领域已知的任何裂解蛋白，例如，裂解蛋白可以是细胞内溶素或细菌胞壁质水解酶。在一个非限制性的示例中，裂解蛋白源自噬菌体dna，并且具有seq id no:15或17的氨基酸序列、或由具有seq id no:16或18的核苷酸序列的核酸编码。

15、在本发明的方法的又进一步的实施方案中，rna温度计可以包括，但不限于具有seq id no:19-27或seq id no:105-111中任一个的核酸序列的rna温度计。rna温度计可以是天然存在的，如在λ噬菌体和细菌中发现的rna温度计，也可以作为新序列合成。此外，组成型启动子(例如，静止期启动子)或诱导型启动子(例如，t7)的用途可以用于控制编码rna温度计和裂解基因的核酸的转录。使用静止期启动子会导致由rna温度计和裂解基因组成的mrna的转录延迟。这允许提高mrna的稳定性，通过延迟裂解基因的表达来减少细胞的代谢负荷。合适的静止期启动子可以包括具有seq id no:74-76中任一个的核酸序列的启动子。此外，启动子和rna温度计的合适组合可以包括具有如seq id no:77-100中任一个所示序列的组合。

16、根据本发明方法的进一步的实施方案，宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。

17、根据本发明的第二个方面，提供大肠杆菌细胞，其包含：(i)至少一种编码融合蛋白的表达载体(包括具有seq id no:101或seq id no:-102所示序列的载体)，所述融合蛋白包含感兴趣的异源多肽和荧光融合配偶体；以及(ii)编码与裂解蛋白和rna温度计可操作地连接的启动子的核酸，其中rna温度计能够调节裂解蛋白的翻译。在一个实施方案中，(ii)中的核酸可以提供在(i)的表达载体上。在可替选的实施方案中，可以在与(i)的表达载体相容并共转化的不同表达载体上提供(ii)的核酸。

18、在本发明细胞的第一个实施方案中，融合蛋白可以包括用于纯化融合蛋白的纯化标签。本领域技术人员将理解，可以使用任何已知的纯化标签。优选地，纯化标签可以是用于imac纯化的组氨酸(his)标签、或用于pull-down测定法的谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签。可替选地，融合蛋白可以包含多于一个纯化标签，如用于imac纯化的组氨酸(his)标签和用于pull-down测定法的谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签。

19、根据本发明的细胞的第二个实施方案，融合蛋白可以包括用于从感兴趣的异源多肽上切割下荧光融合配偶体的蛋白酶切割位点。本领域技术人员应当理解，任何已知的蛋白酶切割位点可以用于通过蛋白酶进行切割。具体地，蛋白酶切割位点可以选自welqut位点、凝血酶或胰蛋白酶切割位点、nisp或胰蛋白酶切割位点、tev切割位点、因子xa切割位点及其任何组合，所述welqut位点具有由具有序列tgggaactgcag(seq id no:2)的核酸编码的氨基酸序列welq(seq id no:1)、所述凝血酶或胰蛋白酶切割位点具有由具有序列ctagtaccacgc(seq id no:4)的核酸编码的氨基酸序列lvpr(seq id no:3)、所述nisp或胰蛋白酶切割位点具有由具有序列gcgagcccgcgc(seq id no:6)的核酸编码的氨基酸序列aspr(seq id no:5)、所述tev切割位点具有由具有序列gaaaacttgtattttcaaggc(seq idno:8)的核酸编码的氨基酸序列enlyfqg(seq id no:7)、所述因子xa切割位点具有由具有序列attgaaggtcgt(seq id no:10)的核酸编码的氨基酸序列iegr(seq id no:9)。

20、在本发明细胞的第三个实施方案中，融合蛋白可以包括分泌肽。

21、根据本发明的细胞的第四个实施方案，荧光融合配偶体可以选自绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白和红色荧光蛋白。本领域技术人员应当理解，多种荧光融合蛋白是已知的，可以使用本领域已知的任何荧光融合蛋白。例如，荧光融合配偶体可以是具有seq id no:11的氨基酸序列的绿色荧光蛋白、或由seq id no:12的核苷酸序列编码的绿色荧光蛋白。可替选地，荧光融合配偶体可以是红色荧光蛋白，如具有seq idno:13的氨基酸序列的mcherry、或由seq id no:14的核苷酸序列编码的mcherry。

22、在本发明的细胞的进一步的实施方案中，感兴趣的异源多肽可以是任何感兴趣的异源多肽，例如选自以下的感兴趣的异源多肽：羊毛硫肽，包括乳链菌肽、epilancin 15x和pep5；细菌素，包括植物菌素423和蒙氏菌素st4sa；李斯特菌溶血素o；acta；和自噬肽x。

23、根据本发明的细胞的进一步的实施方案，裂解蛋白可以是本领域已知的任何裂解蛋白，例如，裂解蛋白可以是细胞内溶素或细菌胞壁质水解酶。在一个非限制性的示例中，裂解蛋白源自噬菌体dna，具有seq id no:15或17的氨基酸序列或由seq id no:16或18的核苷酸序列编码。

24、在本发明的细胞的又进一步的实施方案中，rna温度计可以包括，但不限于具有seq id no:19-27或seq id no:105-111中任一个的核酸序列的rna温度计。rna温度计可以是天然存在的，如在λ噬菌体和细菌中发现的rna温度计，也可以作为新序列合成。控制rna温度计和裂解蛋白的表达的启动子可以是组成型启动子(例如，具有如seq id no:74-76中任一项所示的序列的静止期启动子)、或诱导型启动子(例如，t7)。此外，启动子和rna温度计的合适组合可以包括具有如seq id no:77-100中任一个所示序列的组合。

25、根据本发明的第三个方面，提供了一种试剂盒，其包含或由以下组成：(i)至少一个用于表达融合蛋白的表达载体，所述融合蛋白包含感兴趣的异源多肽和荧光融合配偶体；以及(ii)大肠杆菌细胞，其中细胞和/或表达载体包含编码启动子的核酸(包括组成型启动子(例如静止期启动子)或诱导型启动子(例如t7)，所述启动子可操作地连接至裂解蛋白和rna温度计，其中rna温度计能够调节裂解蛋白的翻译。