利用固定化的生物纳米催化剂进行模块化聚糖生产的制作方法

本发明提供了利用固定化生物纳米催化剂的聚糖的模块化无细胞从头合成。本发明提供了用于使用一种或多种固定在生物纳米催化剂(bnc)内的酶来模块化生产聚糖的材料，特别是磁性材料，所述bnc进而以模板形式形成在磁性支架上。模板化bnc可以在模块化流动池内部用于流动制造，或者可以用于批量处理。因此，本发明提供了利用以连续模块组织的组合生物纳米催化剂(bnc)的确定多糖的无细胞生产。可将模块化流动池混合和匹配用于高度可定制和高效的制造过程。在优选实施方案中，生产人乳寡糖(hmo)。

背景技术：

0、技术背景

1、生物催化作为一种绿色技术，相对于常规昂贵和低效的工艺，在化学生产中变得越来越受欢迎。其应用包括食品成分、香料、香精、日用品和精细化学品以及活性药物的生产。然而，当以工业规模生产化学品时，酶的活性和负载量会急剧下降，导致性能显著下降。

2、磁性酶固定化涉及酶在中孔磁性簇中的截留，所述中孔磁性簇围绕酶自组装(水平1)。固定化效率取决于许多因素，包括酶和纳米颗粒的初始浓度、酶表面的性质、酶的静电势、纳米颗粒表面的性质和接触时间。在生物催化过程中用于工业目的的酶应该是高效的，在过程之前和过程中是稳定的，在几个生物催化循环中是可重复使用的，并且是经济的。

3、磁性纳米颗粒的中孔聚集体可以被结合到连续的或颗粒的大孔支架中(水平2)。支架可以是或可以不是磁性的。此类支架描述于wo2014/055853、wo2017/180383和corgie等人chem.today34(5):15-20(2016)，通过引用以其整体并入本文。高磁性支架被设计成固定、稳定和优化任何酶。这包括高负荷和全活性以及用于生产例如小分子的全酶系统。

4、选择性激光烧结(sls)是添加制造(am)技术，其使用激光作为能源来烧结诸如塑料、金属、陶瓷、玻璃粉末、尼龙或聚酰胺等粉末材料。自动瞄准由3d模型(例如，增材制造文件、amf或cad文件)定义的空间中的点的激光器将材料结合在一起以产生固体结构。在扫描每个横截面之后，将粉末床降低一层的厚度，在顶部施加新的一层材料，并且重复该过程直至完成部件。有许多不同的技术，诸如立体光刻(sla)或熔融沉积成型(fdm)。

5、sls类似于直接金属激光烧结(dmls)，但在技术细节上有所不同。dslm使用了类似的概念，但是在dslm，材料是完全熔化的，而不是烧结的。这允许人们制造具有不同性质(例如晶体结构和孔隙率)的材料。sls是相对较新的技术，可以扩展到商业规模的制造过程。

6、连续流处理开始于以特定流速将两股或更多股不同反应物泵入单个池中。发生反应，在出口处收集含有所得化合物的物流。该溶液也可以被引导到后续的流动反应器回路中以产生终产物。连续流动处理提供了更好的反应控制和再现性。这是一种模块化、可定制的方法。高度模块化允许人们配置池以满足特定反应的要求。

7、聚糖是复杂的碳水化合物结构，是细胞表面的主要分子，是细胞、细胞外基质和病原体之间的第一接触点。人们对提高这些分子在研究、临床前和商业应用中的可及性和可负担性非常感兴趣。

8、疾病预防控制中心最近的一项研究发现，大约五分之一的新生儿母亲从未开始母乳喂养，大多数(>70％)没有达到6个月的目标，而是广泛或完全依赖商购可得的婴儿配方奶粉。据估计，不遵守母乳喂养建议会给美国儿科医疗保健成本(直接)增加额外25亿美元，其中发病率和死亡率的总负担总计138亿美元。(vera m,lc nm.implementation ofmother-friendly workplace policies in hong kong,hkjgom 2015；15(1)11.

9、人乳寡糖是母乳的第三大成分。它们在商业上尤其重要。例如，它们充当特殊有益菌的代谢底物，从而塑造肠道微生物群系(microbiome)。然而，更复杂和分支的hmo(>4dp(即聚合度))似乎主要是预防性的，并作为病毒、细菌的可溶性诱饵或原生动物寄生虫粘附素，从而防止粘附到婴儿或成人的粘膜表面。

10、此外，hmo还可调节上皮细胞和免疫细胞的反应，减少过度的粘膜白细胞浸润和活化。这些特性与发生坏死性小肠结肠炎和其它感染以及自身免疫性炎症的风险较低有关。

11、虽然一些简单的益生菌hmo可通过发酵有效地生产用于婴儿配方奶粉(2’fl，3dp)，但复杂和分支的hmo是难以获得的。微生物生产仅限于简单的无支链糖和短链糖，细菌可以分泌毒素，必须过滤掉。酵母发酵不需要去除毒素，整个过程涉及更少的步骤，降低了生产成本，使产品更容易规模化。然而，工程生物体是密集的，并不能保证放大的能力。

12、更复杂的支链多糖已经通过化学催化以高成本少量生产。为了制造hmo，糖需要首先被活化，以便能够顺序地转移到生长结构中。例如，活化的岩藻糖(l-岩藻糖-1-gdp)和活化的唾液酸(唾液酸-1-cmp)的价格分别为每克35,000美元和每克8,000美元，而l-岩藻糖和l-唾液酸的价格仅为每克10美元和每克5.5美元，任何复杂聚糖的价格为每克数十万美元，例如，目前确定的dp5聚糖的价格为每克300,000美元到3,800,000美元不等。https://academic.oup.com/glycob/article/13/7/41r/612936。

13、无细胞系统在生物制造中已经引起了人们的兴趣，但是存在挑战(m.p.cordosomarque等人，adv.biochem.eng.biotechnol.,https://doi.org/10.1007/10_2020_160和c.you,adv.biochem.engl,doi:10.1007/10_2012_159(2012))。

14、因此，本领域寻求经济高效的方法来生产聚糖，包括hmo，并包括大于5个糖单位的聚糖。这可在推进这些聚糖和hmo用于益生菌、预防和治疗目的(包括婴儿营养和疾病预防)中克服主要障碍。重要的是，本发明允许提高复杂碳水化合物的生产效率，同时降低成本，从而提高这些分子的可及性和可负担性。

技术实现思路

1、本发明提供了利用固定化生物纳米催化剂的聚糖的模块化无细胞从头合成。本发明显著提高了生产聚糖的效率并降低了生产聚糖的成本，所述聚糖包括但不限于寡糖，包括但不限于5dp或更大的大而复杂的hmo，以及大而复杂的hmo(>5dp)。

2、本发明提供了使用一种或多种固定在生物纳米催化剂(bnc)内的酶来生产聚糖寡糖的材料，特别是磁性材料，所述聚糖寡糖包括但不限于五个糖单元或更多个糖单元，所述生物纳米催化剂又包埋在支架内。根据本发明的生物纳米催化剂(bnc)包含与磁性纳米颗粒(mnp)自组装的酶。bnc与支架自组装。

3、在某些实施方案中，支架化的bnc位于用于流动制造的模块化流动池内部。在某些实施方案中，本发明提供了连续的流程处理，其中合成的每个步骤在模块中进行。在生产模式中，这些模块包含完全的酶系统-糖活化和糖转移-专门用于构建聚糖。在一些实施方案中，聚糖是寡糖。

4、在一些实施方案中，支架包括磁性金属氧化物。在一些实施方案中，支架是包含形成粉末的磁性颗粒的热塑性塑料的高磁性和高孔隙率复合掺混物。它们可以是容纳bnc的单层或多层材料。这种设计的物体可通过烧结复合磁性粉末，使用3d打印来生产。在一些实施方案中，使用选择性激光烧结(sls)。可将模块化流动池混合和匹配用于高度可定制和高效的制造过程。在优选实施方案中，生产人乳寡糖(hmo)。

5、因此，本发明提供了利用以连续模块组织的组合生物纳米催化剂(bnc)的确定多糖的无细胞生产。