激活人IL-10Ra受体的免疫细胞因子及其用途的制作方法

发明领域本发明涉及生物技术和医学领域，特别涉及一种激活人il-10rα受体的免疫细胞因子。本发明进一步涉及编码所述免疫细胞因子的核酸、表达载体、宿主细胞及用于产生其的方法、用于产生免疫细胞因子的方法、包含以上免疫细胞因子的药物组合物、包含以上免疫细胞因子和其他治疗活性化合物的药物组合物、用于治疗肿瘤性疾病的方法以及免疫细胞因子或其药物组合物用于治疗肿瘤性疾病的用途。发明背景白细胞介素10(或il-10)为一种细胞因子，并且直到最近还被视为抗炎性细胞因子。其为一种分子量为约37-39kda的同二聚体。人和白细胞介素10与鼠白细胞介素10具有为约80％的高同源性。il-10能够消除血管生成、转移，并具有直接的抗肿瘤作用(martin oft,il-10:master switch from tumor-promoting inflammation to antitumor immunity,cancerimmunology at the crossroads:experimental immunotherapies,2014年3月,第2卷,第3期,10.1158/2326-6066.cir-13-0214)。已经表明，il-10可能的抗肿瘤作用之一为其对表达pd-1的cd8淋巴细胞的激活作用。il-10导致有效的抗凋亡细胞内级联，这一事实有助于细胞毒性淋巴细胞在肿瘤微环境中的存活(martin oft,immune regulation and cytotoxic t cell activation of il-10agonists-preclinical and clinical experience,seminars in immunology,第44卷,2019年8月,doi:10.1016/j.smim.2019.101325)。il-10的特征为由于其尺寸小(为约37-39kda)导致的血浆半衰期短，这导致快速的肾清除率；事实上，其在系统隔室内的半衰期为2.5小时(braat h.等人,interleukin-10-based therapy for inflammatory bowel disease,expert opin.biol.ther.3(5),2003,第725-731页)。一些作者已经采用这种细胞因子的聚乙二醇化来增加在血流中的停留时间、暴露、效力和减少肾吸收(mattosа.等人,pegylation of interleukin-10improves the pharmacokinetic profile and enhances the antifibroticeffectivity in ccl4-induced fibrogenesis in mice,j.control release 162,2012,第84-91页和mumm j.в.等人,il-10elicits ifnγ-dependent tumor immunesurveillance,cancer cell 20(6),2011,第781-796页)。然而，聚乙二醇化的缺点可包括潜在风险，比如免疫原性、聚乙二醇化分子的生物活性降低和聚乙二醇化的异质性，这一事实可导致产生具有不同性质(尺寸、电荷等)的治疗分子，并在治疗分子周围形成亲水层。此外，这一方法可将制剂在血流中的半衰期延长至不超过24小时。另一种用于延长il-10在血浆中的半衰期的方法为使用包含抗体或其片段和il-10的融合蛋白用于将细胞因子定向转运到发炎组织并在其中累积细胞因子。现有技术提供文章(zheng,x.x.等人,anoncytolytic il-10/fc fusion proteinprevents diabetes,blocks autoimmunity,and promotes suppressor phenomena innod mice.j.immunol.1997,158,4507-4513和zheng,x.x.等人,administration ofnoncytolytic il-10/fc in murine models of lipopolysaccharide-induced septicshock and allogeneic islet transplantation.j.immunol.1995,154,5590-5600)，其描述了基于il-10和fc片段的免疫细胞因子。国际申请wo2012045334和wo2014023673进一步提供了包含基于il-10和fc片段的异二聚体复合物的融合蛋白。国际申请wo2015117930提供了包含igg类抗体和突变体il-10分子的融合蛋白，其中融合蛋白包含两个相同的重链多肽和两个相同的轻链多肽，并且其中突变体il-10分子包含一个氨基酸取代，与野生型il-10分子相比较，其降低突变体il-10分子与il-10受体的结合亲和力。以上基于il-10和fc片段的融合蛋白(免疫细胞因子)具有共同的缺点，特别是在血液中的稳定性不足，因为它们易于被血清蛋白酶降解。结合以上内容，需要开发基于il-10和fc片段的融合蛋白(免疫细胞因子)，与il-10相比较，其在血浆中将显示出延长的半衰期，并且由于对血清蛋白酶降解的抗性而将是稳定的。

背景技术：

技术实现思路

0、发明简述

1、如作者所发现的，本发明中提供的包含基于il-10和人igg1-fc片段的同二聚体复合物的免疫细胞因子与il-10的血浆半衰期相比较具有延长的血浆半衰期，并且由于归因于其独特的结构而对血清蛋白酶降解的抗性而是稳定的。

2、在一方面，本发明涉及一种激活人il-10rα受体的免疫细胞因子，其包含基于il-10和人igg1 fc片段的同二聚体复合物，其中基于il-10和人igg1 fc片段的单体包含seqid no:1的氨基酸序列。

3、在一方面，本发明涉及一种编码以上免疫细胞因子的分离的核酸。

4、在一些实施方案中，分离的核酸为dna。

5、在一些实施方案中，分离的核酸包括具有seq id no:3的核苷酸序列。

6、在一些实施方案中，分离的核酸包括具有seq id no:4的核苷酸序列。

7、在一方面，本发明涉及一种包含以上核酸中任一种的表达载体。

8、在一方面，本发明涉及一种用于产生以上本发明的免疫细胞因子的宿主细胞的生产方法，其包括用以上载体转化细胞。

9、在一方面，本发明涉及一种用于产生以上本发明的免疫细胞因子的宿主细胞，宿主细胞包含以上核酸中的任一种。

10、在一方面，本发明涉及一种用于制备包含以上本发明的免疫细胞因子的制剂的方法，其包括在足以产生所述免疫细胞因子的条件下于培养基中培养以上宿主细胞，在必要时，然后分离和纯化所得本发明的免疫细胞因子。

11、在一方面，本发明涉及一种用于激活人il-10rα受体的药物组合物，其包含以上本发明的免疫细胞因子和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

12、在一方面，本发明涉及一种用于激活人il-10rα受体的药物组合物，其包含以上本发明的免疫细胞因子和至少一种其他的治疗活性化合物。

13、在一些实施方案中，药物组合物用于治疗肿瘤性疾病。

14、在一些实施方案中，肿瘤性疾病选自：hnscc(头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食管癌、膀胱癌、tnbc(三阴性乳腺癌)、crc(结直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、nsclc(非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、微卫星不稳定性结直肠癌、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、t细胞和b细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、难治性非霍奇金b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胰腺癌、卵巢癌、高危骨髓增生异常综合征。

15、在药物组合物的一些实施方案中，使用的其他治疗活性化合物为抗体、化学治疗剂或激素治疗剂。

16、在药物组合物的一些实施方案中，使用的其他治疗活性化合物为免疫检查点抑制剂。

17、在药物组合物的一些实施方案中，使用的免疫检查点抑制剂选自pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂或ctla-4抑制剂。

18、在药物组合物的一些实施方案中，使用的pd-l1抑制剂为特异性地与pd-l1结合的抗体。

19、在药物组合物的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与pd-l1结合并且选自度伐鲁单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、玛奈利单抗(manelimab)。

20、在药物组合物的一些实施方案中，使用的pd-1抑制剂为特异性地与pd-1结合的抗体。

21、在药物组合物的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与pd-1结合并且选自帕洛利单抗(prolgolimab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)。

22、在药物组合物的一些实施方案中，使用的ctla-4抑制剂为特异性地与ctla-4结合的抗体。

23、在药物组合物的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与ctla-4结合并且为伊匹单抗(ipilimumab)。

24、在一方面，本发明涉及一种用于激活人il-10rα受体的药物组合，其包含以上本发明的免疫细胞因子和至少一种其他的治疗活性化合物。

25、在一些实施方案中，药物组合用于治疗肿瘤性疾病。

26、在一些实施方案中，肿瘤性疾病选自：hnscc(头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食管癌、膀胱癌、tnbc(三阴性乳腺癌)、crc(结直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、nsclc(非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、微卫星不稳定性结直肠癌、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、t细胞和b细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、难治性非霍奇金b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胰腺癌、卵巢癌、高危骨髓增生异常综合征。

27、在药物组合的一些实施方案中，使用的其他治疗活性化合物为抗体、化学治疗剂或激素治疗剂。

28、在药物组合的一些实施方案中，使用的其他治疗活性化合物为免疫检查点抑制剂。

29、在药物组合的一些实施方案中，使用的免疫检查点抑制剂选自pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂或ctla-4抑制剂。

30、在药物组合的一些实施方案中，使用的pd-l1抑制剂为特异性地与pd-l1结合的抗体。

31、在药物组合的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与pd-l1结合并且选自度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、阿特珠单抗、玛奈利单抗。

32、在药物组合的一些实施方案中，使用的pd-1抑制剂为特异性地与pd-1结合的抗体。

33、在药物组合的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与pd-1结合并且选自帕洛利单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗。

34、在药物组合的一些实施方案中，使用的ctla-4抑制剂为特异性地与ctla-4结合的抗体。

35、在药物组合的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与ctla-4结合并且为伊匹单抗。

36、在一方面，本发明涉及一种用于治疗肿瘤性疾病的方法，其包括以治疗有效量向需要这种治疗的受试者施用以上本发明的免疫细胞因子或任何以上药物组合物。

37、在用于治疗的方法的一些实施方案中，肿瘤性疾病选自：hnscc(头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食管癌、膀胱癌、tnbc(三阴性乳腺癌)、crc(结直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、nsclc(非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、微卫星不稳定性结直肠癌、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、t细胞和b细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、难治性非霍奇金b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胰腺癌、卵巢癌、高危骨髓增生异常综合征。

38、在一方面，本发明涉及一种用于在需要这种激活的受试者激活人il-10rα受体的方法，其包括以治疗有效量向需要这种治疗的受试者施用有效量的以上本发明的免疫细胞因子或任何以上药物组合物。

39、在一方面，本发明涉及以上本发明的免疫细胞因子或任何以上药物组合物用于在需要这种治疗的受试者中治疗肿瘤性疾病的用途。

40、在一方面，本发明涉及以上本发明的免疫细胞因子或至少一种其他治疗活性化合物用于在需要这种治疗的受试者中治疗肿瘤性疾病的用途。

41、在用途的一些实施方案中，肿瘤性疾病选自：hnscc(头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食管癌、膀胱癌、tnbc(三阴性乳腺癌)、crc(结直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、nsclc(非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、微卫星不稳定性结直肠癌、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、t细胞和b细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、难治性非霍奇金b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胰腺癌、卵巢癌、高危骨髓增生异常综合征。

42、在用途的一些实施方案中，使用的其他治疗活性化合物为抗体、化学治疗剂或激素治疗剂。

43、在用途的一些实施方案中，使用的其他治疗活性化合物为免疫检查点抑制剂。

44、在用途的一些实施方案中，使用的免疫检查点抑制剂选自pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂或ctla-4抑制剂。

45、在用途的一些实施方案中，使用的pd-l1抑制剂为特异性地与pd-l1结合的抗体。

46、在用途的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与pd-l1结合并且选自度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、阿特珠单抗、玛奈利单抗。

47、在用途的一些实施方案中，使用的pd-1抑制剂为特异性地与pd-1结合的抗体。

48、在用途的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与pd-1结合并且选自帕洛利单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗。

49、在用途的一些实施方案中，使用的ctla-4抑制剂为特异性地与ctla-4结合的抗体。

50、在用途的一些实施方案中，使用的抗体特异性地与ctla-4结合并且为伊匹单抗。

51、<110> jsc "biocad"

52、<120> 激活人il-10ra受体的免疫细胞因子及其用途

53、<150> ru2020140807

54、<151> 2020-12-10

55、<160> 6

56、<170> bissap 1.3.6

57、<210> 1

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60、<213> 人工序列

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183、gagcccaaat ctagtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgca      60

184、gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg     120

185、acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc     180

186、aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag     240

187、tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat     300

188、ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc     360

189、atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg     420

190、gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc     480

191、gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct     540

192、cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc     600

193、aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac     660

194、tacacgcaga aaagcctctc cctgtccccg ggtggagggt caggaggtgg tccaggatcg     720

195、ggtggctctc ctggacaggg aacccagtcc gagaactcct gcacccactt ccccggcaac     780

196、ctgcccaaca tgctgcggga cctgagagat gccttctcca gagtgaaaac attcttccag     840

197、atgaaggacc agctggacaa cctgctgctg aaagagtccc tgctggaaga tttcaagggc     900

198、tacctgggct gccaggccct gtccgagatg atccagttct acctggaaga agtgatgcct     960

199、caggccgaga accaggaccc cgacatcaag gcccacgtga actccctggg cgagaacctg    1020

200、aaaaccctgc ggctgcggct gagaagatgc caccggtttc tgccctgcga gaacaagtcc    1080

201、aaggccgtgg aacaagtgaa gaacgccttc aacaagctgc aggaaaaggg catctacaag    1140

202、gccatgagcg agttcgacat cttcatcaac tacatcgagg cctacatgac catgaagatc    1200

203、cggaac                                                               1206

204、<210> 4

205、<211> 1206

206、<212> dna

207、<213> 人工序列

208、<220>

209、<223> dna il-10-fc

210、<400> 4

211、gagcccaaat ctagtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgca      60

212、gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg     120

213、acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc     180

214、aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag     240

215、tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat     300

216、ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc     360

217、atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg     420

218、gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc     480

219、gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct     540

220、cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc     600

221、aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac     660

222、tacacgcaga aaagcctctc cctgtccccg ggtggagggt caggaggtgg tccaggatcg     720

223、ggtggctcgc ccggtcaagg aactcagtct gagaactcat gtacacactt tccagggaat     780

224、ctgcccaaca tgcttaggga tctccgggac gctttctcta gggtcaagac cttcttccag     840

225、atgaaagacc aactggacaa tctgctgtta aaggaaagtt tgctcgaaga ttttaagggc     900

226、tatctcgggt gccaggccct ttccgaaatg attcagtttt acctggagga agtaatgcct     960

227、caagctgaaa accaggaccc cgatatcaag gcgcatgtga attcattggg cgagaacctg    1020

228、aaaaccctcc gactcagact ccggcgttgc cacaggttcc tgccatgcga gaacaaatca    1080

229、aaggccgtcg agcaggtgaa gaacgcattc aataagctgc aggagaaagg aatctacaaa    1140

230、gctatgtcgg agttcgacat cttcatcaac tatatcgagg cttacatgac tatgaaaatc    1200

231、cgtaat                                                               1206

232、<210> 5

233、<211> 1263

234、<212> dna

235、<213> 人工序列

236、<220>

237、<223> dna 具有前导肽的il-10-fc

238、<400> 5

239、atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctgt tccatgccac ccaggccgag      60

240、cccaaatcta gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcaggg     120

241、ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc     180

242、cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac     240

243、tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac     300

244、aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc     360

245、aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc     420

246、tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag     480

247、gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac     540

248、atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc     600

249、gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg     660

250、tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac     720

251、acgcagaaaa gcctctccct gtccccgggt ggagggtcag gaggtggtcc aggatcgggt     780

252、ggctctcctg gacagggaac ccagtccgag aactcctgca cccacttccc cggcaacctg     840

253、cccaacatgc tgcgggacct gagagatgcc ttctccagag tgaaaacatt cttccagatg     900

254、aaggaccagc tggacaacct gctgctgaaa gagtccctgc tggaagattt caagggctac     960

255、ctgggctgcc aggccctgtc cgagatgatc cagttctacc tggaagaagt gatgcctcag    1020

256、gccgagaacc aggaccccga catcaaggcc cacgtgaact ccctgggcga gaacctgaaa    1080

257、accctgcggc tgcggctgag aagatgccac cggtttctgc cctgcgagaa caagtccaag    1140

258、gccgtggaac aagtgaagaa cgccttcaac aagctgcagg aaaagggcat ctacaaggcc    1200

259、atgagcgagt tcgacatctt catcaactac atcgaggcct acatgaccat gaagatccgg    1260

260、aac                                                                  1263

261、<210> 6

262、<211> 1263

263、<212> dna

264、<213> 人工序列

265、<220>

266、<223> dna 具有前导肽的il-10-fc

267、<400> 6

268、atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctgt tccatgccac ccaggccgag      60

269、cccaaatcta gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcaggg     120

270、ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc     180

271、cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac     240

272、tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac     300

273、aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc     360

274、aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc     420

275、tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag     480

276、gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac     540

277、atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc     600

278、gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg     660

279、tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac     720

280、acgcagaaaa gcctctccct gtccccgggt ggagggtcag gaggtggtcc aggatcgggt     780

281、ggctcgcccg gtcaaggaac tcagtctgag aactcatgta cacactttcc agggaatctg     840

282、cccaacatgc ttagggatct ccgggacgct ttctctaggg tcaagacctt cttccagatg     900

283、aaagaccaac tggacaatct gctgttaaag gaaagtttgc tcgaagattt taagggctat     960

284、ctcgggtgcc aggccctttc cgaaatgatt cagttttacc tggaggaagt aatgcctcaa    1020

285、gctgaaaacc aggaccccga tatcaaggcg catgtgaatt cattgggcga gaacctgaaa    1080

286、accctccgac tcagactccg gcgttgccac aggttcctgc catgcgagaa caaatcaaag    1140

287、gccgtcgagc aggtgaagaa cgcattcaat aagctgcagg agaaaggaat ctacaaagct    1200

288、atgtcggagt tcgacatctt catcaactat atcgaggctt acatgactat gaaaatccgt    1260

289、aat                                                                  1263