检测靶核酸序列的方法与流程

本公开和发明涉及核酸检测领域。特别地，本公开和发明涉及一种用于在生成第二代rca产物的2阶段rca反应(所谓的超级rca(srca)，在本文中也称为“safelock”)中使用挂锁探针和滚环扩增(rca)检测靶分子中靶核酸序列的方法，可以通过该方法检测靶核酸序列并与其他核酸序列区分开来。该方法依赖于间隙-填充-连接挂锁探针技术，并且可以用于检测样品中可能出现的变异序列。还提供了用于该方法的试剂盒。

背景技术：

1、靶核酸序列的检测应用于包括以下的许多不同领域：特别是在临床上用于个性化医疗，和疾病(诸如癌症、传染病和遗传性或基因病症)的诊断、预后和/或治疗，以及研究和生物安全性。

2、使用标记的杂交探针可以容易地检测靶核酸序列，但是简单杂交探针具有相对高的检测下限，并且不能容易地用于区分相似的核酸序列。为了增加灵敏度，通常可以扩增含有靶序列的靶核酸分子以增加可用于检测的靶序列的量。本领域已知的多种技术中的任一种均可以用于扩增，包括rca。

3、rca利用链置换聚合酶，并且需要环状扩增模板。环状模板的扩增提供了串联的rca产物，其包含与扩增模板的序列互补的序列的多个拷贝。此类串联体通常形成可以容易地被观察和检测的球或“团状物”，并且因此基于rca的测定已被用于检测核酸，并且实际上更普遍地用作检测任何靶分析物的报告系统。本身可以被直接环化的两种靶核酸或探针或更普遍的报告核酸可以为rca提供模板核酸环。

4、核酸检测方法的特异性可以通过使用需要双重识别或靶核酸序列的两个结合位点的探针(诸如挂锁探针)来改善。挂锁探针是线性寡核苷酸，具有由中间的“骨架”区域连接的两个单独的靶互补结合区。当探针已与其靶核酸序列结合(杂交)时，探针的末端可以连接在一起以使探针环化。然后可以将环化的挂锁探针用作rca反应的模板，并且可以检测rca产物。这构成了当今使用的许多检测测定的基础。因此，挂锁探针提供了额外的特异性层，因为只有在连接位点正确碱基配对的探针才会被连接以生成将被检测的分子的模板。当挂锁探针以其靶结合位点彼此直接相邻的方式与靶核酸序列杂交时，挂锁探针的末端可以直接彼此连接。可替代地，挂锁探针的靶结合位点可以与靶核酸杂交，其间存在间隙，并且可以通过间隙区域中一个或多个间隙寡核苷酸的杂交，或通过探针的杂交3'末端的聚合酶催化延伸来填充间隙。以这种方式，挂锁探针的杂交末端可以间接彼此连接，因为它们各自与中间的“间隙序列”杂交。此类“间隙填充”挂锁探针，也称为分子倒置探针，描述于hiatt等人，2013,genome res,23,843-854中，其中分子倒置探针用于靶向高精度检测低频率变异。

5、已经描述了基于rca的测定，其依赖于初始rca产物的二次扩增以增加检测到的产物的量，从而提供测定中信号的扩增。这些包括例如超支化rca。最近已经开发了所谓的“超级rca(srca)”反应，其包含2轮或更多轮rca扩增，其中第二rca反应的产物与第一反应的产物连接。此类srca方法描述于wo2014/0796209中。在该方法中，使能够提供引物或充当引物的探针与初始rca产物杂交，并用于引发与“引物-探针”杂交的第二rca模板环的扩增。第二rca模板可以通过与“引物-探针”杂交的挂锁探针的环化生成。在wo 2015/071445中描述了可替代的srca方法，称为“挂锁srca”，其中挂锁探针用于直接与初始rca产物结合。

6、在许多应用中，待检测的核酸序列以低水平出现，例如在血浆或其他临床样品中存在罕见突变或无细胞dna(cfdna)的情况下，或者在可得样品量有限的情况下。在此类情况下，需要非常灵敏的检测方法，并且特别是允许实现靶核酸的高度扩增的方法。虽然上述srca方法在某种程度上朝着提供改善的和灵敏的测定的方向发展，但仍然需要高度灵敏的核酸检测方法。本公开和发明旨在提供此类方法。

技术实现思路

1、在本方法中，靶特异性第一挂锁探针用于通过间隙-填充延伸反应生成靶序列的互补拷贝。然后通过rca扩增含有互补拷贝的环化第一挂锁探针以生成含有靶序列的多个拷贝的第一rca产物。然后用对靶序列具有特异性的进一步的第二挂锁探针探测所得的第一rca产物。使环化的第二挂锁探针进行进一步的第二rca反应，该反应用于生成第二rca产物，检测该产物以检测靶序列。如上所述，使用与第一rca产物结合的第二挂锁探针的2阶段rca反应在本文中称为“safelock”测定，并且因此第二挂锁也可以称为“safelock挂锁”。

2、因此，本方法依赖于至少两轮rca扩增来生成待检测的产物。这本身就增加了可检测产物的数量。然而，通过另外设计该方法使第二挂锁探针靶向第一rca产物中的序列，该序列是环化的第一挂锁探针中“间隙-填充”序列的互补序列(即由间隙-填充延伸反应创建以填充第一挂锁探针的杂交末端之间的间隙的序列)，改善了该方法的特异性。第二挂锁探针专门设计用于识别靶序列，该靶序列的多个拷贝已在第一rca产物中创建。此外，已经进行了改进，增加了可以为第一rca反应生成的rca模板的量。该改进增加了间隙-填充延伸反应的效率，并且允许生成更多正确连接的环化第一挂锁探针。在一个实施例中，该改进允许探针结合、间隙-填充和连接反应在一个步骤中组合，即所谓的“间隙-填充-连接”步骤，其中一起添加挂锁探针和用于间隙-填充延伸和连接反应的试剂。这允许间隙-填充-连接反应循环，从而增加产生的环化第一挂锁探针的量，并因此增加检测方法的效率和灵敏度。在另一个实施例中，探针-结合步骤与间隙-填充延伸和连接步骤分开。本方法还提供了一种筛选dna样品中是否存在极大量不同的靶序列的有效手段。

3、因此，在第一和广泛的方面，本文提供了一种用于检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：

4、(i)使靶核酸分子与第一挂锁探针接触，该第一挂锁探针包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，该靶结合区能够与靶核酸分子中位于靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许探针的靶结合区与靶核酸分子杂交；和

5、(ii)任选地在5'和/或3'末端裂解任何未杂交的核苷酸后，使用聚合酶延伸挂锁探针的杂交的3'末端以创建靶核酸序列的互补拷贝，并使延伸的3'末端与杂交的5'末端连接以环化挂锁探针；

6、(iii)使用环化的挂锁探针作为第一rca模板进行第一rca反应以生成第一rca产物(rcp)，该第一rca产物包含靶核酸序列的拷贝的多个重复序列；

7、(iv)使第一rcp与包含对靶核酸序列具有特异性的靶结合区的第二挂锁探针接触并允许探针与多个重复序列中的靶序列杂交；

8、(v)连接杂交的第二挂锁探针以环化杂交的挂锁探针；

9、(vi)使用环化的第二挂锁探针作为第二rca模板进行第二rca反应以生成含有第二挂锁探针的多个重复序列互补拷贝的第二rcp；

10、(vii)检测第二rcp以检测第二挂锁探针，从而检测靶核酸序列。

11、特别地，在步骤(ii)和(v)中使用连接酶来连接和环化挂锁探针。

12、在一个更特别的实施例中，提供了一种用于检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：

13、(i)使靶核酸分子与第一挂锁探针接触，该挂锁探针包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，该靶结合区能够与靶核酸分子中位于靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许探针的靶结合区与靶核酸分子杂交，其中挂锁探针的3'靶结合区比5'靶结合区短至少6个碱基，并且使挂锁探针与dntp、聚合酶和连接酶一起与靶核酸分子接触，并且其中dntp以不超过10μm的浓度提供并且聚合酶以不超过0.025u/ul的浓度提供；

14、(ii)任选地在5'和/或3'末端裂解任何未杂交的核苷酸后，使用聚合酶延伸挂锁探针的杂交的3'末端以创建靶核酸序列的互补拷贝，并使用连接酶使延伸的3'末端与杂交的5'末端连接以环化挂锁探针；

15、(iii)使用环化的挂锁探针作为第一rca模板进行第一rca反应以生成第一rca产物(rcp)，该第一rca产物包含靶核酸序列的拷贝的多个重复序列；

16、(iv)使第一rcp与包含对靶核酸序列具有特异性的靶结合区的第二挂锁探针接触并允许探针与多个重复序列中的靶序列杂交；

17、(v)连接杂交的第二挂锁探针以环化杂交的挂锁探针；

18、(vi)使用环化的第二挂锁探针作为第二rca模板进行第二rca反应以生成含有第二挂锁探针的多个重复序列互补拷贝的第二rcp；

19、(vii)检测第二rcp以检测第二挂锁探针，从而检测靶核酸序列。

20、在进一步的更特别的实施例中，提供了一种用于检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：

21、(i)(a)使靶核酸分子与第一挂锁探针接触，该第一挂锁探针包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，该靶结合区能够与靶核酸分子中位于靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许探针的靶结合区与靶核酸分子杂交；和

22、(b)在探针已与靶核酸分子杂交后，使杂交的挂锁探针/靶核酸反应混合物与聚合酶接触；

23、(ii)任选地在5'和/或3'末端裂解任何未杂交的核苷酸后，使用聚合酶延伸挂锁探针的杂交的3'末端以创建靶核酸序列的互补拷贝，并使延伸的3'末端与杂交的5'末端连接以环化挂锁探针；

24、(iii)使用环化的挂锁探针作为第一rca模板进行第一rca反应以生成第一rca产物(rcp)，该第一rca产物包含靶核酸序列的拷贝的多个重复序列；

25、(iv)使第一rcp与包含对靶核酸序列具有特异性的靶结合区的第二挂锁探针接触，并允许探针与多个重复序列中的靶序列杂交；

26、(v)连接杂交的第二挂锁探针以环化杂交的挂锁探针；

27、(vi)使用环化的第二挂锁探针作为第二rca模板进行第二rca反应以生成含有第二挂锁探针的多个重复序列互补拷贝的第二rcp；

28、(vii)检测第二rcp以检测第二挂锁探针，从而检测靶核酸序列。

29、在该方法中，通过在第一挂锁探针已杂交后才提供聚合酶，探针-结合步骤与间隙-填充延伸步骤分开，因此，该方法提供了用于探针结合和间隙填充延伸的2步方案。在此类方法中，用于延伸反应的dntp可以在聚合酶之前、与聚合酶一起或在聚合酶之后提供。用于连接反应的连接酶可以在聚合酶之前、与聚合酶一起或在聚合酶之后提供。在探针结合后，例如在添加聚合酶之前或在延伸反应发生之前，可以存在洗涤。特别地，步骤i(b)发生在5'靶结合区与靶核酸序列杂交之后。

30、上述方法可以特别用于检测样品中靶核酸分子中的变异靶核酸序列。靶核酸序列通常可以以变体形式出现，例如等位基因变体，或突变体和野生型序列，并且可以希望检测存在哪种变体。因此，在一个实施例中，靶核酸分子是样品中的分析物。然而，在另一个实施例中，靶核酸分子本身不是靶分析物，而是作为检测另一靶分析物的测定的一部分被检测到。因此，在此类实施例中，靶核酸分子可以是靶分析物的报告分子。

31、在一个实施例中，上述方法的步骤(iv)至(vii)可以包括：

32、(iv)使第一rcp与两个或更多个第二挂锁探针接触，该第二挂锁探针各自包含对靶核酸序列的不同变体具有特异性的靶结合区，并允许探针与多个重复序列中的其相应的变异靶序列(在存在时的)杂交；

33、(v)使已杂交的第二挂锁探针连接以环化杂交的挂锁探针；

34、(vi)使用环化的挂锁探针作为第二rca模板进行第二rca反应以生成含有第二挂锁探针的多个重复序列互补拷贝的第二rcp；

35、(vii)检测第二rcp以鉴定第二挂锁探针，从而鉴定变异靶核酸序列。

36、该方法可以用于检测dna或rna，并且可以以同质或异质形式进行。其可用于检测原位或呈分离形式或液体样品中的靶核酸序列。

37、有利地，该方法可以以多重方式进行以检测多个不同的靶核酸序列。

38、在一个实施例中，使间隙-填充延伸和连接步骤循环以增加生成的环化第一挂锁探针的量。

39、该方法可以涉及更多的循环或更多代的rca。因此，可以重复步骤(iv)至(vi)，使用包含对第二rcp中的靶核酸序列具有特异性的靶结合区的第三挂锁探针，连接以环化第三挂锁探针，进行第三rca反应等等以生成第3代、第4代或甚至更多代的rcp。

40、在第二方面，提供了一种用于检测靶核酸分子中的靶核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含：

41、(i)第一挂锁探针，其包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，该靶结合区能够与靶核酸分子中位于靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许探针的靶结合区与靶核酸分子杂交；

42、(ii)第二挂锁探针，其包含对靶核酸序列具有特异性的靶结合区。

43、在一个实施例中，挂锁探针的3'靶结合区比5'靶结合区短至少6个碱基。

44、在一个实施例中，该试剂盒用于检测样品中靶核酸分子中的变异靶核酸序列，并且可以在部分(ii)中包含两个或更多个第二挂锁探针，该第二挂锁探针各自包含对靶核酸序列的不同变体具有特异性的靶结合区。在一个实施例中，第二挂锁探针各自包含检测序列，它们可以通过检测序列彼此区分(即检测序列不同于另一第二挂锁探针的检测序列)。

45、该试剂盒可包含一种或多种选自以下的进一步的组分：

46、(i)dntp，特别是在dntp在用于延伸步骤的反应介质中以不超过10μm的浓度提供使用时；

47、(ii)聚合酶，特别地，其中聚合酶在用于延伸步骤的反应介质中以不超过0.025u/ul的浓度提供使用；和

48、(iii)连接酶。