生物反应器及其使用方法与流程

本文公开了用于生长活的细胞或微生物的包括穿孔屏障的生物反应器或细胞培养腔室。本文描述了用于在该生物反应器中生长细胞或微生物的方法，其中流量和流分散的调节可用于不同密度的细胞或微生物生长。

背景技术：

1、生物反应器或细胞培养腔室用于在被容纳的和受控的环境中培养微生物和分离的活细胞，包括哺乳动物和人类细胞。在许多情形中，微生物和细胞的培养需要将微生物或细胞与周围环境物理分开和隔离并维持在无菌环境中。这些情形可包括开发和制造治疗性微生物或细胞，诸如疫苗和经遗传修饰的细胞，以及制造供治疗使用的工具诸如供基因治疗使用的病毒，蛋白质，抗体或治疗细胞。另外，可能需要将微生物或细胞与环境隔离，例如，在生物体有危害的情形中。

2、这些微生物和细胞的培养和处理需要若干典型步骤，这些步骤可能包括但不限于用少量生物体或细胞接种生物反应器、不断地向微生物或细胞提供营养物、培养基、补充剂、支架、激活剂、测量微生物或细胞数量、维持活力、维持微生物或细胞的特性、维持物理状态以及细胞收集。在微生物和细胞在生物反应器中生长和扩增期间，监测诸如培养基和葡萄糖消耗、培养基中的氧、h+离子、电导率等之类的参数也很重要。另外，长期培养通常包括将微生物或细胞在它们增殖时转移到更大的容器。一旦微生物或细胞的数量达到所需的数量或活性，通常对该微生物或细胞进行处理和配制。这种处理可包括洗涤生长培养基、浓缩细胞或微生物、将培养基更换为最终保存培养基，或者包装和冷冻微生物或细胞以供进一步使用。

3、生物反应器可用于生长、增殖、分化和维持活的细胞和/或微生物以用于不同目的。在这种生物反应器中生长的细胞通常由生长培养基灌注，生长培养基为细胞提供营养和氧并移除细胞排泄的废物和二氧化碳。通常，可以在这种生物反应器中培养细胞或微生物之前和/或期间进行各种步骤，包括例如选择细胞、培养细胞、修饰细胞、激活细胞、扩增细胞(通过细胞增殖)、洗涤细胞、浓缩细胞和最终配制细胞(或微生物)。

4、迄今为止，通常通过在不同容器之间转移带有微生物或细胞的培养基来进行繁殖，并且为此目的使用各种工具，诸如较大的生长容器、离心管或袋、中间储存容器和最终包装。上述过程通常可能包括打开操作，其中微生物或细胞从一个步骤转移到另一个步骤。

5、上述步骤中的若干步骤可能需要从生物反应器中移出细胞并进一步使它们经受诸如离心、温育、计数、测试、分离、配制和包装等之类的步骤。不幸的是，涉及将细胞或微生物从生物反应器中取出的任何步骤都大大增加了不需要的微生物(诸如，例如，真菌、细菌、支原体或其他不希望有的微生物)污染细胞的风险，这些不需要的微生物可能会对细胞培养过程造成不利影响。

6、人们已经认识到对于改进的封闭系统生物反应器存在长期的需要。已经认识到，这种改进可以针对减少或消除通过将细胞或微生物从生物反应器中取出来处理细胞或微生物的需要以及减少或消除培养过程中的步骤及人与细胞的相互作用。此外，人们已经认识到，改进可以针对通过在一个自动化的和封闭的系统中对细胞从早期阶段到最终产品进行处理来端到端地对工艺进行自动化和优化。本文所述的生物反应器及其使用方法的至少一些实施方案是针对这些改进的并且可以提供有利的生长条件，从而有可能实现更高的产率和更低的培养基需求。

技术实现思路

1、生物反应器是被构造成支持生物活性环境的设备或系统。生物反应器的一些实施方案包括封闭容器。生物反应器的一些实施方案包括一个或多个反应腔室。反应腔室被构造用于其中的化学过程，涉及一种或多种生物体和/或衍生自一种或更多种生物体的一种或多种生物化学活性物质。

2、在一些方面，本文所公开的是用于生物反应器的反应腔室的屏障或者生物反应器反应腔室或培养皿的表面的实施方案，其包括多个孔；以及至少一个培养基流动路径，其连接至所述多个孔中的至少一些孔，并且所述至少一个培养基流动路径的直径小于所述多个孔的平均直径。

3、在该屏障的一个相关的方面，所述多个孔的平均直径为至少0.2微米。

4、在该屏障的一些方面，所述多个孔的直径包括0.2微米至1.0微米的范围。

5、在该屏障的一个方面，所述多个孔的直径包括0.2微米至0.9微米的范围。

6、在该屏障的一个方面，所述多个孔的直径包括0.2微米至0.8微米的范围。

7、在该屏障的一个方面，所述多个孔的直径包括0.2微米至0.7微米的范围。

8、在该屏障的一个方面，所述多个孔的直径包括0.2微米至0.6微米的范围。

9、在该屏障的一个方面，所述多个孔的直径包括0.2微米至0.5微米的范围。

10、在该屏障的一个方面，所述多个孔的直径包括0.2微米至0.4微米的范围。

11、在该屏障的一个方面，所述多个孔的直径包括0.2微米至0.3微米的范围。

12、在该屏障的一个方面，所述多个孔以足够的量存在，从而导致比不包括足够量的所述多个孔的其它方面等价的生物反应器的扩增倍数高20％或以上。

13、在该屏障的一个方面，所述多个孔以足够的量存在，从而导致比不包括足够量的所述多个孔的其它方面等价的生物反应器的扩增倍数高50％或以上。

14、在该屏障的一个相关的方面，所述至少一个培养基流动路径由不锈钢形成。

15、在该屏障的一个相关的方面，屏障包括聚合物膜，例如但不限于聚醚砜(pes)。

16、在该屏障的一个相关的方面，该聚合物膜包括包含陶瓷的表面。

17、在该屏障的一个方面，蛋白质吸收等于或小于50微克/平方厘米(μg/cm2)。

18、在该屏障的一个方面，蛋白质吸附等于或小于50微克/平方厘米(μg/cm2)。

19、在该屏障的一个方面，蛋白质吸收等于或小于约50微克/平方厘米(μg/cm2)。

20、在该屏障的一个方面，蛋白质吸附等于或小于约50微克/平方厘米(μg/cm2)。

21、在一些方面，本文所公开的是用于生物反应器的反应腔室的屏障的实施方案，

22、该屏障包括构造成具有弯曲形状的表面。

23、在包括构造成具有弯曲形状的表面的屏障的一个相关的方面，该弯曲形状具有等于或大于625毫米(mm)的曲率半径。

24、在包括构造成具有弯曲形状的表面的屏障的一个相关的方面，该弯曲形状具有大于约625mm的曲率半径。

25、在包括构造成具有弯曲形状的表面的屏障的一个相关的方面，该弯曲形状包括凸面形状，该凸面形状具有等于或小于50mm的距离(d)，该距离(d)被定义为从凸面形状的最低的部分到凸面形状边缘所限定假想直线的距离。

26、在一个相关的方面，该屏障包括构造成具有弯曲形状的表面，该表面包括不锈钢。

27、在一些方面，本文所公开的是生物反应器的反应腔室的实施方案，包括本文公开的屏障的任何一个或多个方面。

28、在一个相关的方面，该反应腔室包括下腔室；和上腔室，其中该屏障设置在下腔室与上腔室之间。

29、在一些方面，本文所公开的是生物反应器的实施方案，包括本文公开的生物反应器的方面中的任何一者或多者。

30、在一些方面，本文所公开的是生物反应器的实施方案，包括本文公开的屏障的方面中的任何一者或多者。

31、本文公开的屏障。

32、在一些方面，本文所公开的是使用本文公开的生物反应器的方面中的一者或多者的方法的实施方案。

33、在一个方面，本文所公开的是用于在其中生长细胞或微生物的生物反应器，该生物反应器包括：

34、-封闭容器，该封闭容器围封其中的空间；

35、-其中具有多个孔的第一屏障，该第一屏障密封地设置在所述空间内，被构造成将所述空间分为第一下腔室和第二上腔室，该第二上腔室被构造成在其中容纳生长的细胞或微生物；

36、其中该第一屏障经构造：

37、-以允许第一腔室与第二腔室之间流体流，以及第二腔室与第一腔室之间流体流，同时防止细胞或微生物在其间通过；

38、-以维持向下的凸面弧，该凸面弧具有：

39、-大于625毫米(mm)的曲率半径，或者作为另一种选择，

40、-向下凸面处的最低点与连接向下凸面边缘的直线之间的距离(d)小于50mm；以及

41、-以维持低于50微克/平方厘米(μg/cm2)的低蛋白质吸收和/或吸附。

42、在一个相关的方面，第一屏障被构造成在以下工作条件中的至少一个条件下维持其向下的凸面和低蛋白质吸收/吸附：

43、-0.01至500巴之间的压力梯度；

44、-密度高于1克/毫升(g/ml)的流体流；

45、-在约4℃至约45℃的温度范围下；以及

46、-它们的任何组合。

47、在一些相关的方面，孔的直径选择在0.1微米至40微米(μm)之间，构造成允许两个腔室之间的流体流以及防止容器中生长的细胞或微生物在腔室之间通过。

48、在一些相关的方面，根据上述中的任一项的生物反应器还包括：

49、-一个或多个流体入口端口，用于将流体引入第一腔室；和/或

50、-一个或多个流体出口端口，用于允许流体从第二腔室离开；并且其中流体流包括上行流。

51、在一些相关的方面，根据上述中的任一项的生物反应器还包括其中具有多个孔的校准屏障；该校准屏障密封地设置在处于第一屏障下方的第一腔室的空间内；该校准屏障被构造成：

52、-校准该流体流并防止气泡或颗粒通过；以及

53、-维持低于50微克/平方厘米(μg/cm2)的低蛋白质吸收和/或吸附。

54、在一些相关的方面，校准屏障被构造成控制流体流的速度。

55、在一些相关的方面，校准屏障的孔包括圆锥形状。

56、在一些相关的方面，根据上述中的任一项的生物反应器还包括其中具有多个孔的另外的筛选屏障；该筛选屏障设置在第二腔室的空间内，处于第二腔室的顶部区段，使得生长的细胞或微生物容纳在第一屏障与筛选屏障之间；该筛选屏障被构造为：

57、-防止细胞通过；以及

58、-维持低于50微克/平方厘米(μg/cm2)的低蛋白质吸收和/或吸附。

59、在一些相关的方面，生物反应器容器由至少两个部分构成。

60、在一些相关的方面，生物反应器的容器被构造成在设置在第二腔室内的流体中提供上行流体速度梯度，使得流体的速度在从第一屏障朝向流体的顶部表面的方向上减小。

61、在一些相关的方面，至少第二腔室包括从第二腔室的底部向顶部增加的横截面积。

62、在一些相关的方面，该横截面的形状选自：圆形、椭圆形、多边形以及它们的任何组合。

63、在一些相关的方面，容器的形状选自：圆锥形、截头圆锥形、渐缩形、圆柱形、多边形棱柱形、具有椭圆形横截面的渐缩形、具有多边形横截面的渐缩形、具有圆柱形部分和渐缩部分的形状以及具有圆锥形或渐缩部分和半球形部分的形状，以及它们的任何组合。

64、在一些相关的方面，所述一个或多个流体出口端口中的至少一者被构造成流体连接至泵，该泵被构造成从第二腔室接收流体，并且任选其中该泵还被构造成经由该流体入口端口中的至少一者使流体再循环回到第一腔室中。

65、在一些相关的方面，流体通过第二腔室的流速由该泵的泵送速率控制。

66、在一些相关的方面，流体包含以下任何一者：生长培养基、洗涤溶液、营养溶液、收集溶液、收获溶液、储存溶液以及它们的任何组合。

67、在一些相关的方面，所述一个或多个流体出口端口包括沿第二腔室的高度在不同位置开口的多个流体出口端口。

68、在一些相关的方面，第一屏障是固定的不可移动屏障。

69、在一些相关的方面，生物反应器还包括设置在第一屏障的上表面附近的至少一个收获端口，其被构造成从生物反应器收获细胞。

70、在一些相关的方面，该生物反应器被构造成倒置的。

71、在一些相关的方面，生物反应器还包括用于支持细胞或微生物的设置在第二腔室内的支持基质。

72、在一些相关的方面，生物反应器还包括控制器，其可操作地耦合并构造成控制以下中的至少一者：

73、-至少一个传感器单元，其包括构造用于感测容器内的流体的一种或多种化学和/或物理性质的一个或多个传感器；

74、-多个可控制地打开和关闭的阀，其被构造成控制流体在所述一个或多个流体出口端口和流体入口端口内的流动；

75、-可控制地打开和关闭的阀，其被构造成控制新鲜液体流体从流体贮存器流入泵的入口端口；

76、-加热器单元，其被构造成加热容器内的流体；

77、-冷却单元，其被构造成冷却容器内的流体；以及

78、-气阀，其被构造成控制包含来自氧源的氧的气体流入设置在容器内的气体分散头。

79、在一些相关的方面，反应腔室包括底部表面材料，该底部表面材料被构造成支撑设置在其上的细胞；腔室壁，该腔室壁连接至所述底部表面材料；以及培养基流管，该培养基流管布置在所述底部表面材料上方，其被构造成使培养基流动至细胞。

80、在反应腔室的一些相关的方面，该培养基流管布置在该底部表面材料的外周边部分处并且在腔室壁内部。

81、在反应腔室的一些相关的方面，该培养基流管是环形的。

82、在反应腔室的一些相关的方面，培养基流管和底部表面材料经构造而使得当操作时，培养基在细胞上方流动并且沿着底部表面材料的径向方向朝向底部表面材料的中心流动。

83、在反应腔室的一些相关的方面，培养基流管设置在底部表面材料的中心附近。

84、在反应腔室的一些相关的方面，培养基流管和底部表面材料经构造而使得当操作时，培养基在细胞上方流动并且沿着底部表面材料的径向方向朝向腔室壁流动。

85、在反应腔室的一些相关的方面，底部表面材料不具有从底部表面材料的顶侧穿透至底侧的任何孔。