四价FZD和WNT共受体结合抗体分子及其用途的制作方法

背景技术：

1、wnt信号通路对于胚胎发育和成体组织稳态至关重要。当细胞表面膜上的卷曲蛋白受体(fzd)与wnt配体结合时，wnt信号传导被启动。wnt配体是调节各种细胞过程(例如增殖、分化、存活和迁移)的分泌的生长因子。

2、人体中存在的19种wnt配体与由10种卷曲蛋白细胞表面受体(fzd)和几种共受体之一组成的网络相互作用，所述几种共受体引导不同胞内信号传导分支的选择性参与(wodarz,a.和nusse,r.annu.rev.cell dev.biol.14,59-88(1998)；angers,s和moon,r.t.,transduction.nat.rev.mol.cell biol.10,468-477(2009))。fzd具有保守的结构特征(包括七个疏水性跨膜结构域和富含半胱氨酸的配体结合结构域)。已知fzd在三个不同的信号通路(称为wnt平面细胞极性(pcp)通路、经典wnt/β-连环蛋白通路和wnt/钙通路)中发挥作用。wnt共受体也是指导上述胞内信号级联的差异性参与所必需的。例如，wnt配体与卷曲蛋白受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(lrp5/6)共受体家族的成员结合以激活wnt/β-连环蛋白通路，或与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1和2(ror1/2)(与受体酪氨酸激酶(ryk)或蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)共受体相关)结合以激活替代性的不依赖β-连环蛋白的信号通路。

3、wnt配体对于控制组织干细胞的自我更新和调节许多祖细胞群具有普遍重要的作用，但wnt蛋白的疏水性和敏感的三级结构使它们的生化纯化具有挑战性，并且使它们在体外和体内的使用效率低下。本文描述了激活wnt信号通路的四价结合抗体分子和它们的应用方法。

技术实现思路

1、本文描述了激活wnt信号通路的四价结合抗体分子和它们的应用方法。四价结合抗体分子与fzd受体(例如卷曲蛋白类受体1(fzd1)、卷曲蛋白类受体2(fzd2)、卷曲蛋白类受体3(fzd3)、卷曲蛋白类受体4(fzd4)、卷曲蛋白类受体5(fzd5)、卷曲蛋白类受体6(fzd6)、卷曲蛋白类受体7(fzd7)、卷曲蛋白类受体8(fzd8)、卷曲蛋白类受体9(fzd9)或卷曲蛋白类受体10(fzd10))和wnt共受体(例如lrp5或lrp6(lrp5/6))结合，从而激活wnt信号通路。在一个实施方式中，四价结合抗体分子与fzd4受体和lrp5和/或lrp6结合并激活wnt/β-连环蛋白信号通路。本发明的四价结合抗体分子在本文中也被称为“fzd激动剂”、卷曲蛋白(frizzled)和lrp5/6激动剂(agonist)(flag)，在一些实施方式中被称为“ant”。

2、四价结合抗体分子包含：由ch2和ch3结构域组成的fc结构域或fc结构域的包含ch3结构域的片段、与一种以上fzd受体(例如fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9和fzd10中的一种以上)相互作用的第一二价结合结构域，以及与wnt共受体(例如lrp5或lrp6)结合的第二二价结合结构域；其中，fzd结合结构域与fc结构域的一个末端连接，共受体结合结构域与fc结构域的另一末端连接。因此，fzd受体的结合结构域不与wnt共受体的结合结构域直接连接，而是它们被fc结构域或fc结构域的包含ch3结构域的片段隔开。

3、fzd激动剂的fc结构域可以为具有或不具有效应子功能的免疫球蛋白的fc结构域。免疫球蛋白可以为igg(例如igg1)。在本发明的一个实施方式中，四价结合抗体分子包含含有fc区的两个多肽，其通过每个多肽中fc区的内在二聚化能力或通过fc内的杵臼(knob-in-hole)构造二聚化。因此，fc二聚体可以是异二聚体或同二聚体。通过杵臼构造使肽二聚化的方法描述于wo2018/026942(发明人van dyk等)、“carter p.(2001)j.immunol.methods 248,7-15”、“ridgway等，(1996)protein eng.9,617-621”、“merchant等，(1998)nat.biotechnol.16,677-681”，以及“atwell等，(1997)j.mol.biol.270,26-35”，全部通过引用并入本文。

4、在一个实施方式中，本文所述的fzd激动剂的每个结合结构域是二价的，每个结合结构域可以是单特异性的(具有针对fzd受体(例如fzd4)或wnt共受体(例如lrp5/6)的相同表位的两个结合位点)，或者可以是双特异性的(具有两个结合位点，每个位点结合fzd或wnt共受体上的不同表位，例如，lrp5/6共受体内的wnt1结合位点(lrp5/6的胞外结构域内的结构域e1-e2)和wnt3结合位点(lrp5/6的胞外结构域内的结构域e3-e4))。在一个实施方式中，lrp5/6结合结构域结合lrp5上的wnt3a位点(结构域e3-e4)和lrp6上的wnt3a位点(结构域e3-e4)。

5、在本发明的实施方式中，与fzd激动剂的fc结构域连接的fzd结合结构域包含结合fzd(例如fzd4)的一个以上免疫球蛋白重链可变结构域(vh)片段和/或一个以上免疫球蛋白轻链可变结构域(vl)片段。在本发明的一个实施方式中，fzd结合结构域可以包含结合fzd上的相同或不同表位的fab、双抗体(diabody)或单链可变片段(scfv)、单域抗体片段(例如vhh)或它们的组合。

6、在本发明的一个实施方式中，fzd结合结构域的vh和/或vl结合fzd4或fzd5，并包含表1、表2或表6的fzd4或fzd5结合抗体的轻链cdr和重链cdr，和/或包含与表1、表2或表6的fzd4抗体的cdr具有50％、55％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性、并且仍然保留与fzd4或fzd5受体的结合性的轻链cdr和重链cdr。例如，在本发明的一个实施方式中，fzd结合结构域可以包含第一重链(cdr-h1)、第二重链(cdr-h2)和/或第三重链(cdr-h3)，以及第一轻链(cdr-l1)、第二轻链(cdr-l2)和/或第三轻链(cdr-l3)，其中，结合fzd的vh可以包含seq id no：24、seq id no：365或seq id no：893的cdr-h1，seq id no：51、seq id no：61、seq id no：462或seq id no：894的cdr-h2，和/或seq idno：79、seq id no：90、seq id no：484或seq id no：895的cdr-h3；结合fzd的vl可以包含seq id no：1、seq id no：3或seq id no：12的cdr-l1，seq id no：2、seq id no：3或seq idno：12的cdr-l2和/或seq id no：3、seq id no：12、seq id no：285或seq id no：896的cdr-l3。

7、在本发明的一个实施方式中，与fzd激动剂的fc结构域连接的共受体(lrp5/6)结合结构域包含结合wnt共受体(例如lrp5和/或lrp6)的一个以上免疫球蛋白重链可变结构域(vh)片段和/或一个以上免疫球蛋白轻链可变结构域(vl)片段。例如，在本发明的一个实施方式中，lrp结合结构域可以包含第一重链(cdr-h1)、第二重链(cdr-h2)和/或第三重链(cdr-h3)，以及第一轻链(cdr-l1)、第二轻链(cdr-l2)和/或第三轻链(cdr-l3)，其中，结合lrp的vh可以包含seq id no：527、seq id no：528、seq id no：536、seq id no：716或seqid no：720的cdr-h1，seq id no：552、seq id no：553或seq id no：566、seq id no：785或seq id no：791的cdr-h2，和/或seq id no：584、seq id no：585、seq id no：586或seq idno：603、seq id no：856或seq id no：862的cdr-h3；结合lrp的vl可以包含seq id no：1的cdr-l1，seq id no：2或seq id no：491的cdr-l2和/或seq id no：130、seq id no：492、seqid no：493、seq id no：510、seq id no：623或seq id no：665的cdr-l3。

8、在本发明的一个实施方式中，wnt共受体结合结构域是二价的并且可以包含双抗体，或者可以包含fab、单链可变片段(scfv)或单域抗体片段(vhh)或它们的组合，以用于结合共受体上的相同或不同的表位。在本发明的实施方式中，wnt共受体结合结构域的vh和vl包含表3、表4或表6的lrp5和/或lrp6结合抗体的轻链cdr和/或重链cdr，或者包含与表3、表4或表6的lrp5和/或lrp6抗体的cdr具有50％、55％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性、并且仍然保留与lrp5和/或lrp6共受体的结合性的轻链cdr和/或重链cdr。

9、在本发明的一个实施方式中，与本文所述的fzd激动剂的fc结构域连接的wnt共受体结合结构域包含由两个肽形成的双抗体，所述两个肽各自包含与轻链可变结构域(vl或vl结构域)连接的重链可变结构域(vh或vh结构域)，其中，来自一个肽的vh和vl与另一个肽的vl和vh配对形成双抗体。在此构造中，结合结构域有两个结合wnt共受体(例如lrp5或lrp6)的结合位点。双抗体可以是单特异性的(结合共受体上的相同位点)，或者可以是双特异性的(bs)(结合共受体上的两个不同位点)。通过使用杵臼fc构型，包含与fc区连接的vh和vl的肽可以不相同，但仍将配对形成能够结合wnt共受体(例如lrp5或lrp6)上两个不同位点的双特异性结合结构域。

10、形成双抗体、vhh、scfv和fab的肽可以来源于如下抗体(即“源抗体”)：该抗体因其与期望靶标结合而被选择，所述双抗体、vhh、scfv和fab形成结合结构域。对于fzd结合结构域，“fzd源抗体”可以为结合一种以上fzd受体(例如fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9和fzd10中的一种以上)并拮抗wnt信号传导或抑制wnt与给定fzd受体结合的抗体。或者，fzd源抗体可以为结合fzd受体而不拮抗wnt信号传导或不抑制wnt与fzd受体结合的抗体。同样，对于共受体结合结构域，“共受体源抗体”可以为结合wnt共受体(例如lrp5/6)并拮抗wnt信号传导或抑制wnt与wnt共受体结合的抗体。或者，共受体源抗体可以为结合共受体(例如lrp5/6)而不拮抗wnt信号传导或不抑制wnt与共受体结合的抗体。

11、在本发明的一个实施方式中，fzd激动剂的fzd结合结构域可以以比与其他fzd(即fzd1、fzd2、fzd3、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9和fzd10)的亲和力(affinity)更高的亲和力特异性地结合特定的fzd(例如fzd4)，或者可以是泛特异性的(与fzd受体家族的一个以上其他成员结合)。在一个实施方式中，fzd结合结构域以比与任何其他卷曲蛋白家族成员的结合高大于10倍的亲和力特异性地结合一种fzd。

12、在本发明的一个实施方式中，fzd激动剂结合fzd4，即“fzd4激动剂”。fzd4激动剂的fzd4结合结构域可以特异性地结合fzd4(以比其他fzd更高的亲和力结合fzd4)，或者可以是泛特异性的(结合fzd4和fzd受体家族的一种以上其他成员，例如卷曲蛋白类受体1(fzd1)、卷曲蛋白类受2(fzd2)、卷曲蛋白类受体3(fzd3)、卷曲蛋白类受体5(fzd5)、卷曲蛋白类受体6(fzd6)、卷曲蛋白类受体7(fzd7)、卷曲蛋白类受体8(fzd8)、卷曲蛋白类受体9(fzd9)或卷曲蛋白类受体10(fzd10))。在一个实施方式中，fzd结合结构域以比上述任何其他卷曲蛋白家族成员高大于10倍的亲和力特异性地结合fzd4。

13、在本发明的一个实施方式中，fzd激动剂结合fzd5，即“fzd5激动剂”。fzd5激动剂的fzd5结合结构域可以特异性地合fzd5(以比其他fzd更高的亲和力结合fzd5)或者可以是泛特异性的(结合fzd5和fzd受体家族的一种以上其他成员，例如fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9或fzd10)。在一个实施方式中，fzd结合结构域特以比上述任何其他卷曲蛋白家族成员高大于10倍的亲和力特异性地结合fzd5。

14、在本发明的fzd激动剂的一个实施方式中，wnt共受体结合结构域为二价单特异性lrp5/6共受体结合结构域，并结合lrp5和/或lrp6共受体上的单表位(例如结合wnt1的lrp5和/或lrp6共受体的表位(lrp5或lrp6的e1-e2结构域)或结合wnt3a的lrp5和/或lrp6共受体的表位(lrp5或lrp6的e3-e4结构域))。在本发明的一个实施方式中，共受体结合结构域是二价双特异性lrp5/6结合结构域，其结合lrp5和/或lrp6共受体胞外结构域内的两个表位，例如，共受体结合结构域与lrp5和/或lrp6共受体的wnt1表位(e1-e2)和wnt3表位(e3-e4)相互作用。在本发明的一个实施方式中，共受体结合结构域是二价双特异性结合结构域，其结合lrp5和lpr6的胞外结构域，例如，该结构域与lrp5共受体的wnt1表位(e1-e2)和lrp6共受体的wnt1表位(e1-e2)相互作用，或者，该结构域与lrp5共受体的wnt3a表位(e3-e4)和lrp6共受体的wnt3a表位(e3-e4)相互作用，或者，替代地，该结构域与lrp5共受体的wnt1表位(e1-e2)和lpr6共受体的wnt3a表位(e3-e4)相互作用，或反之亦然。

15、图6中描绘了本文所述的四价结合抗体分子的各种形式。在一个特定形式双抗体-fc-fab中，lrp5/6结合双抗体与fc结构域的n末端连接，两个fab与fc结构域的c末端连接，其中，fab通过fab重链可变结构域(vh)与fc结构域的ch3连接。或者，fab通过轻链可变区(vl)与fc结构域的ch3连接。

16、我们先前报道了多价结合分子，所述多价结合分子包含fc结构域、fzd结合结构域和在fc结构域的相对末端的wnt共受体(lrp5/6)结合结构域，例如，具有与fc结构域的一个末端连接的fzd4双抗体以及与该fc结构域的另一末端连接的lrp5/6结合双抗体的分子，参见pct/ib2019/051174(发明人angers等)和pct/ib2020/055463(发明人angers等)，两者均通过引用整体并入。

17、据报道，wnt-β连环蛋白信号传导(特别是通过fzd4的激活)对于脉管系统发育和成体脉管系统稳态是重要的。更具体地，它对于血视网膜的屏障功能和血脑屏障(brb和bbb)至关重要。fzd4信号传导中的缺陷可导致内皮细胞通透性缺陷，已知该通路内的基因突变会导致血管缺陷(例如诺里病(norrie disease)、fevr)。在血视网膜屏障处，胞外配体诺里蛋白(norrin)主要激活fzd4-tspan12-lrp5复合物，以调节内皮细胞间相互作用、屏障功能和通透性(wang等，(2012)norrin/frizzled4 signaling in retinal vasculardevelopment and blood brain barrier plasticity.cell.151:1332-1344)。在血脑屏障处，分泌的wnt7a/b生长因子主要激活fzd4-gpr124-lrp6受体复合物(chang等,(2017)，gpr124 is essential for blood-brain barrier integrity in central nervoussystem disease.nat.med.23:450-460)。本文所述的fzd4激动剂，例如，具有lrp5/6双抗体结合结构域和由结合fzd4的两个fab片段组成的fzd4结合结构域的构造，其中，结合结构域位于fc结构域的相对的末端，产生特别稳定且同质的分子，该分子具有出乎意料高水平的在内皮细胞中的wnt-β连环蛋白信号通路激活，从而转化为增强的屏障功能和降低的血管通透性(图11)。实质上，本文所述的fzd4激动剂起到诺里蛋白和wnt7a/b模拟分子的作用。

18、本发明还包括使用本文所述的fzd激动剂的方法。本文描述的是使用本发明的四价结合抗体分子激活wnt信号通路(例如wnt/β-连环蛋白信号通路)的方法，预期该方法促进细胞上fzd受体和wnt共受体(例如，fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9和fzd10受体中的一种以上以及rp5和/或lrp6共受体)的接近，其中，fzd激动剂与fzd受体和lrp5和/或lpr6共受体的结合激活wnt信号通路。

19、血视网膜屏障(brb)的形成和视网膜血管生成需要由配体诺里蛋白(ndp[诺里病蛋白])、受体fzd4、共受体lrp5和tspan12(四次跨膜蛋白12)诱导的β连环蛋白信号传导。因此，本发明的一个方面为通过用有效量的本发明的四价fzd4激动剂处理眼组织(例如视网膜组织)来促进和/或维持视网膜脉管系统屏障功能和血管生成的方法。

20、此外，本发明的一个方面为通过用有效量的本文所述的四价fzd4激动剂处理brb或bbb脉管系统来促进、恢复和/或维持brb和bbb功能的方法。本发明的另一方面为通过向患有病症或病况的受试者施用有效量的本发明的fzd4激动剂来治疗该受试者的方法，所述病症或病况的特征在于视网膜或脑血管生成缺陷，所述视网膜或脑血管生成缺陷的特征在于内皮细胞屏障功能降低导致血管渗漏。本发明的另一方面为用于治疗或预防病症或病况的fzd4/lrp5四价结合抗体分子或药物组合物，所述病症或病况的特征在于视网膜或脑血管生成缺陷，和/或特征在于内皮细胞屏障功能降低和/或血管渗漏。本发明的另一方面为治疗或预防病症或病况的方法，所述病症或病况的特征在于视网膜或脑血管生成缺陷和/或内皮细胞屏障功能降低和/或血管渗漏，所述方法包括向有需要的人施用治疗有效量的本文所述的fzd4/lrp5四价结合抗体分子。本发明的另一方面是fzd4/lrp5四价结合抗体分子在制备用于治疗或预防病症或病况的药物中的应用，所述病症或病况的特征在于视网膜或脑血管生成缺陷和/或内皮细胞屏障功能降低和/或血管渗漏。此类病症或病况包括眼部疾病，包括但不限于视网膜或黄斑疾病。此类视网膜或黄斑疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、coats病、fevr、诺里病、黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿和儿童玻璃体视网膜病。本发明的实施方式中包括的另外的病症或病况包括但不限于阿尔茨海默氏病、癫痫、多发性硬化症、局部缺血和中风。

21、本发明的一个实施方式包括通过促进整个类器官的脉管系统网络的屏障功能来产生血管化的脑的类器官的方法，由此使用有效量的本文所述的四价fzd4激动剂模拟血脑屏障功能。

22、此外，本发明的一个实施方式为通过向患有胃肠道病症的受试者施用有效量的本发明的药物组合物(例如包含fzd5激动剂的组合物)来治疗此类受试者的方法，所述受试者包括患有全部肠或部分肠的炎症(也称为炎症性肠病)的受试者。炎症性肠病的示例包括但不限于克罗恩病和溃疡性结肠炎。

23、此外，本发明的一个实施方式为通过在有效量的本发明的四价结合抗体分子的存在下培养ips或其他多能干细胞(psc，pluripotent stem cell)来使这些细胞向各种谱系定向分化的方法。

24、本文还描述了用于制备本发明的四价结合抗体分子的方法。

25、本发明的模块化方面允许在fc结构域的相对的末端上混合和匹配来源于fzd结合抗体和lrp5/6结合抗体的结合结构域，以产生可以结合fzd-lrp5/6共受体复合物来选择性激活wnt信号传导的四价结合抗体分子。本文所述的用于激活wnt信号通路的四价结合抗体分子的模块性和有效性与现有技术中描述的wnt替代物形成对比，所述wnt替代物由单价fzd和wnt共受体结合配体组成、或由结合配体不连接到fc结构域的相对两端的fzd和wnt共受体结合配体组成。