抗CD98抗体及其应用的制作方法

本文公开提供单克隆抗体，特别是特异性结合人或小鼠cd98的单克隆抗体。还提供编码抗cd98抗体的核酸分子，以及包含所述核酸分子的表达载体以及宿主细胞。还公开了包含抗cd98抗体的药物组合物、偶联物以及多特异性抗体。还提供用于治疗各种疾病，特别是肿瘤，例如表达cd98的肿瘤的方法。

背景技术：

1、ii型跨膜蛋白cd98(也被称为cd98重链(cd98hc)或4f2hc，由slc3a2基因编码)与多种轻链相互作用，形成不同的异二聚体氨基酸转运体(hat)。轻链在氨基酸转运过程中发挥作用，而cd98通过稳定轻链结构并帮助轻链定位到细胞膜的方式参与转运活性。cd98已被证明通过促进氨基酸转运活性参与肿瘤发生、肿瘤发展和转移，以促进细胞的存活，增强整合素信号传导，并增加细胞的扩散、迁移、存活和生长。在过去的十年中，cd98已成为开发癌症治疗方法的一个有吸引力的靶点，因为它在多种类型的实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤中表达上调，并与不良的临床结果相关。值得注意的是，cd98蛋白在正常组织中广泛表达，包括脑、脾、肾、小肠、睾丸、造血系统等。

2、在hayes等人(int j cancer 137(2015),710-720)中，抗人cd98(hcd98)抗体ign523在白血病、淋巴瘤和肺癌的异种移植肿瘤模型中显示出强大的抗肿瘤活性。

3、cn105385694b公开了一种与cd98结合的单克隆抗体，并教导了其作为载体递送抗肿瘤或抗炎剂的应用。cn105385694b的公开内容仅提供了体外数据，表明抗cd98抗体能够在细胞裂解中与肺癌细胞结合，而没有显示体内数据。抗体在体内的表现，如肿瘤特异性结合活性或药代动力学性质均未知。

4、wo2007114496a公开了多种抗cd98抗体，其中一些抗体对膀胱癌细胞系中亮氨酸摄取有抑制作用，对携带表达hcd98/hlat1-egfp的小鼠ct26结肠癌细胞系的小鼠展现出抗肿瘤作用。克隆之一c2igg1在移植了人类伯基特(burkitt)淋巴瘤细胞系ramos的小鼠中显示出抗肿瘤作用。

5、还有其他专利申请公开，包括abbvie的wo2017214456a1、wo2017214458a2、wo2017214462a2和第一三共株式会社(daiichi sankyo co ltd.)的wo2015146132a1，提供了包括抗cd98抗体和药物如bcl-xl抑制剂的偶联物。

6、然而，上述文件中都没有讨论正常组织中抗cd98抗体与cd98结合可能引起的问题。这个问题在携带经基因工程化改造以表达hcd98的癌细胞系的动物模型或异种移植模型中不存在，因为动物模型的正常组织表达小鼠cd98，而其不是抗体的靶标。抗cd98抗体的上靶/脱靶肿瘤(on target/off tumor)结合，一方面可能会破坏正常组织中存在的cd98的功能，另一方面可能会减弱抗体对靶标肿瘤细胞的抗肿瘤作用。

7、事实上，cd98在正常组织中的广泛表达为临床应用带来了几个主要挑战。靶向破坏cd98基因导致胚胎死亡(tsumura等人，(2003)，biochemical and biophysicalresearch communications 308，第847-851页)。条件性敲除cd98损害造血干细胞和祖细胞的增殖和再生能力(bajaj等人，(2016)，cancer cell 30，第792-805页)。因此，靶向性副作用和“抗原沉没(antigen sink)”问题是开发靶向cd98的抗体疗法的主要关注点。

8、目前对抗cd98抗体作为抗肿瘤疗法的需求尚未得到满足。此外，希望能够开发出对cd98正常生理功能的影响较小，并减少“抗原沉没”现象的副作用的抗cd98抗体。

技术实现思路

1、本发明人成功地鉴定了一种抗cd98抗体(s1-f4)，该抗体在异种移植和cd98人源化小鼠构建的同源肿瘤模型中引起广谱的fc依赖性抗肿瘤活性，且不依赖于干扰cd98的生理功能。s1-f4的抗肿瘤活性需要先天免疫和适应性免疫组分，包括fcγrs、巨噬细胞、树突状细胞和cd8+t细胞。随后，为了克服在正常组织中cd98抗体结合的“抗原沉没”问题，本发明人解析了s1-f4/cd98复合物结构，并生成了一系列ph依赖性结合变体，从而通过增加肿瘤特异性结合和显著改善药代动力学特征来促进整体抗肿瘤活性。

2、在第一方面，本公开内容涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人或小鼠cd98，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：

3、重链cdr1(hcdr1)，包括选自seq id no:10、20、30、40、50、60和70的氨基酸序列或由其组成；

4、重链cdr2(hcdr2)，包括选自seq id no:11、21、31、41、51、61和71的氨基酸序列或由其组成；

5、重链cdr3(hcdr3)，包括选自seq id no:12、22、32、42、52、62和72的氨基酸序列或由其组成；

6、轻链cdr1(lcdr1)，包括选自seq id no:15、25、35、45、55、65和75的氨基酸序列或由其组成；

7、轻链cdr2(lcdr2)，包括选自seq id no:16、26、36、46、56、66和76的氨基酸序列或由其组成；

8、轻链cdr3(lcdr3)，包括选自seq id no:17、27、37、47、57、67和77的氨基酸序列或由其组成。

9、在一个实施方案中，所述抗体或其片段包括以下(a)至(g)中的任一项：

10、(a)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其分别包括seq id no:10、11和12的氨基酸序列或由其组成；和lcdr1、lcdr2、lcdr3，其包括seq id no:15、16和17的氨基酸序列或由其组成；

11、(b)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其分别包括seq id no:20、21和22的氨基酸序列或由其组成；和lcdr1、lcdr2、lcdr3，其包括seq id no:25、26和27的氨基酸序列或由其组成；

12、(c)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其分别包括seq id no:30、31和32的氨基酸序列或由其组成；和lcdr1、lcdr2、lcdr3，其包括seq id no:35、36和37的氨基酸序列或由其组成；

13、(d)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其分别包括seq id no:40、41和42的氨基酸序列或由其组成；和lcdr1、lcdr2、lcdr3，其包括seq id no:45、46和47的氨基酸序列或由其组成；

14、(e)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其分别包括seq id no:50、51和52的氨基酸序列或由其组成；和lcdr1、lcdr2、lcdr3，其包括seq id no:55、56和57的氨基酸序列或由其组成；

15、(f)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其分别包括seq id no:60、61和62的氨基酸序列或由其组成；和lcdr1、lcdr2、lcdr3，其包括seq id no:65、66和67的氨基酸序列或由其组成；

16、(g)hcdr1、hcdr2和hcdr3，其分别包括seq id no:70、71和72的氨基酸序列或由其组成；和lcdr1、lcdr2、lcdr3，其包括seq id no:75、76和77的氨基酸序列或由其组成；

17、其中包含以上(a)至(f)中任一项的抗体或其片段特异性结合hcd98，并且包含(g)的抗体或其片段特异性结合小鼠cd98。

18、在一个实施方案中，抗体或其片段包括：

19、重链可变区(vh)，其包括与选自seq id no:13、23、33、43、53、63和73的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同源性的氨基酸序列；和/或

20、轻链可变区(vl)，其包括与选自seq id no:18、28、38、48、58、68和78的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同源性的氨基酸序列。

21、在另一个实施方案中，抗体或其片段包括：

22、vh，其包括选自seq id no:13、23、33、43、53、63和73的氨基酸序列，和/或

23、vl，其包括选自seq id no:18、28、38、48、58、68和78的氨基酸序列。

24、在一个具体的实施方案中，抗体或其片段包括以下(a)至(g)中的任一项：

25、(a)vh，其包括seq id no:13的氨基酸序列或由其组成，和vl，其包括seq id no:18的氨基酸序列或由其组成；

26、(b)vh，其包括seq id no:23的氨基酸序列或由其组成，和vl，其包括seq id no:28的氨基酸序列或由其组成；

27、(c)vh，其包括seq id no:33的氨基酸序列或由其组成，和vl，其包括seq id no:38的氨基酸序列或由其组成；

28、(d)vh，其包括seq id no:43的氨基酸序列或由其组成，和vl，其包括seq id no:48的氨基酸序列或由其组成；

29、(e)vh，其包括seq id no:53的氨基酸序列或由其组成，和vl，其包括seq id no:58的氨基酸序列或由其组成；

30、(f)vh，其包括seq id no:63的氨基酸序列或由其组成，和vl，其包括seq id no:68的氨基酸序列或由其组成；

31、(g)vh，其包括seq id no:73的氨基酸序列或由其组成，和vl，其包括seq id no:78的氨基酸序列或由其组成；

32、其中包含以上(a)至(f)中任一项的抗体或其片段特异性结合hcd98，并且包含(g)的抗体或其片段特异性结合小鼠cd98。

33、在一个实施方案中，抗cd98抗体或其片段结合hcd98具有ph依赖性，其中抗体或其片段在酸性ph下与hcd98的结合活性高于在中性ph下的结合活性。例如，与中性ph下的结合活性相比，酸性ph下的结合活性高至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。结合活性可以通过现有技术中已知的任何方法测定，例如elisa、facs或表面等离子共振(如)。例如，当采用elisa法测定与hcd98的结合活性时，抗体或其片段在酸性ph下的ec50比在中性ph下的ec50低至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。酸性ph为5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8，特别是6.5。中性ph为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6，特别是7.4。在一个实施方案中，抗体或其片段在酸性ph下具有需要的结合活性，而在中性ph下没有结合活性或相当低的结合活性。

34、在一个实施方案中，相对于不在肿瘤细胞上或肿瘤细胞内的hcd98，抗cd98抗体或其片段表现出与在肿瘤细胞上或肿瘤细胞内的hcd98优先结合。具体地，这种结合偏好是通过抗体或其片段与hcd98的ph依赖性结合来实现的。例如，在受试者例如人的肿瘤微环境中的ph下，抗cd98抗体或其片段与hcd98的结合活性显著大于受试者例如人中正常生理ph下的结合活性。例如，当采用elisa法测定与hcd98的结合活性时，抗体或其片段在肿瘤微环境ph下的ec50比正常生理ph下的ec50低至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍。在一个实施方案中，肿瘤微环境中的ph可以是约为6.0至7.0的ph，比如ph 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0或更低，例如ph6.5。在另一个实施方案中，正常生理ph可以是正常血液或血清的ph，例如ph 7.4。在一个实施方案中，抗体或其片段在肿瘤微环境中具有需要的结合活性，并且在正常生理ph下无结合活性或具有相当低的结合活性。

35、在一个实施方案中，本技术涉及一种抗体或其片段，其与上述抗体或其抗原结合片段中的任一个结合的hcd98上的相同表位结合。具体地，所述抗体或其片段与hcd98的氨基酸序列(seq id no:9)的第135、376-384和391-399位氨基酸残基中的表位结合。更具体地，抗体或其片段直接结合其中氨基酸残基h135、e384、e392、d397直接参与结合抗体的表位。

36、在一个实施方案中，抗cd98抗体包括igg1、igg2、igg3、igg4亚类的重链恒定区或其变体，以及κ或λ类型的轻链恒定区或其变体。在一个优选的实施方案中，抗cd98抗体包含igg1的重链恒定区。

37、在一个实施方案中，抗原结合片段为单链可变区，fab、fab’、f(ab’)2、scfv、dsfv或ds-scfv。

38、在一个实施方案中，抗体可以是多特异性抗体，例如，双特异性、三特异性抗体、双体或微抗体。

39、在一个优选的实施方案中，抗体或其片段包括hcdr1、hcdr2和hcdr3，其分别具有seq id no:10、11和12的氨基酸序列；以及lcdr1、lcdr2、lcdr3，其具有seq id no:15、16和17的氨基酸序列；其中，六个cdr的任一个中的一个或多个氨基酸突变为天冬氨酸(d)，或谷氨酸(e)，或突变为组氨酸(h)，并且抗体或其片段显示与hcd98的ph依赖性结合。优选地，突变为d或e的氨基酸位于与hcd98上结合表位内或结合表位附近的组氨酸密切相互作用的位置，或者突变为h的氨基酸位于与hcd98上结合表位内或结合表位附近的天冬氨酸或谷氨酸密切相互作用的位置。

40、在一个实施方案中，抗体或其片段用于基于抗体的治疗。

41、在第二方面，本公开内容提供一种分离的多核苷酸，其编码第一方面的抗体或其片段。在一个实施方案中，所述分离的多核苷酸包括与选自seq id no:14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69、74或79的核苷酸序列具有至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少98％同源性或100％同源性的核苷酸序列。

42、在第三方面，本公开内容涉及一种表达载体，其包括第二方面的分离的多核苷酸。

43、在第四方面，本公开内容涉及一种宿主细胞，其包括第二方面的分离的多核苷酸或第三方面的表达载体。

44、在第五方面，本公开内容涉及一种组合物，例如，药物组合物，其包括第一方面的抗cd98抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物包括治疗有效量的抗cd98抗体或其片段。

45、在第六方面，本公开内容提供一种在有需要的受试者中减少肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、治疗癌症或预防癌症复发的方法，包括向受试者施用治疗有效量的第一方面的抗cd98抗体或其片段或第五方面的组合物。

46、在第七方面，本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的第一方面的抗cd98抗体或其片段或第五方面的组合物。

47、在第八方面，本公开内容提供第一方面的所述抗cd98抗体或其片段在制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于减少肿瘤、抑制肿瘤细胞生长、治疗癌症、预防癌症复发。在一个实施方案中，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。

48、在第六方面或第八方面的一个实施方案中，所述肿瘤或癌症表达cd98，特别是hcd98。在第六方面或第八方面的一个实施方案中，所述肿瘤或癌症的微环境的ph低于受试者的正常生理ph。例如，所述肿瘤或癌症的微环境具有酸性ph，比如ph 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0或更低，例如约ph 6.5，且受试者的正常生理ph为正常血液或血清的ph，例如ph 7.4。更具体地，所述癌症选自淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、肝细胞癌、胰腺癌、胰腺上皮样癌、乳腺癌、结直肠腺癌、皮肤表皮样癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、非小细胞肺癌、胃癌、急性髓系白血病、胶质瘤、舌癌、下咽鳞状细胞癌、胆管癌、骨软化症、骨肉瘤、肾癌和神经母细胞瘤。

49、在第七方面或第八方面的一个实施方案中，所述自身免疫性疾病由免疫细胞如t细胞或b细胞的异常扩增引起。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病选自多发性硬化症、i型糖尿病或类风湿性关节炎。

50、在最近的研究中，cd98hc被确定为一种强大的受体介导的胞质转运(rmt)靶点，可促进增强治疗性抗体的脑递送(y.joy yu zuchero等人，neuron 89，第70-82页，2016年1月6日)。血脑屏障(bbb)穿透性差的抗体可与抗cd98抗体配对作为双特异性抗体，以改善它们穿过血脑屏障的转运和脑积累。

51、因此，在第九方面，本公开内容涉及一种融合蛋白，例如双特异性抗体，其包括第一抗原结合片段，其为第一方面的特异性结合hcd98的抗原结合片段，以及第二抗原结合片段，其特异性结合与第一方面的抗原结合片段所结合不同的第二抗原。在一个实施方案中，双特异性抗体是治疗性抗体或诊断性抗体。在一个实施方案中，在系统施用后，与特异性结合第二抗原的单特异性抗体相比，所述双特异性抗体显示出更高的脑积累。

52、在第十方面，本技术涉及一种治疗肿瘤的组合、偶联物或组合物，其包含(a)第一方面的抗hcd98抗体，和(b)第二抗肿瘤试剂。在一个实施方案中，所述第二抗肿瘤试剂可以是调节免疫检查点蛋白的试剂，包括但不限于pd-1、pd-l1、ctla-4、4-1bb、4-1bbl、cd28、cd40、cd40l、cd47、ox40、ox40l、tim-3、tigit、nkg2a、b7-h3、b7-h4、vista、lag3、2b4。在一个实施方案中，调节免疫检查点蛋白的试剂是一种特异性结合免疫检查点蛋白的抗体。

53、本发明人发现，本技术的抗hcd98抗体需要巨噬细胞和cd8+t细胞才能发挥其抗肿瘤作用。因此，在第十方面的优选的实施方案中，第二抗肿瘤剂可以是增强巨噬细胞吞噬功能的试剂，或可以是增强cd8+t细胞作用的试剂。在一个实施方案中，所述第二抗肿瘤试剂是通过靶向吞噬抑制因子(如cd47)来增强巨噬细胞吞噬功能的试剂。在一个具体的实施方案中，增强巨噬细胞吞噬功能的试剂为抗cd47抗体。在另一个实施方案中，所述第二抗肿瘤试剂增强cd8+t细胞的作用，例如通过阻断或逆转细胞介导的免疫应答的负调控，例如通过靶向抑制性受体，来增强cd8+t细胞的作用。在一个具体的实施方案中，所述第二抗肿瘤试剂是特异性结合pd-1、ctla-4、pd-l1或4-1bb的抗体。在另一个实施方案中，本技术的抗cd98抗体不能与耗竭巨噬细胞的剂剂(如抗csf1r抗体)联合使用。