EPO变体和调节剂的制作方法

本发明涉及非红细胞生成的促红细胞生成素(non-erythrogenicerythropoietin)的至少一种变体(v-epo)的负功能调节剂及包含它们的药物组合物或试剂盒。所述v-epo的负功能调节剂可以是单特异性或多特异性抗体抗-ev3、抗-ev4、抗-ev1-4、抗-ev1-5、抗-ev1-1或ev2-1，或抗-epo受体(epor)、抗-ephb4、抗-csf2rb、反义寡核苷酸、dna诱饵、rna诱饵、核酶、antagomir、shrna、lna或sirna。描述了这些功能调节剂的几种用途，它们已被有利地用作药物，用于治疗肿瘤病理、增殖性病理、自身免疫性和非自身免疫性慢性炎症性疾病、神经退行性疾病以及用于治疗进行器官或组织移植的患者。本发明还描述了epo的变体用于治疗肿瘤病理、增殖性病理、自身免疫性和非自身免疫性慢性炎症性疾病、神经退行性疾病，以及用于治疗进行器官或组织移植的患者和作为诊断剂。根据另一方面，描述了促红细胞生成素至少一种变体的单克隆抗体。

背景技术：

1、单克隆抗体(mab)是制药行业中增长最快的细分市场。mab因其独特的特性，例如与小分子相比的高靶点特异性、良好的药代动力学(高半衰期)、快速开发和高成功率，尤其受生物治疗师欢迎。

2、目前，数百万人患有癌症或患过癌症。肿瘤是以异常细胞不受控生长、侵袭和扩散为特征的一组疾病。干细胞和内皮成分参与肿瘤的形成和发展现在是显而易见的。事实上，实验证据表明，癌症干细胞(csc)通过与血管室的双向通信，分级引导肿瘤生长，影响微环境和对化疗和放疗的反应。csc负责肿瘤的引发和维持过程，也负责肿瘤对治疗的耐药性，从而导致复发。因此，csc是一个重要的治疗靶点，但人们对其病理生物学的潜在机制仍知之甚少，因此很难识别出能够靶向csc的分子。

3、人促红细胞生成素(epo)是一种30.4kda的糖蛋白，主要由肾脏产生和分泌。epo通常存在于循环流中，是主要的红细胞生成激素。通过与表面受体epor的结合，epo负责通过刺激红系祖细胞的分化和增殖来调节红细胞的产生，并负责维持红系系列本身。编码epo的基因位于7号染色体(7q11-22)上，由5个外显子和4个内含子组成，其转录193个氨基酸的单个多肽。这种多肽经过特定的翻译后修饰，包括糖基化、二硫桥的形成和27个氨基酸疏水序列(称为前导序列)的去除。epo的合成由非常敏感的反馈系统控制，反馈系统的产生和分泌取决于氧气供应的变化。事实上，其合成机制基于转录因子缺氧诱导因子(hif)的存在。同时，缺氧在控制肿瘤生长和血管生成方面也起关键作用，是肿瘤适应和生存的有效机制。事实上，参与缺氧信号通路的基因在缺氧血管/周围坏死微环境中被csc过表达，但在切除边缘的移行组织中不表达，切除边缘的移行组织在解剖病理学术语中被认为是“无病”的。

4、epo及其衍生物在治疗由于肾衰竭、红细胞生成减少引起的贫血以及与骨髓抑制化疗方案联合治疗肿瘤中的用途是众所周知的，尽管epo治疗涉及达到与生理浓度相差甚远的血液浓度。

5、最近，由于选择性剪接机制，epo的转录变体(v-epo)已经被描述，其在生理上存在于具有非红细胞生成功能的循环流中。

6、选择性剪接在真核生物的进化中起着重要作用。最近的研究表明，大约40-60％的人类基因经历了选择性剪接事件，产生了广泛的蛋白质异构体。

7、在v-epo的情况下，导致外显子3或外显子4(分别定义为hs3和hs4)缺失的选择性剪接机制翻译了与epo不同的蛋白质。epo和hs3编码的ev-3蛋白有29个氨基酸不同，因此分子量从epo的20kda降低到ev-3的16.8kda。

8、在这两种蛋白质的糖基化形式中，ev-3中n-糖基化位点(asn-38)的缺失导致表观分子量的差异更大(～5-8kda)。人蛋白epo具有四螺旋束结构，这是典型的造血生长因子。四个长α-螺旋(a、b、c和d)由两个长交叉环(ab和cd)和一个短环(bc)连接。在ab环的羧基末端附近有一个短的α-螺旋段(小螺旋b')，它对结合epor受体很重要。如上所述，ev-3蛋白的序列表明了ab环的缺失，这导致与epo相比三级结构发生显著变化。epo和ev-3序列的系统处理使得能够产生允许鉴定和区分样品内epo和ev-3的两种肽。所得到的具有序列“ditvgqqave”(seq id no：15)的肽包含在ev-3中，但不包含在epo中，并且没有鉴定出包括该序列的其他蛋白质。因此，该肽被认为是ev-3的特异性标识符。另一方面，肽序列“dittgcae”(seq id no：16)在ev-3中不存在，并且仅包含在人epo中，因此它用作epo-特异性标识符。

9、对cd34+人造血祖细胞进行的实验表明，与epo不同，ev-3给药不会刺激红细胞生成集落(cfu-e)的形成。由于cd34+造血干细胞表达epor，ev-3缺乏刺激作用可能是由于ev-3剪接变体中缺乏epor结合位点。

10、这一观察结果与epo蛋白中存在的ev-3蛋白序列中ab环的缺失一致。ab环包含一个已被鉴定为对结合epor和形成同源二聚体复合物很重要的片段。

11、出人意料的是，我们的结果显示，与健康的脑细胞相比，脑肿瘤细胞表达的epo天然变体hs3和hs4的水平显著增加，并且与构成肿瘤块的分化肿瘤细胞相比，原发性癌症干细胞和内皮细胞中epo、hs3和hs4均存在非常可观且统计学上显著的富集。负责触发红细胞生成机制的epor受体结合位点的缺失导致hs3和hs4的红细胞生成活性消失，然而，hs3和hs4保留了通过与替代受体结合诱导细胞增殖的能力。

12、如上所述，epo的信号通路由其与表面受体(epor)的结合介导，epor是一种跨膜糖蛋白(pm:66-78kda)，属于细胞因子受体超家族，主要位于骨髓中的祖细胞上。

13、epor在非造血细胞(例如血管内皮细胞)中的表达表明，在肾脏、成肌细胞和肠道中，存在epo-epor信号传导的非造血生物学效应。特别是，最近的研究报道了epor在乳腺癌、卵巢癌和子宫癌、黑色素瘤和肾癌的组织活检中的表达，这表明了epo-epor结合介导的诱导不受控细胞增殖的机制。

14、epor有两种形式：一种是负责红细胞生成作用的同源二聚体形式，另一种是由epor链和β-共受体链(βcr、cd131、集落刺激因子2受体-β(csf2rb))组成的异源二聚体形式。第二种受体负责epo在包括心脏、神经系统、肠道、子宫、肾脏和胰岛在内的几个器官中的非红细胞生成作用。epor/cd131异源二聚体的激活比同源二聚体epor的激活所需epo的浓度高得多，并且导致与同源二聚体epor部分共享的信号转导。特别是，两者都诱导pi3k和mapk的激活、stat5的磷酸化和nf-kb家族成员结合活性的调节。

15、还证明了称为肝配蛋白b型受体4(ephb4)的第三种受体的存在，其与其他eph受体的不同之处在于疏水腔中48位存在异亮氨酸而不是酪氨酸。已经表明，ephb4主要与ephrinb2相互作用，但也能够作为功能性epo受体。对组成性表达ephb4和epor的卵巢癌细胞进行的研究表明，ephrin-b2和epo都直接激活ephb4，导致激酶scr和stat3介导的增殖和侵袭性迁移增加。相反，epor在相同卵巢癌细胞中的激活导致jak/stat信号通路的激活。epo对ephb4的直接激活在采用非内源性表达epor的ephb4转染的cos-1细胞中得到进一步证实。ephrin-b2和epo都独立地激活ephb4，并且当释放到相同的靶细胞上时可以协同作用。结合研究显示，与epor的kd为28nm相比，epo对ephb4的结合亲和力较低(kd为880nm)。此外，在临床试验中，观察到随着肿瘤细胞中ephb4而非epor的高表达水平，乳腺癌患者的存活率显著降低，采用epo治疗进一步降低了存活率。这表明epo支持肿瘤生长，特别是通过激活ephb4启动的机制。

16、出人意料的是，我们的结果显示，胶质瘤癌症干细胞表现出ephb4和csf2rb的组成性过度表达，这与epor表达显著降低相一致。这些数据表明，epo和ev-3通过选择性作用于不同的受体来发挥其功能：通过与epor结合，epo激活与造血细胞中的红细胞生成相关的信号通路；相反，epo和ev-3通过与ephb4和csf2rb受体结合，以自分泌和旁分泌机制激活与肿瘤细胞增殖、血管生成和存活相关的病理过程，从而促进肿瘤疾病的进展。

17、我们之前的研究表明，epo作为胶质母细胞瘤肿瘤细胞的生长因子发挥作用，并且通过单克隆抗体阻断信号通路能够抑制干细胞和内皮成分的生长，诱导细胞凋亡，以及通过抑制血管结构的形成和迁移来降低内皮细胞的功能(wo/2015/189813)。

18、在这方面，本发明证明，虽然在健康细胞中，epo的转录变体(v-epo)以小的方式产生，并且仅对环境刺激(例如缺氧)起作用，但在肿瘤细胞中，特别是在csc中，它们的表达是稳定的和组成性的。csc表现出不平衡的基因型和表型重排，有利于epo及其受体的基因复制，以及epo剪接变体(如hs3和hs4)的组成型表达，它们在细胞存活和治疗耐药性中起关键作用。从为证明本发明而进行的研究中可以看出，与健康细胞相比，csc同时显示出epo的hs3和hs4变体、肿瘤过程的特异性受体csf2rb和ephb4的表达增加，负责造血过程的epor的表达减少与它们相关。

19、本发明中证明的epo的变体及其受体的特异性组成型表达模式的发现超出了epo与红细胞生成相关的生理作用，因此可以鉴定新的易于分析的诊断、预后和预测标志物，如hs3、hs4、ephb4和csf2rb，这些标志物也可以预测患者的预后和对治疗的反应。

20、此外，由于缺乏介导红细胞生成级联反应的epor受体的结合位点，表达显著增加的v-epo失去了其红细胞生成功能，但通过与肿瘤学模型中也显著过表达的替代受体(例如ephb4和csf2rb)结合保留了野生型蛋白的生物促瘤功能。

21、从这些前提来看，很明显，对与造血无关的转录变体和介导细胞内信号传导的受体的特异性阻断可以构成对表现出肿瘤病理和相关临床表现的患者具有重要益处的治疗，同时将对红细胞生成功能的损害降至最低。

22、因此，本发明考虑了包含epo的转录变体和/或上述受体(epor、ephb4、csf2rb)的功能调节剂的共制剂，设想其作用是双向特异性阻断epo的促瘤信号通路，排除其参与红细胞生成的活性。这种同时阻断可以通过共给药的单个抗体或特别构建的抗体激活，其中抗体的fab’和scfv片段可以通过将许多片段附着到载体表面(如免疫多聚核糖体中)来构建，或者通过化学偶联或基因工程产生二价(双抗体，60kda)，三价(三抗体，90kda)或四价(四抗体，120kda)片段构建，从而获得具有更高结合亲和力的多价构建体。或者，可以使用由scfv组成的其他抗体形式，例如双特异性/三特异性双抗体，其由两个/三个scfv片段形成，其中一个针对肿瘤分子，另一个针对细胞毒性效应细胞上存在的表面分子和/或循环分子，如epo变体。

23、本发明的数据表明，v-epo在csc中的组成型表达诱导鞘氨醇-1-磷酸(s1p)的合成和释放增加，导致csc的特定协同机制，并影响其对化疗和放疗的反应。

24、s1p是最有效的促瘤蛋白脂质，通过刺激肿瘤细胞和癌症干细胞的增殖、存活和耐药性，以及通过与特异性g蛋白偶联受体(最初称为edg，现在称为s1p受体(s1pr))结合作用于干细胞和内皮细胞来促进血管生成，发挥其作用。胶质母细胞瘤细胞，特别是胶质母细胞瘤干细胞(gsc)，已被证明可以合成s1p并将其输出到细胞外环境中，在那里促进对化疗药物的耐药性。marfia et al.,2014证明，与缓慢生长的细胞相比，高度增殖的胶质母细胞瘤癌症干细胞能够合成和向细胞外室释放的s1p水平高10倍(marfia et al.,2014glia.62(12):1968-81.doi:10.1002/glia.22718.pmid:25042636)。同一研究小组证明，胶质母细胞瘤内皮细胞(gec)也合成s1p并将其释放到细胞外环境中，当与癌症干细胞共同培养时，它们显著增加了s1p合成的关键酶-激酶2(sphk2)的表达，s1p的产生进一步显著增加。通过自分泌和旁分泌系统的高水平s1p刺激csc的生长和gec的迁移，加剧肿瘤块生长(abdelhadi l et al.2018biochim biophys acta mol cell biol lipids.1863(10):1179-1192.doi:10.1016/j.bbalip.2018.07.009.pmid:30056170)。由于其在控制细胞增殖和活力中的重要作用，s1p与其受体的相互作用在自身免疫性疾病中的影响已经被研究，因此是深入研究的主题，目的是鉴定新的更有效的抗癌药物。到目前为止，已经鉴定出鞘氨醇类似物fty720在磷酸化后作为s1pr的功能性拮抗剂。fty720已被证明在器官移植后治疗、多发性硬化症以及在体外减少不同类型肿瘤的肿瘤生长方面是有效的。人们在确定新的有效治疗方法的基础、临床前和临床研究方面做出了大量努力。强烈需要新的治疗方法来治疗肿瘤，这些方法在癌症干细胞水平上也是有效的，并且在特别是在治疗侵袭性实体瘤，例如胶质母细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、子宫癌和卵巢癌，以及非实体瘤，例如一般白血病，特别是慢性髓系白血病中也是有效的。

25、因此，本发明的另一个目的是提供包含epo变体和/或其受体的抑制剂和鞘脂信号通路的抑制剂的共同给药的产品和组合物，用于治疗肿瘤病理、增殖性病理、自身免疫性或非自身免疫性慢性炎症性疾病，以及用于治疗进行器官或组织移植的患者。

技术实现思路

1、本发明涉及促红细胞生成素的生物和/或合成变体(v-epo)的负功能调节剂以及包含它们的药物组合物或试剂盒。具体地说，描述了epo的至少一种天然或合成变体的负功能调节剂，其中所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体，其中所述负功能调节剂是单特异性或多特异性抗体抗-ev3、抗-ev4、抗-ev1-4、抗-ev1-5、抗-ev1-1或抗-ev2-1和/或抗-epo受体(epor、ephb4、csfr2b)、反义寡核苷酸、dna诱饵、rna诱饵、核酶、antagomir、shrna、lna或sirna。在优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

2、根据第二方面，本发明涉及epo的至少一种变体的负功能调节剂，用作为药物，其中所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体。

3、根据第三方面，本发明涉及至少一种v-epo的负功能调节剂，用于治疗肿瘤病理、增殖性病理，用于治疗自身免疫性和非自身免疫性慢性炎症性疾病，用于治疗神经退行性疾病以及用于治疗进行器官或组织移植的患者，其中所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体。

4、根据第四方面，描述了促红细胞生成素的变体(v-epo)，用作为诊断剂，所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq idno：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体。

5、根据第五方面，描述了一种药物组合物，其包含促红细胞生成素(epo)的至少一种变体的负功能调节剂，用于治疗肿瘤病理、增殖性病理、自身免疫性和非自身免疫性慢性炎症性疾病以及用于治疗进行器官或组织移植的患者，所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体，和/或抗epo受体(epor、ephb4、csf2rb)、反义寡核苷酸、dna诱饵、rna诱饵、核酶、antagomir、shrna、lna或sirna。

6、根据第六方面，描述了一种药物试剂盒，其包含从以下项组成的组中选择的两种或多种组分：

7、-促红细胞生成素(epo)的至少一种变体的负功能调节剂，其中所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体；

8、-促红细胞生成素(epo)的至少一种变体的单克隆抗体，其中所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体；其中所述抗体是双特异性抗体、双抗体、三抗体或四抗体；

9、-编码促红细胞生成素(epo)的变体的多核苷酸，其中所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体；

10、-化疗药物；

11、-epo受体(epor、ephb4、csf2rb)的天然或合成变体的负功能调节剂；

12、-epo受体(epor、ephb4、csf2rb)的负功能调节剂；

13、-编码epo受体(epor、ephb4、csf2rb)的多核苷酸；

14、-鞘氨醇-1-磷酸(s1p)信号通路的负功能调节剂；

15、-s1p及其代谢的抑制剂；或

16、-保留红细胞生成功能的epo变体的模拟物。

17、根据第七方面，描述了促红细胞生成素(epo)的至少一种变体的单克隆抗体，其中所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体。

18、根据第八方面，描述了促红细胞生成素(epo)的至少一种变体的负功能调节剂，用作为诊断剂，其中所述变体选自由以下项组成的组：具有氨基酸序列seq id no：9的ev3变体、具有氨基酸序列seq id no：10的ev4变体、具有氨基酸序列seq id no：11的ev1-4变体、具有氨基酸序列seq id no：12的ev1-5变体、具有氨基酸序列seq id no：13的ev1-1变体、具有氨基酸序列seq id no：14的ev2-1变体。

19、从属权利要求描述了本发明的特定实施方案。