体外转录技术的制作方法

背景技术：

1、特别是考虑到其作为治疗方式的日益增加的重要性，用于制造rna的技术非常重要且很有价值。

技术实现思路

1、本公开提供了与用于制造rna、特别是治疗性rna(例如，治疗性mrna)的技术相关的某些见解。在一些实施方案中，当用于例如治疗级rna的大规模生产时，所提供的技术特别有用，和/或提供令人惊讶的益处和/或优点。

2、例如，本公开提供了关于体外转录(ivt)反应混合物中特别有用的胞苷三磷酸(ctp)和/或腺苷三磷酸(atp)浓度的见解(例如，在初始反应混合物中，本领域技术人员应理解，ntp在反应过程中被利用，因此它们的浓度随着时间的推移而降低，除非补充)。

3、在一些实施方案中，本公开提供了改善rna产率、rna完整性、rna加帽水平和/或效率中的一个或多个的技术；可替代地或另外地，在一些实施方案中，本公开提供了降低一种或多种污染物或异常产物(例如，dsrna)的水平的技术。

4、在一些实施方案中，本公开提供了独立于反应中产生的rna转录物的序列而有用的ivt反应条件(例如，反应混合物中的核苷酸浓度)。

5、本公开涵盖了对通过ivt产生rna的问题的认识，特别是在大规模(例如，商业规模)上。除其他之外，本公开确定，以高产率和/或完整性和/或低异常产物(例如，双链rna(dsrna))水平产生体外转录的rna可能具有挑战性。本公开特别认识到，在产生治疗性(例如，用于施用于动物，特别是人)rna(例如，mrna)时，尤其是在商业规模上(例如，0.1-10g、10-500g、500g-1kg、750g-1.5kg；本领域技术人员将认识到，不同的产品可以不同的规模制造，例如，取决于患者群体大小)和/或以药品质量(这通常可能更难以实现，例如，在较大规模上，例如因为污染物和/或完整性问题在此类规模上可能更加明显)，此类挑战可能特别严峻。

6、在一些实施方案中，所提供的技术在应用于产生具有相对高的c和/或a含量(例如，相对于转录物中的g和/或u含量)的转录物时可以是有用的。然而，在一些实施方案中，本公开提供了令人惊讶的见解，即所提供的反应条件(例如，反应混合物中的ctp和/或atp[或其类似物]水平[例如，绝对和/或相对水平])可以是独立于转录序列而有用的。

7、在一些实施方案中，如本文所述的升高的ctp和/或atp改善产率和/或完整性和/或加帽，和/或减少一种或多种异常产物(例如，dsrna)的产生；在一些实施方案中，独立于所产生的rna中的核苷酸的百分比和/或摩尔比(例如，核苷酸含量)。

8、在一些实施方案中，本文提供的技术对于以商业质量和/或商业规模制造rna特别有用。本领域技术人员将意识到，不同的治疗性rna以迥然不同的规模使用。例如，受试者特异性rna已有所描述并用于个体化的癌症疫苗中(参见，例如ro7198457)；这些rna的制造规模只需足以治疗相关个体即可。相比之下，出于其他目的，例如作为一般癌症疫苗、作为感染原疫苗、作为用于表达抗体、酶、细胞因子等的载体开发的rna通常可大规模制造。治疗性rna已被证明在最近的sars-cov-2大流行中特别有价值，需要以前所未有的规模进行制造。在各种实施方案中，本文提供的技术可在这些规模中的每一个上使用。因此，例如在一些实施方案中，本文所述的技术可用于产生在约0.01g/h rna至约1g/h rna、1g/h rna至约100g/hrna、约1g rna/h至约20g rna/h、或约100g rna/h至约10,000g rna/h)的rna(如，以制造规模)。在一些实施方案中，在每批次产生数十或数百毫克至数十或数百克(或更多)rna的反应中利用本文所述的技术。阅读本公开的本领域技术人员将认识到，所实现的某些益处(例如，改善的完整性和/或产率)在药物级制造的背景下和/或特别是在如本文所述的大规模上可以是特别有利的。

9、在一些实施方案中，可以并行地利用本文所述的技术，例如以进一步改善通量容量。

10、在一些特定实施方案中，所提供的技术可用于制造批量大小为至少0.01g、0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g、0.09g、0.1g、0.5g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g rna(包括，例如，至少15g rna、至少20g rna、至少25g rna、至少30g rna、至少35grna、至少40g rna、至少45g rna、至少50g rna、至少55g rna、至少60g rna、至少70g rna、至少80g rna、至少90g rna、至少100g rna、至少150g rna、至少200g rna、至少300g rna、至少400g rna、至少500g rna、至少750g、至少1kg、至少1.1kg、至少1.2kg、至少1.3kg、至少1.4kg、至少1.5kg或更多)的rna制剂(例如，rna药物物质)。在一些实施方案中，本文提供的技术可以用于产生在约0.01g g至约500g rna、约0.01g至约10g rna、约1g至约10g rna、约10g至约500g rna、约10g至约300g rna、约10g至约200g rna或约30g至约60g rna范围内的批量大小。

11、在一些实施方案中，本文提供的技术可用于产生至少1.5rna/h(包括，例如，至少2g rna/h、至少2.5g rna/h、至少3g rna/h、至少3.5g rna/h、至少4g rna/h、至少4.5grna/h、至少5g rna/h、至少5.5g rna/h、至少6g rna/h、至少6.5g rna/h、至少7g rna/h、至少7.5g rna/h、至少8g rna/h、至少8.5g rna/h、至少9g rna/h、至少10g rna/h或更高)的质量通量(mass throughput)的大规模制造。在一些实施方案中，本文所述的大规模制造方法可以达到15g rna/h至20g rna/h(例如，约17g/小时)的容量。

12、事实上，在一些实施方案中，所提供的技术提供了令人惊讶的优点，即它们可用于各种规模和/或特别是非常大的制造规模(例如，超过约数十或甚至数百克/批)，和/或是基本上独立于rna序列而有用的(例如，即使在如此大的规模下)(例如，以用于产生具有各种c和/或a含量的rna)。

13、在一些方面，本公开提供了通过体外转录产生核糖核酸(rna)分子的方法，所述方法包括在反应条件下产生反应混合物以形成rna分子，反应混合物包含核酸聚合酶、核酸模板，以及：总胞苷三磷酸(ctp)和/或一种或多种功能性ctp类似物与总鸟苷三磷酸(gtp)和/或一种或多种功能性gtp类似物的摩尔比a；和/或总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物与总尿苷三磷酸(utp)和/或一种或多种功能性utp类似物的摩尔比b；和/或总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物与总腺苷三磷酸(atp)和/或一种或多种功能性atp类似物的摩尔比c，其中rna分子包含：总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比x；和/或总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比y；和/或总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物的摩尔比z，并且其中：a为至少1.25，和/或a是x的至少约1.10倍；和/或b为至少1.25，和/或b是y的至少约1.10倍；和/或c为至少1.10，和/或c是z的至少约1.10倍。

14、在一些实施方案中，a为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。在一些实施方案中，a为至少1.5。在一些实施方案中，a是x的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。在一些实施方案中，a是x的至少约1.15倍。在一些实施方案中，a是x的至少约1.20倍。

15、在一些实施方案中，b为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。在一些实施方案中，b为至少1.5。在一些实施方案中，b是y的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。在一些实施方案中，b是y的至少约1.15倍。在一些实施方案中，b是y的至少约1.20倍。

16、在一些实施方案中，c为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。在一些实施方案中，c为至少1.25。在一些实施方案中，c是z的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。在一些实施方案中，c是z的至少约1.15倍。在一些实施方案中，c是z的至少约1.20倍。

17、在一些实施方案中，本公开提供的方法还包括将以下合并到反应混合物中：总atp和/或一种或多种功能性atp类似物与总gtp和/或一种或多种功能性gtp类似物的摩尔比d；和/或总atp和/或一种或多种功能性atp类似物与总utp和/或一种或多种功能性utp类似物的摩尔比e，其中rna分子还包含：总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比v；和/或总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比w，并且其中：d为至少1.10，和/或d是v的至少约1.05倍；和/或e为至少1.10，和/或e是w的至少约1.05倍。在一些此类实施方案中，d为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。在一些此类实施方案中，d为至少1.20。在一些此类实施方案中，d是v的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。在一些此类实施方案中，d是v的至少约1.10倍。在一些此类实施方案中，d是v的至少约1.20倍。在一些此类实施方案中，e为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。在一些此类实施方案中，e为至少1.20。在一些此类实施方案中，e是w的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。在一些此类实施方案中，e是w的至少约1.10倍。在一些此类实施方案中，e是w的至少约1.20倍。

18、在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物的其余部分添加到反应混合物中。

19、在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总ctp和/或一种或多种功能性ctp类似物添加到反应混合物中。

20、在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总gtp和/或一种或多种功能性gtp类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总gtp和/或一种或多种功能性gtp类似物的其余部分添加到反应混合物中。

21、在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总gtp和/或一种或多种功能性gtp类似物添加到反应混合物中。

22、在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总utp和/或一种或多种功能性utp类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总utp和/或一种或多种功能性utp类似物的其余部分添加到反应混合物中。

23、在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总utp和/或一种或多种功能性utp类似物添加到反应混合物中。

24、在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总atp和/或一种或多种功能性atp类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总atp和/或一种或多种功能性atp类似物的其余部分添加到反应混合物中。

25、在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总atp和/或一种或多种功能性atp类似物添加到反应混合物中。

26、在一些实施方案中，rna分子是单链的。在一些实施方案中，rna分子是线性rna、信使rna和/或核苷修饰的信使rna。

27、在一些实施方案中，核酸模板是dna模板。在一些实施方案中，模板是线性模板(例如，线性dna模板)。在一些实施方案中，模板是质粒(例如，dna质粒)。在一些实施方案中，模板是扩增子(例如，如通过聚合酶链式反应产生的)。

28、在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.01-2μg/μl的核酸模板。

29、在一些实施方案中，核酸聚合酶是rna聚合酶。在一些实施方案中，核酸聚合酶是t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、n4病毒体rna聚合酶，或其变体或功能结构域。

30、在一些实施方案中，反应混合物包含(例如，还包含)反应缓冲液、rna酶抑制剂、焦磷酸酶、一种或多种盐、还原剂和亚精胺中的一种或多种。在一些实施方案中，反应缓冲液包含hepes、tris-hcl或pbs。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为20-60mm或100-150mm的反应缓冲液。在一些实施方案中，反应缓冲液的ph为7-9。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.01-0.1u/μl的rna酶抑制剂。在一些实施方案中，一个单位(u)的rna酶抑制剂将5ng的rna酶a的活性抑制至少50％。在一些实施方案中，焦磷酸酶是无机焦磷酸酶。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.01-0.2mu/μl的焦磷酸酶。在一些实施方案中，反应混合物中包含的一种或多种盐包括一种或多种镁盐和/或一种或多种钙盐。在一些实施方案中，一种或多种镁盐包括乙酸镁或氯化镁。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为20-60mm的一种或多种盐。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为100-150mm的一种或多种盐。在一些实施方案中，还原剂包括二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为5-15mm的还原剂。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.5-3mm的亚精胺。

31、在一些实施方案中，体外转录进行至少20-180分钟。在一些实施方案中，体外转录在25-55℃的温度下进行。

32、在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在rna分子的体外转录后消化核酸模板。在一些此类实施方案中，通过dna酶消化核酸模板。在一些此类实施方案中，dna酶包括dna酶i。

33、在一些实施方案中，本文公开的方法包括(例如，还包括)在体外转录以产生rna分子后消化ivt反应混合物的多肽(例如，核酸聚合酶、焦磷酸酶、dna酶诸如dna酶i、rna酶抑制剂)。在一些此类实施方案中，通过蛋白酶消化核酸聚合酶。在一些此类实施方案中，蛋白酶是或包括蛋白酶k。

34、在一些实施方案中，本公开提供的技术包括(例如，还包括)进行体外转录反应和/或由此产生的rna的一项或多项评估(例如，一个或多个质量控制参数的评估)。在一些此类实施方案中，一个或多个质量控制参数选自由转录期间和/或之后rna分子的rna完整性、rna浓度、残余双链rna(dsrna)和/或加帽组成的组。在一些此类实施方案中，使用琼脂糖凝胶电泳评估rna完整性。在一些此类实施方案中，使用毛细管凝胶电泳评估rna完整性。在一些此类实施方案中，通过该方法产生的rna分子的rna完整性为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

35、在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的rna分子的rna完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不为至少1.25、b不为至少1.25和/或c不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，rna完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，rna完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，rna完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.05倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍，和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，rna完整性增加至少约5％。在一些此类实施方案中，rna完整性增加至少约8％。

36、在一些实施方案中，使用uv吸收分光光度法评估rna浓度。在本公开的一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的相关样品或制剂(例如，在ivt溶液中)中的rna分子的浓度为至少约1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14、mg/ml或15mg/ml。在一些此类实施方案中，rna分子的浓度(例如，在相关样品或制剂中，诸如在ivt溶液中)相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不为至少1.25、b不为至少1.25和/或c不为至少1.10的反应混合物)增加至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在一些此类实施方案中，rna分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25、b不为至少1.25、c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25、b不为至少1.25、c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25、b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，根据本文提供的技术产生的rna分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用，其中a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在一些实施方案中，rna分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，rna分子的浓度增加至少约20％。

37、在一些实施方案中，使用聚合酶链式反应(pcr)、吸光度、荧光染料和/或凝胶电泳评估残余dsrna。在一些实施方案中，使用定量pcr评估残余dsrna(例如，在ivt溶液中)。在一些此类实施方案中，rna分子转录期间和/或之后的残余dsrna为至少约25pg dsrna/μgrna、50pg dsrna/μg rna、75pg dsrna/μg rna、100pg dsrna/μg rna、125pg dsrna/μgrna、150pg dsrna/μg rna、175pg dsrna/μg rna、200pg dsrna/μg rna、225pg dsrna/μgrna、250pg dsrna/μg rna、275pg dsrna/μg rna、或300pg dsrna/μgrna。在一些此类实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsrna相对于适当的比较物(例如，相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不为至少1.25，b不为至少1.25，和/或c不为至少1.10的反应混合物)减少至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。在一些实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsrna相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsrna相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不是x是至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)减少至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。在一些此类实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsrna相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，残余dsrna浓度降低至少约70％。

38、在一些实施方案中，rna分子的加帽通过以下方式评估：(a)评估功能性加帽rna的翻译；(b)进行生物活性测试以确认rna分子被翻译成正确大小的多肽(例如，蛋白质)；(c)进行基于核酸酶的测定；和/或(d)进行基于催化性核酸的测定。在一些此类实施方案中，基于核酸酶的测定包括基于rna酶的测定，例如其中基于rna酶的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)使大量rna分子与一种或多种结合rna分子的探针退火形成rna-探针复合物；(b)用rna酶消化rna-探针复合物，以产生包含rna分子的5’末端的片段；(c)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合纯化片段；(d)对纯化的片段进行质谱法(ms)；(e)基于观察到的ms值鉴定加帽和未加帽片段；和/或(f)比较加帽和未加帽片段的量以计算加帽rna的百分比。在一些此类实施方案中，rna酶包括rna酶h。在一些此类实施方案中，基于核酸酶的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)使大量rna分子和与rna分子的5’非翻译区中与rna的5'rna帽或未加帽的倒数第二个碱基相邻的序列互补的一种或多种dna寡核苷酸接触；(b)使一种或多种dna寡核苷酸与rna分子的5'非翻译区中的序列退火形成dna/rna杂合复合物；(c)用一种或多种核酸酶降解dna/rna杂合复合物和/或未退火的rna分子，以产生加帽和未加帽的5’末端rna片段和3’rna片段；(d)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合将加帽和未加帽的5’末端rna片段与3’rna片段分离；和/或(e)比较加帽和未加帽的5’末端rna片段的量以计算加帽rna的百分比。在一些此类实施方案中，基于催化性核酸的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)用催化性核酸分子将大量rna分子切割成5’末端rna片段和至少一个3’rna片段，其中rna分子具有催化性核酸分子的切割位点；(b)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合分离5’末端rna片段和3’rna片段；(c)使用光谱法、定量质谱法、测序或其组合测量加帽和未加帽的5’末端rna片段的量；和/或(d)比较加帽和未加帽的5’末端rna片段的量以计算加帽rna的百分比。在一些此类实施方案中，催化性核酸分子包括dna核酶或核酶。在一些此类实施方案中，根据本文提供的技术产生的rna分子的至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％是加帽的。在一些此类实施方案中，根据本文提供的技术产生的rna分子的加帽相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不为至少1.25，b不为至少1.25，和/或c不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

39、在一些实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsrna相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

40、在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的rna分子的加帽相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不是x的至少约1.10倍、b不是y的至少约1.10倍和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

41、在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的rna分子的转录期间和/或之后的残余dsrna相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

42、在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的一种或多种rna分子的加帽增加至少约5％。