一种大豆抗蚜虫基因及其分子标记和应用

1.本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种大豆抗蚜虫基因及其分子标记和应用。


背景技术：

2.大豆蚜虫(aphisglycines matsμmura)是大豆的主要害虫之一，广泛地分布在我国的各个大豆主产区，通过吸食大豆韧皮部光合作用产物，传播植物病毒来影响大豆的产量和品质。大豆蚜虫常常聚集在植株的嫩茎和嫩叶处，使得植株被害处叶绿素消失，叶片卷曲，受害严重的植株，茎叶卷缩、发黄、植株矮小，分枝和结荚减少，从而影响大豆产量。苗期蚜虫发生严重时，整株可能死亡，蚜虫大发生时若不及时采取防治措施，会导致减产20～40％，严重时减产可达50％以上。目前大豆蚜虫的防治依赖于使用杀虫剂，不仅增加生产成本，还会杀死蚜虫的天敌、危害环境，利用寄主植物抗性是防治蚜虫的有效方法。
3.国内外研究人员已经筛选到了一些抗蚜虫的大豆资源，先后发现了dowling、jackson、pi 71506、pi 567543c、pi 567597c等抗源(hill等2004；mensah等2005；mian等2008；bhusal等2013)。国内筛选鉴定到地方品种青皮平顶、嘟鲁豆和野生大豆85-32等，这些资源由于农艺性状较差很难直接应用于育种中。传统的育种手段受到周期长，效率低等条件的限制，而分子标记辅助育种技术利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，可以显著提高育种效率。但是目前国内对于大豆抗蚜虫的研究相对较少，缺乏优异的抗性资源及可用于育种的分子标记，已发掘的抗性资源无法得到很好的利用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大豆抗蚜虫基因及其分子标记和应用，开发并充分利用与所述抗蚜基因紧密连锁的分子标记，用于筛选优异的抗蚜品系，培育抗蚜大豆品种。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种大豆抗蚜虫基因，所述抗蚜虫基因位于大豆基因组第13号染色体上物理位置30,700,000～30,900,000之间。
7.本发明还提供了一种与上述抗蚜虫基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记包括snpm20、snpm80、m1147和m1151中的一个或多个的组合；
8.所述snpm20位于大豆第13号染色体30,702,907位，抗蚜大豆的碱基为t，感蚜大豆的碱基为g；
9.所述snpm80位于大豆第13号染色体30,855,712位，抗蚜大豆的碱基为t，感蚜大豆的碱基为g；
10.所述m1147在抗蚜大豆的扩增片段为228bp，在感蚜大豆的扩增片段为211bp；
11.所述m1151在抗蚜大豆的扩增片段为286bp，在感蚜大豆的扩增片段为239bp。
12.本发明还提供了一种鉴定上述分子标记的引物对，针对所述snpm20设计的引物对包括snpm20-f和snpm20-r，所述snpm20-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述snpm20-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；
13.针对所述snpm80设计的引物对包括snpm80-f和snpm80-r，所述snpm80-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述snpm80-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；
14.针对所述m1147设计的引物对包括m1147-f和m1147-r，所述m1147-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述m1147-r的核苷酸序列如seq id no.6所示；
15.针对所述m1151设计的引物对包括m1151-f和m1151-r，所述m1151-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述m1151-r的核苷酸序列如seq id no.8所示。
16.本发明还提供了上述抗蚜虫基因或上述分子标记或上述引物对在大豆分子标记辅助育种中的应用。
17.本发明还提供了一种大豆抗蚜虫分子标记检测方法，包括以下步骤：以大豆基因组dna为模板，与上述引物对混合配制pcr反应体系，进行pcr扩增。
18.优选的，所述pcr扩增的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性25s，58℃退火25s，72℃延伸10s，34个循环；72℃延伸5min。
19.优选的，所述pcr反应体系以20μl计，包括：模板1μl，上下游引物各2μl，2хm5 hiperplus taq hifi pcr mix 10μl和余量的ddh2o。
20.本发明还提供了一种筛选抗蚜虫大豆的方法，包括以下步骤：以大豆基因组dna为模板，与上述引物对混合配制pcr反应体系，进行pcr扩增；
21.对pcr产物进行检测，具有以下任一特性的品种或品系为抗蚜虫大豆：
22.(1)分子标记snpm20在大豆第13号染色体30,702,907位扩增出t；
23.(2)分子标记snpm80在大豆第13号染色体30,855,712位扩增出t；
24.(3)分子标记m1147扩增出228bp的dna片段；
25.(4)分子标记m1151扩增出286bp的dna片段。
26.有益效果：本发明利用抗蚜虫大豆种质方正秣食豆和感蚜虫大豆品种北丰9号杂交的群体，通过图位克隆的方法定位一个抗蚜虫新基因位点。遗传分析表明方正秣食豆的抗蚜虫性状是由显性单基因控制的，通过精细定位将抗蚜虫新基因精细定位到152.8kb的区间内。在此区间的两个分子标记snpm20和snpm80与这一基因连锁，利用这两个标记筛选含有目的基因的材料可靠性高。此外，与其紧密连锁的其他分子标记，m1147和m1151均能用于筛选含有目的基因的材料。利用这些分子标记进行辅助选择，极大地提高了筛选效率，从而缩短培育抗蚜品种的育种年限。
附图说明
27.图1为方正秣食豆(a)和北丰9号(b)蚜虫抗性比较；
28.图2为基因精细定位结果图；
29.图3为m1147分子标记在群体中的基因型鉴定，图中泳道编号与表4对应，下同；
30.图4为m1151分子标记在群体中的基因型鉴定。
具体实施方式
31.本发明提供了一种大豆抗蚜虫基因，所述抗蚜虫基因位于大豆基因组第13号染色体上物理位置30,700,000～30,900,000bp之间。
32.本发明所述抗蚜虫基因优选利用抗蚜虫大豆种质方正秣食豆和感蚜虫大豆品种北丰9号杂交的后代群体，通过图位克隆的方法定位得到。在本发明中，抗蚜虫品种方正秣食豆在该位点上的等位基因显著地提高了大豆对蚜虫的抗性。
33.本发明还提供了一种与上述抗蚜虫基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记包括snpm20、snpm80、m1147和m1151中的一个或多个的组合；
34.所述snpm20位于大豆第13号染色体30,702,907位，抗蚜大豆的碱基为t，感蚜大豆的碱基为g；
35.所述snpm80位于大豆第13号染色体30,855,712位，抗蚜大豆的碱基为t，感蚜大豆的碱基为g；
36.所述m1147在抗蚜大豆的扩增片段为228bp，在感蚜大豆的扩增片段为211bp；
37.所述m1151在抗蚜大豆的扩增片段为286bp，在感蚜大豆的扩增片段为239bp。
38.本发明所述分子标记snpm20和snpm80与所述抗蚜基因连锁，利用这两个标记筛选含有目的基因的材料可靠性高。因此利用本发明的任意一个或多个分子标记，均可以预测出待测材料对蚜虫的抗性。
39.本发明还提供了一种鉴定上述分子标记的引物对，针对所述snpm20设计的引物对包括snpm20-f和snpm20-r，所述snpm20-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述snpm20-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；
40.针对所述snpm80设计的引物对包括snpm80-f和snpm80-r，所述snpm80-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述snpm80-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；
41.针对所述m1147设计的引物对包括m1147-f和m1147-r，所述m1147-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述m1147-r的核苷酸序列如seq id no.6所示；
42.针对所述m1151设计的引物对包括m1151-f和m1151-r，所述m1151-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述m1151-r的核苷酸序列如seq id no.8所示。
43.本发明根据不同的分子标记所设计的引物对列于表1。
44.表1针对分子标记设计的引物对
45.序列引物seq id nosnpm20-fgattccccctgctgatgaca1snpm20-rgcctcatcaactcaacccttact2snpm80-ftcaacacttcagcctactttcct3snpm80-rcatttctggcttctcacctgat4m1147-ftcggtttcattaacaattcattt5m1147-rtcgagtttgaaattgatcagga6m1151-fgccttataaacctgataggctg7m1151-rttacccgggatagaaaagcc8
46.本发明还提供了上述抗蚜虫基因或上述分子标记或上述引物对在大豆分子标记辅助育种中的应用。
47.利用本发明所述抗蚜虫基因或上述分子标记或上述引物对，可用于确定大豆品种(品系)的蚜虫抗性，当满足下述任一个条件，即可判断抗蚜虫基因的存在，从而可应用于抗蚜虫大豆的分子标记辅助育种，缩短育种年限：用标记snpm20在大豆第13号染色体30,702,907位扩增出t，用标记snpm80在大豆第13号染色体30,855,712位扩增出t，或用标记m1147扩增出228bp的dna片段，用标记m1151扩增出286bp的dna片段，均标志着大豆品种中抗蚜虫新基因位点的存在。
48.本发明还提供了一种大豆抗蚜虫分子标记检测方法，包括以下步骤：以大豆基因组dna为模板，与上述引物对混合配制pcr反应体系，进行pcr扩增。
49.本发明对所述大豆基因组dna的提取方法并没有特殊限定，实施例中优选采用ctab法进行提取。本发明利用所述基因组dna和上述引物对配制pcr反应体系，所述pcr反应体系以20μl计，优选包括：模板1μl，上下游引物各2μl，2хm5 hiper plus taq hifi pcr mix 10μl和余量的ddh2o。本发明所述上下游引物的浓度优选均为2mmol
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。本发明利用所述pcr反应体系进行pcr扩增，所述pcr扩增的程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性25s，58℃退火25s，72℃延伸10s，34个循环；72℃延伸5min。
50.本发明可对所述pcr反应后的pcr产物进行测序从而确定指定位点的多态性，也可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或扩增电泳确定分子标记位点的多态性，从而确定大豆品种(品系)的蚜虫抗性。
51.本发明还提供了一种筛选抗蚜虫大豆的方法，包括以下步骤：以大豆基因组dna为模板，与上述引物对混合配制pcr反应体系，进行pcr扩增；
52.对pcr产物进行检测，具有以下任一特性的品种或品系为抗蚜虫大豆：
53.(1)分子标记snpm20在大豆第13号染色体30,702,907位扩增出t；
54.(2)分子标记snpm80在大豆第13号染色体30,855,712位扩增出t；
55.(3)分子标记m1147扩增出228bp的dna片段；
56.(4)分子标记m1151扩增出286bp的dna片段。
57.本发明所述pcr反应体系和pcr扩增的程序优选与上述相同，在此不再赘述。
58.下面结合实施例对本发明提供的一种大豆抗蚜虫基因及其分子标记和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
59.实施例1
60.群体构建及表型鉴定
61.1、原材料：方正秣食豆(来源于国家作物种质库，统编号zdd00236)，根据表2的抗性分级标准判定为抗蚜虫1级，且抗性不依赖大豆蚜虫的数量。
62.表2大豆蚜虫抗性鉴定分级标准
[0063][0064][0065]
2、利用方正秣食豆构建群体，通过图位克隆的方法定位抗蚜虫基因：利用方正秣食豆和高度感蚜虫品种北丰9号杂交(图1)，而后自交构建抗感蚜虫的遗传分离群体，抗性鉴定结果表明f1植株均表现出抗蚜虫，f2代群体中抗蚜虫植株和感蚜虫植株符合3：1的分离比，说明方正秣食豆的蚜虫抗性由显性单基因控制。
[0066]
实施例2
[0067]
抗性基因定位及连锁分子标记的确定
[0068]
利用bsa(集群分离分析)方法，将抗、感蚜虫植株的dna混合构建混池，从soybase数据库中的580对覆盖大豆全基因组的ssr引物中筛选在亲本间具有多态性并且符合极端混池规律的引物，发现satt114，sct_033和satt_335等3个标记为抗性连锁标记。利用这3个连锁标记并加密其他标记鉴定f2代植株以及由f2代植株自交多代后形成的f5代植株的基因型，结合表型进行初定位，初定位区间位于标记m1133到m1184之间，共1.01mb。为了进一步缩小区间，加密标记鉴定f
5:6
代植株的基因型，结合表型数据，筛选交换单株，将区间缩小到标记snpm20到snpm80之间，共152.8kb(图2)。该区间与目前在大豆中已发表的任何一个抗蚜虫基因的区间均不重合，为新的抗蚜虫基因。
[0069]
为了更好地利用方正秣食豆携带的抗蚜虫位点，与定位区间紧密连锁的snp标记snpm20和snpm80以及ssr标记m1147和m1151作为抗蚜虫位点的连锁标记，用于后代群体及其他大豆材料蚜虫抗性的分子标记辅助选择。
[0070]
以phytozome数据库中williams 82为参考基因组，利用软件primer 5.0设计包含snpm20和snpm80两个snp的特异引物(表1)。在参考基因组的第30,702,907位碱基处，该碱基的基因型为t或g，当所述snp位点的核苷酸为t时，所鉴定的材料与方正秣食豆的基因型一致，为抗大豆蚜虫的材料或候选抗大豆蚜虫的材料；当所述snp位点处的核苷酸为g时，所鉴定的材料与北丰9号的基因型一致，为感大豆蚜虫的材料或候选感大豆蚜虫的材料。在参考基因组的第30,855,712位碱基处，该碱基的基因型为t或g，当所述snp位点的核苷酸为t时，所鉴定的材料与方正秣食豆的基因型一致，为抗大豆蚜虫的材料或候选抗大豆蚜虫的材料；当所述snp位点处的核苷酸为g时，所鉴定的材料与北丰9号的基因型一致，为感大豆
蚜虫的材料或候选感大豆蚜虫的材料。
[0071]
在定位区间内的m1147和m1151两个分子标记，当所述m1147扩增出的条带大小为228bp时，所鉴定的材料与方正秣食豆的基因型一致，为抗大豆蚜虫的材料或候选抗大豆蚜虫的材料；当所述m1147扩增出的条带大小为211bp时，所鉴定的材料与北丰9号的基因型一致，为感大豆蚜虫的材料或候选感大豆蚜虫的材料。当所述m1151扩增出的条带大小为286bp时，所鉴定的材料与方正秣食豆的基因型一致，为抗大豆蚜虫的材料或候选抗大豆蚜虫的材料；当所述m1151扩增出的条带大小为239bp时，所鉴定的材料与北丰9号的基因型一致，为感大豆蚜虫的材料或候选感大豆蚜虫的材料。
[0072]
表3标记位点信息
[0073][0074]
实施例3
[0075]
分子标记在后代群体中的验证
[0076]
利用ctab法提取方正秣食豆、北丰9号和群体后代叶片的基因组dna并进行pcr扩增。体系为20μl，包括基因组dna 1μl，浓度为2mmol
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的上下游引物各2μl，ddh2o 4μl，2хm5 hiperplus taq hifi pcr mix(with blue dye)10μl(北京聚合美生物技术有限公司，货号mf002-plus-01)。pcr程序为95℃变性3min，95℃变性25s，58℃退火25s，72℃延伸10s，34个循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。上述pcr反应在abi(applied biosystems，美国)公司的pcr扩增热循环仪上进行扩增。
[0077]
标记snpm20和snpm80扩增的序列利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得与目标条带大小一致的条带后，pcr产物由北京博迈德基因技术有限公司进行测序。
[0078]
标记m1147和m1151扩增的条带利用6％变形聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。电泳后采用硝酸银染色法进行染色，染色完成后即可读取基因型。
[0079]
对方正秣食豆和北丰9号及其衍生后代的34个株系的dna进行pcr扩增，snpm20和snpm80的pcr产物测序后分析基因型，m1147和m1151扩增的pcr产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测基因型，图3为标记m1147扩增电泳图，图4为标记m1151扩增电泳图，其基因型统计后列在表4中。结果表明，11个株系中4个标记的基因型与方正秣食豆的基因型一致，所述snpm20的基因型为tt，所述snpm80的基因型为tt，所述m1147扩增的pcr产物为228bp，所述m1151扩增的pcr产物为286bp；11个株系中4个标记的基因型与北丰9号的基因型一致，所述snpm20的基因型为gg，所述snpm80的基因型为gg，所述m1147扩增的pcr产物为211bp，所述m1151扩增的pcr产物为239bp；另有12个株系中4个标记的基因型为杂合基因型，所述snpm20的基因型为gt，所述snpm80的基因型为gt，所述m1147扩增的pcr产物为两条带，一条228bp，一条211bp，所述m1151扩增的pcr产物为两条带，一条286bp，一条239bp。
[0080]
进一步的对这些株系进行抗蚜虫表型鉴定，每个株系的表型记录在表4中，其中材
料名称/编号规则为l-行号-单株号，如l-827-2表示第827行的第2个单株。结果表明，与方正秣食豆基因型一致的株系表型都为抗蚜，与北丰9号基因型一致的株系表型都为感蚜，基因型为杂合的株系表型都为抗蚜。说明所述snp和ssr可以用来鉴定方正秣食豆群体及其衍生后代的蚜虫抗性。
[0081]
表4分子标记的验证
[0082]
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。