一种有效缩短维生素C一步菌发酵反应周期的方法与流程

一种有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法。


背景技术：

2.维生素c在医药和临床方面都具有重要的应用价值，亦广泛用于食品工业和化妆品工业。目前维生素c生产常用方法为“二步发酵法”，第一步发酵中需以山梨醇为底物，但是发酵过程长，操作工艺烦琐，易受杂菌、噬菌体污染等。生产中一步发酵多采用一次投醇，将山梨醇最高浓度控制在35%左右，但是当初始山梨醇浓度较高时，会导致分批发酵的氧化率减少，从而导致山梨糖的产率降低。而且在35%山梨醇浓度下的发酵，存在前期高浓度山梨醇前期对生黑醋酸杆菌抑制高的现象，但是若采用较低浓度山梨醇，则设备利用率低，目前仍没有既可以减少山梨醇前期高抑制，缩短发酵周期，还可以提高设备利用率的有效方法。


技术实现要素：

3.为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法，能够使山梨醇浓度达到40%的同时解除高浓度山梨醇对生黑醋酸杆菌的抑制高的问题，同时还能够缩短发酵周期，提高产糖速率，增加od最大值，增加设备的利用率。
4.为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法，包括配制种液，配制发酵培养基，发酵。
5.所述配制种液，配制一次种液，将一次种液ph调至5-5.5，然后在整个过程不再控制ph,在110-120℃灭菌18-22min后将培养温度降至30-32℃，再接入二次种液，罐压0.035-0.045mpa，通气量4.8-5.2l/min，转速290-310rpm，待糖量达到60-70mg/ml时，得到种液。
6.所述一次种液与二次种液的体积比为65:8-12。
7.所述一次种液和二次种液的组成为：山梨醇190-210g/l；玉米浆干粉4-6g/l；硫酸铵0.9-1.1g/l；磷酸二氢钾0.9-1.1g/l；种液的od值为3-4。
8.所述一次种液和二次种液中的菌种为生黑醋酸杆菌，菌种保藏号为gdmcc no：61006。
9.所述配制发酵培养基，使用自来水配制发酵培养基，再将ph调至4.8-5.2后在113-117℃下对发酵罐培养基灭菌23-27min，得到发酵培养基。
10.所述发酵培养基的组分及占比为：山梨醇400g/l，玉米浆1.3-1.7g/l，碳酸钙0.9-1.1g/l，酵母膏0.9-1.1g/l，消泡剂0.25-0.35g/l；所述玉米浆和碳酸钙均为标准产品。
11.所述配制发酵培养基，先加入总量的1/2山梨醇，在发酵步骤中山梨醇锤度降至3
时加入总量的1/4山梨醇，待山梨醇锤度再次降至3时再加入总量的1/4山梨醇。
12.所述发酵，将发酵罐的通气量控制到1.7-1.9l/min，转速控制到440-460rpm，培养温度控制到35-37℃，罐压控制到0.035-0.045mpa培养，持续发酵，每1.9-2.1h取样检测发酵进程，至山梨醇浓度为零，山梨糖含量不再增加时，结束发酵。
13.本发明所述生黑醋酸杆菌，分类命名为：gluconobacter oxydans subsp.melanogenus，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2020年4月29日，保藏编号为gdmcc no：61006。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果为：（1）本发明的有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法，od最大值为4.598-4.872；（2）本发明的有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法，产糖速率快，产糖速率最高值可达32.81-34.65g/l/h，产糖速率平均值可达10.15-10.94g/l/h，反应周期能够缩短至32-34h；（3）本发明的有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法，通过分加可以在维持相同周期的条件下实现山梨醇浓度达到40%，明显缩短设备空闲时间，并将设备利用率由50%提高到75%。
附图说明
15.图1为实施例5的od值数据；图2为实施例5的山梨糖单位含量数据。
具体实施方式
16.为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
17.实施例1一种有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法，具体为：1.选四个5l搅拌发酵罐紧密组合成一组，四个5l搅拌发酵罐之间不连通，按照一步发酵培养基配方配制发酵罐培养基；所述发酵培养基的组分及占比为：山梨醇 400g/l，玉米浆 1.5g/l，碳酸钙 1g/l，酵母膏1g/l，消泡剂0.3g/l；所述发酵培养基使用自来水配制，在配制发酵培养基时，使用自来水定容至3l后，再将ph调至4.8-5.2。
18.所述玉米浆和碳酸钙均为标准产品。
19.2.利用1l自动发酵罐培养生黑醋酸杆菌二级种液，具体的培养过程为：配制0.65l种液，将种液ph调至5.1，然后在整个过程不再控制ph,在115℃灭菌20min后将培养温度降至31℃，再接入0.1l种液，罐压0.04mpa，通气量5l/min，转速300rpm，待糖量达到60-70mg/ml时，得到培养好的二级种液。
20.所述种液的组成为：山梨醇200g/l；玉米浆干粉5g/l；硫酸铵1g/l；磷酸二氢钾1g/l；种液的od值为3-4。
21.所述种液中的菌种为生黑醋酸杆菌，菌种保藏号为gdmcc no：61006。
22.3.在115℃下对发酵罐培养基灭菌25min，然后待罐内冷却后，控制初始通气量为1.8l/min，转速为450rpm，培养温度为36℃，种液的接种量为15%。
23.4.不同罐之间的条件对比：1#罐山梨醇一次投入；2#罐山梨醇先加入总量的1/4，剩余山梨醇在山梨醇锤度降至3时分两次加入，每次加入总量的3/8；3#罐山梨醇先加入1/2，剩余山梨醇在山梨醇锤度降至3时分两次加入，每次加入总量的1/4；4#罐山梨醇先加入3/4，剩余山梨醇分别在山梨醇锤度降至3时分两次加入，每次加入总量的1/8。
24.发酵过程中每2h用液相检测山梨糖含量，每8h用阿贝折射仪检测一次发酵液浓度，将发酵液浓度减去山梨糖含量除以10即为此时间点的锤度。
25.4.发酵数据检测：将发酵罐的通气量控制到1.8l/min，转速控制到450rpm，培养温度控制到36℃，罐压控制到0.04mpa培养，持续发酵，每2h取样检测发酵进程，至山梨醇浓度为零，山梨糖含量不再增加时，结束发酵。
26.5.计算与分析：1#发酵罐作为基础对照组，反应周期为40h，l-山梨糖含量355.44mg/ml,产糖速率8.89g/l/h。2#发酵罐反应周期为36h，l-山梨糖含量353.15mg/ml，产糖速率9.81g/l/h。3#发酵罐反应周期为34h，l-山梨糖含量348.37mg/ml，产糖速率10.25g/l/h；4#发酵罐反应周期为38h，l-山梨糖含量347.92mg/ml，产糖速率9.16g/l/h。2#罐反应初期产糖速率最快，od值最高，但是补加之后，山梨醇浓度瞬间增大，导致产糖速率变缓，od值有所下降；3#罐始终保持较低浓度的山梨醇，产糖速率和od值在一次、二次补加山梨醇后均为受到影响；4#初始山梨醇浓度较高，导致产糖速率和od值都较低，且形态异常的菌较多。
27.综合考虑，采用3#罐的培养条件进行后续实验。
28.实施例2用相同配方和培养条件，重复3次实施例1的试验，均使用3#罐实验条件，从而保证实验结果准确性，避免偶发、不可重复事件。最终实验发酵周期平均为32.67h，产糖速率为10.15-10.94g/l/h之间，实验结论准确有效。
29.实施例31.利用10l自动发酵罐培养生黑醋酸杆菌二级种液，具体的培养过程为：配制6.5l种液，将种液ph调至5.1，然后在整个过程不再控制ph,在115℃灭菌20min后将培养温度降至31℃，再接入1l种液，罐压0.04mpa，通气量5l/min，转速300rpm，待糖量达到60-70mg/ml时，得到培养好的二级种液。
30.所述二级种液中的菌种为生黑醋酸杆菌，菌种保藏号为gdmcc no：61006。
31.所述种液的组成为：山梨醇200g/l；玉米浆干粉5g/l；硫酸铵1g/l；磷酸二氢钾1g/l；种液的od值为3-4。
32.2. 在115℃下对50l自动发酵罐中的25l发酵培养基灭菌25min，然后待罐内冷却后，将7.5l培养好的二级种液，接入发酵罐中；所述发酵培养基的组分及占比为：山梨醇 400g/l，玉米浆 1.5g/l，碳酸钙 1g/l，酵母膏1g/l，消泡剂0.3g/l。
33.3.控制发酵罐中的初始ph值为4.8-5.2，培养温度为36℃，搅拌速度为450rpm，初始加入总量的一半山梨醇，利用移种之后空闲的10l罐进行剩余山梨醇的灭菌，待山梨醇锤
度降至3，补入剩余山梨醇的一半，锤度再次降至3，将剩余山梨醇一次补入，至山梨醇浓度为零，山梨糖含量不再增加时，为发酵终点。发酵33h至发酵终点后，l-山梨糖含量352.18mg/ml，产糖速率10.67g/l/h。
34.对比例1生黑醋酸杆菌二级种液的组成和发酵过程与实施例3相同，其不同之处在于：山梨醇在发酵培养基的制备过程中为一次性加入。
35.对比例1发酵42h至终点，l-山梨糖含量358.42mg/ml，产糖速率8.53g/l/h。
36.实施例41.利用100l自动发酵罐培养生黑醋酸杆菌二级种液，具体的培养过程为：配制65l种液，将种液ph调至5.1，然后在整个过程不再控制ph,在115℃灭菌20min后将培养温度降至31℃，再接入10l种液，罐压0.04mpa，通气量5l/min，转速300rpm，待糖量达到60-70mg/ml时，得到培养好的二级种液。
37.所述二级种液，发酵培养基的组成及发酵培养基的灭菌方法与实施例3相同。
38.2.将75l培养好的二级种液，接入含有250l发酵培养基的500l自动发酵罐中，初始ph值5.0-5.3，培养温度36℃，搅拌速度450rpm进行发酵。
39.3.初始加入总量的一半山梨醇，利用移种之后空闲的100l罐进行剩余山梨醇的灭菌，待山梨醇锤度降至3左右，补入剩余山梨醇的一半，锤度再次降至3左右，将剩余山梨醇一次补入，至山梨醇浓度为零，山梨糖含量不再增加时，为发酵终点。发酵34h至发酵终点后，l-山梨糖含量359.42mg/ml，产糖速率10.57g/l/h。
40.对比例2生黑醋酸杆菌二级种液的组成和发酵过程与实施例4相同，其不同之处在于：山梨醇在发酵培养基的制备过程中为一次性加入。
41.对比例1发酵41h至终点，l-山梨糖含量351.37mg/ml，产糖速率8.57g/l/h。
42.实施例5按照实施例4的方法，控制山梨醇在三次加入后在发酵培养基的占比为400g/l，初始加入总量的一半山梨醇，利用移种之后空闲的100l罐进行剩余山梨醇的灭菌，待山梨醇锤度降至3左右，补入剩余山梨醇的一半，锤度再次降至3左右，将剩余山梨醇一次补入，进行了三批500l发酵罐实验，同时设置对比试验，对比试验为将山梨醇一次性加入，实验结果如下：除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
43.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。