1.本发明涉及油藏工程技术领域，尤其涉及一种基于地质微生物群落特征分析的油井地下分层方法。
背景技术：
2.油层非均质性非常严重，具有多层系的特点。油层的非均质性是影响多油层开发部署和开发效果的最重要的因素之一。在油藏开发过程中，充分考虑到非均质性，能够高效的开发，在一定程度上可以增加油藏的可采储量。此外，能够合理地划分与组合开发层系是在开发部署上解决多油层油田层状非均质性的基本措施。在层系划分的基础上，实现分层注采，分层测试，分层改造，分层堵水，是非均质油藏开发的关键技术。
3.传统地下分层技术主要为示踪技术。示踪技术是在注入井中不同层注入不同的示踪剂；在采油井中取样并萃取富集所述示踪剂；检测富集后的所述示踪剂的浓度；根据所述示踪剂的浓度，分析确定产油井各层段的剩余油分布状况。示踪剂均为外来流体，测试移除后会污染储层中的本底浓度，因而传统示踪属于侵入性工作，对原始地层会产生一定程度的破坏。
技术实现要素：
4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于地质微生物群落特征分析的油井地下分层方法，该方法以油井钻井过程中产生的不同地下深度的岩屑为样品进行地下分层方法的构建，摆脱了传统示踪技术中示踪剂对地下的侵入，对油田开发全过程无破坏。
5.本发明提供了一种基于地质微生物群落特征分析的油井地下分层方法，包括以下步骤：1）采集油井钻井过程中产生的不同地下深度的岩屑；2）分别提取所述不同地下深度的岩屑的细菌基因组dna；3）以所述细菌基因组dna为模板，采用针对16srrna基因的引物分别进行扩增，得到扩增产物，分别对所述扩增产物进行测序；4）分析所述测序的结果确定不同地下深度的细菌种类和细菌丰度，利用不同地下深度的细菌种类和细菌丰度的结果构建分层基线。
6.优选的，步骤1）中，所述采集为间隔相同距离深度采集岩屑；当所述油井为直井时，岩屑采集的间隔距离为3~5m；当所述油井为水平井时，岩屑采集的间隔距离为15~30m。
7.优选的，步骤1）中所述岩屑的直径为1~3cm。
8.优选的，步骤2）中每个深度的岩屑提取到的细菌基因组dna的数量≥10000个。
9.优选的，步骤3）中所述引物为针对16srrna基因的v4和v5高变区的引物。
10.优选的，步骤4）中所述分层基线为每个地层深度所包含的菌种类型以及其丰度，所述分层基线以柱形图表示，纵坐标表示地层深度，横坐标的每个柱形代表此地层内所有的细菌丰度之和，用不同的颜色或形状表示，柱形的长度表示菌种的丰度。
11.优选的，步骤4）中，所述测序的结果预先经过质量控制，所述质量控制的方法包括以下步骤：s1.以不含岩屑的空白对照的细菌基因组dna作为干扰dna序列，分别按照式i所示公式计算不同地下深度的岩屑的测序结果的可信任地下信号分数；式i；s2.以所述可信任地下信号分数作为纵坐标，以不同地下深度的岩屑的dna序列的数量为横坐标，构建可信任地下信号分数与生物量的关系图，设置可信任阈值为80%，阈值以上且dna序列数量适中的区域为置信度较高的区域；以横坐标的最大量为1计，所述dna序列数量适中的区域为dna序列数量在1/6~5/6的区域，该区域的dna序列为通过qc的dna序列，用于后续测序结果的分析，其余的dna序列为未通过qc的dna序列。
12.优选的，步骤4）还包括利用所述测序的结果构建地层测井图。
13.优选的，步骤4）中所述地层测井图根据深度tvd构建。
14.优选的，所述地层测井图的构建方法包括：以tvd为纵坐标，以步骤2）中提取的细菌基因组dna的数量为横坐标的测井曲线；以tvd为纵坐标，以可信任地下信号分数为横坐标的测井曲线；以tvd为纵坐标，以通过qc和未通过qc的dna序列数量为横坐标的测井曲线；通过qc与未通过qc的dna序列以不同颜色或形状区分；以tvd为纵坐标，以通过qc和未通过qc的dna序列的菌种数量为横坐标的测井曲线；不同的菌种以不同颜色或形状区分。
15.本发明提供了一种基于地质微生物群落特征分析的油井地下分层方法，本发明基于微生物随环境的变化而产生差异，油井不同深度地层的温度、ph值、盐度、温度和压力都不相同，因此不同深度的地层会产生其特有的菌种的种类以及丰度，据此建立分层基线。本发明以油井钻井过程中产生的不同地下深度的岩屑为样品进行地下分层方法的构建，摆脱了传统示踪技术中示踪剂对地下的侵入，对油田开发全过程无破坏。
具体实施方式
16.本发明提供了一种基于地质微生物群落特征分析的油井地下分层方法，包括以下步骤：1）采集油井钻井过程中产生的不同地下深度的岩屑；2）分别提取所述不同地下深度的岩屑的细菌基因组dna；3）以所述细菌基因组dna为模板，采用针对16srrna基因的引物分别进行扩增，得到扩增产物，分别对所述扩增产物进行测序；4）分析所述测序结果确定不同地下深度的细菌种类和细菌丰度，利用不同地下深度的细菌种类和细菌丰度的结果构建分层基线。
17.本发明首先采集油井钻井过程中产生的不同地下深度的岩屑。在本发明中，每个地下深度的岩屑的采集的质量优选为50~400g，更优选为100~200g。在本发明中，所述采集为间隔相同距离深度采集岩屑；当所述油井为直井时，岩屑采集的间隔距离优选为3~5m；当所述油井为水平井时，岩屑采集的间隔距离优选为15~30m。在本发明中，所述岩屑的直径优
选为1~3cm，更优选为2cm。
18.在本发明中，采集后的岩屑优选的收集于无菌袋中；每个地下深度的岩屑优选的采用2个无菌袋分装；所述无菌袋优选的标有取样井名，取样时间和地层深度。在本发明中，所述采集后的岩屑的保存和运输温度优选为-10~0℃，这一温度范围可以抑制微生物生长，避免杂质微生物影响结果。在本发明具体实施过程中，所述无菌袋放入冷却器冰袋中保持其生物稳定性，将收集到的钻井岩屑运送到实验室。在本发明中，所述岩屑优选的通过震动筛采集。采集岩屑过程中不会导致钻机停机，从而允许在任何阶段对生产井中收集井岩屑。这一采集方式的优势在于可以安全无破坏的对样品数据进行记录，对整个作业过程无干扰，污染程度小于10%。
19.采集不同地下深度的油井的岩屑后，本发明分别提取所述岩屑的细菌基因组dna。在分别提取所述岩屑的细菌基因组dna前，优选的还包括对所述岩屑进行预处理；所述预处理优选的包括筛选出直径为1~3cm的岩屑、对筛选后的岩屑进行清洗和研磨；所述研磨后的样品粒径没有特殊要求，研磨成粉末状即可；所述清洗的作用是洗掉干扰物和表面杂质细菌，去除混杂物、泥浆、表面化学物质和可循环利用材料；所述研磨的目的的是释放岩石细菌，使得岩石表面和岩石中的细菌被发现。
20.本发明对提取所述岩屑的细菌基因组dna的方法没有特殊限制，采用本领域的常规方法即可。
21.在本发明中，每个深度的岩屑提取到的细菌基因组dna的数量≥10000个，优选为10000~20000个。当每个深度的岩屑提取到的细菌基因组dna的数量《10000时，则不能将此组测序数据进行下游分析，可再次取样并进行提取。
22.提取所述岩屑的细菌基因组dna后，本发明以所述细菌基因组dna为模板，采用针对16srrna基因的引物分别进行扩增，得到扩增产物，分别对所述扩增产物进行测序。在本发明中，所述引物优选为针对16srrna基因的v4和v5高变区的引物。本发明对所述扩增的方法没有特殊限制，采用本领域的常规扩展方法即可。
23.本发明得到扩增产物后，优选的还包括对所述扩增产物进行纯化，所述纯化的方法优选为用琼脂糖凝胶电泳纯化珠纯化。
24.在本发明，对每个深度的岩屑优选的进行一式两份的扩增和测序。
25.得到扩增产物的测序结果后，本发明分析所述测序结果确定不同地下深度的细菌种类和细菌丰度，利用不同地下深度的细菌种类和细菌丰度的结果构建分层基线。在本发明中，所述分层基线为每个地层深度所包含的菌种类型以及其丰度，所述分层基线以柱形图表示，纵坐标表示地层深度，横坐标的每个柱形代表此地层内所有的细菌丰度之和，用不同的颜色或形状表示，柱形的长度表示菌种的丰度。
26.在本发明中，所述测序结果预先经过质量控制，所述质量控制的方法优选的包括以下步骤：s1.以不含岩屑的空白对照的细菌基因组dna作为干扰dna序列，分别按照式i所示公式计算不同地下深度的岩屑的测序结果的可信任地下信号分数；s2.以所述可信任地下信号分数作为纵坐标，以不同地下深度的岩屑的dna序列的
数量为横坐标，构建可信任地下信号分数与生物量的关系图，设置可信任阈值为80%，阈值以上且dna序列数量适中的区域为置信度较高的区域；以横坐标的最大量为1计，所述dna序列数量适中的区域为dna序列数量在1/6~5/6的区域，该区域的dna序列为通过qc的dna序列，用于后续测序结果的分析，其余的dna序列为未通过qc的dna序列。
27.在本发明中，干扰dna序列百分数越低，可信任地下信号分数越高，可用于下游分析的生物量越多。
28.本发明具体实施过程中，根据80%的阈值与总生物量（每个深度的岩屑的dna序列数量）将图像分成四部分，其中可信任地下信号分数在阈值以下的部分不能用于后续测序分析。将阈值以上的图像根据生物量分为三部分，其中生物量适中的区域，可信任地下信号分数较高，且生物量较多，此部分为置信度较高的区域，可用于下游分析。
29.与生物量适中的区域相比，对生物量低的区域进行严格审查，确保其可信度高与实验污染有关，所述严格审查优选的包括对不含岩屑的空白对照进行进一步的污染溯源。
30.与生物量适中的区域相比，对生物量高的区域进行进一步的质量控制检查，这是由于生物量高的区域可能是因为自采集以来，一些微生物已经潜在地下并在样品中生长繁衍。微生物的强烈生长可能会抑制岩屑中的dna序列变异和多样性。
31.对测序结果进行质量控制后，本发明对通过qc的测序数据进行分析，确定不同地下深度的细菌种类和细菌丰度。对通过qc的测序数据进行分析的方法优选的包括：通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；在给定的相似度下将tags聚成otu，然后通过otu与数据库比对，对otu进行物种注释；基于otu和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
32.在本发明中，对测序结果进行质量控制后，优选的还包括构建地层测井图。
33.在本发明中，所述地层测井图根据深度tvd构建；所述地层测井图的构建方法优选的包括：以tvd为纵坐标，以上述方案中提取的细菌基因组dna的数量为横坐标的测井曲线；以tvd为纵坐标，以可信任地下信号分数为横坐标的测井曲线；以tvd为纵坐标，以通过qc和未通过qc的dna序列数量为横坐标的测井曲线；通过qc与未通过qc的dna序列以不同颜色或形状区分；以tvd为纵坐标，以通过qc和未通过qc的dna序列的菌种数量为横坐标的测井曲线；不同的菌种以不同颜色或形状区分。
34.本发明通过构建分层基线和地层测井图，有助于了解油藏的地下特征，更加清晰的描述地层的特征，复杂的结构变化，为基于时间的地层贡献分析提供良好的基础。
35.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
36.实施例1进行采样工作。采样工作包括：1、直井每隔3m收集岩屑。
37.2、将样品收集到无菌袋中，袋子标有相应的地层深度。
38.3、将无菌袋立即放入冷却器中，将收集到的钻井岩屑运送到实验室。
39.4、对实验室中的岩屑进行尺寸分类，保留其中直径1~3cm的岩屑的岩屑，对岩屑进
行清洗和研磨，研磨成细粉后收集入锥形瓶中。在离心管中加入10~50g岩屑细粉，在离心管中加入100μl的清洗缓冲液，混合后得到均匀的混合液。用过滤膜过滤来浓缩菌液。利用离心机离心混合液，将转速设置为12000rpm/min转，离心时长为15min，离心后的细菌沉淀物冷藏保存直到提取。
40.清洗缓冲液：10g na2hpo4配1gkh2hpo4、50gnacl 和1.5g kcl，在na2hpo4中加入kh2hpo4、nacl、kcl配成溶液，在溶液中加入百分之一的溶液体积的十二烷基硫酸钠混合均匀得到缓冲液，调节缓冲液的ph为7.5，然后再加入缓冲液10倍体积的蒸馏水混合均匀。
41.5、提取细菌基因组dna，提取步骤为：在离心管中加入10~50μl样品，然后在离心管中加入100μl的清洗缓冲液，混合后得到均匀的混合液；利用细胞破碎仪将混合液破碎40~60s；利用离心机离心混合液，将转速设置为12000~16000转/min，离心时长为10~15min；离心后的混合液去除掉上清液得到了固相；在固相中加入200~300μl的萃取清洗液，之后再加入30~50μl的溶菌酶并均匀混合，在37℃的温度下水浴5~10h；萃取清洗液：将氯仿和异戊醇按体积比为24：1混合在一起；加入2mol/l的氯化钠溶使dna的溶解度达到最大，此时过滤已经将杂质滤去。调节溶液到0.14mol/l析出dna，再过滤，滤出dna。
42.6、进行dna的提取纯化，具体步骤如下：1）把样品装到96孔的试管盒中，这样一次就可以对多个样品进行高通量测试。
43.2）复制单个样品，用物理和化学结合的方法打破细胞壁，将微生物内部的dna转化为中性溶液。
44.3）细胞裂解后进行提纯。
45.7、pcr扩增：所述pcr扩增的体系包括：细菌基因组dna、5prime mastermix和“通用”16srrna靶向引物515f-y和926r。所述pcr扩增的程度优选为：93℃预变性5min；变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，25个循环。在第8个循环的第二次反应中，通过与扩增子的接头序列退火，将特有的正向和反向指数添加到每个样品的扩增子中，以添加测序条形码用于样品区分。此过程在严格的qa和qc程序下进行。
46.8、高通量测序：用illumina测序机进行高通量测序。由于之前的提纯，每个样本的dna片段的末尾都有一个特殊的dna序列，这样所有的样本就都被连接在一起，装到机器中。测序期间，dna链结合到封闭细胞的表面，并像pcr那样复制支架。然而在dna链中，每个dna序列都是荧光标记，测序仪识别到的新核苷酸添加到2500万个dna序列中每一个适合流动的结尾。测序结束后，dna序列数据可转换为可读取的文本，原始序列数据存储在生物群的数据库中并与原始样本相关联元数据，例如井名和数据。
47.9、对测序结果进行质量控制，步骤为：1）以不含岩屑的空白对照的细菌基因组dna作为干扰dna序列，分别按照式i所示公式计算不同地下深度的岩屑的测序结果的可信任地下信号分数；
2）以所述可信任地下信号分数作为纵坐标，以不同地下深度的岩屑的dna序列的数量为横坐标，构建可信任地下信号分数与生物量的关系图，设置可信任阈值为80%，阈值以上且dna序列数量适中的区域为置信度较高的区域；以横坐标的最大量为1计，所述dna序列数量适中的区域为dna序列数量在1/6~5/6的区域，该区域的dna序列为通过qc的dna序列，用于后续测序结果的分析，其余的dna序列为未通过qc的dna序列。
48.10、针对质量控制后的测序结果，通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；在给定的相似度下将tags聚成otu，然后通过otu与数据库比对，对otu进行物种注释；基于otu和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析，确定每个地层深度的岩屑所包含的菌种类型以及其丰度，构建分层基线，分层基线为每个地层深度所包含的菌种类型以及其丰度，在此制作成柱形图表示。纵坐标表示地层深度，横坐标每个柱形代表此地层内所有的细菌丰度之和，用不同的颜色或形状表示，柱形的长度表示其丰度。
49.实施例2在实施例1的基础上根据深度tvd构建地层测井图，构建方法为：以tvd为纵坐标，以上述方案中提取的细菌基因组dna的数量为横坐标的测井曲线；以tvd为纵坐标，以可信任地下信号分数为横坐标的测井曲线；以tvd为纵坐标，以通过qc和未通过qc的dna序列数量为横坐标的测井曲线；通过qc与未通过qc的dna序列以不同颜色或形状区分；以tvd为纵坐标，以通过qc和未通过qc的dna序列的菌种数量为横坐标的测井曲线；不同的菌种以不同颜色或形状区分。
50.实施例3水平井每隔15m收集岩屑，其余同实施例1。
51.实施例4水平井每隔30m收集岩屑，其余同实施例1。
52.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。