一种非酿酒酵母与乳酸菌顺序发酵的沙棘生物降酸方法

1.本发明涉及生物酿造技术领域，特别是涉及一种非酿酒酵母与乳酸菌顺序发酵的沙棘生物降酸方法。


背景技术：

2.沙棘产品中糖、酸、酚类化合物和挥发性化合物是影响其感官品质的主要因素。沙棘中的主要有机酸是苹果酸、l-抗坏血酸和奎宁酸，其中最丰富的酸是苹果酸。酸在一定的浓度范围内令人愉悦，但沙棘中过高的酸尤其是苹果酸会使沙棘口感过于尖刺、酸涩，很难被消费者接受。
3.物理降酸、化学降酸、生物降酸是发酵过程中的三种主要降酸方法。物理降酸所需消耗能源较多，产品损耗较大；化学降酸利用碳酸钙、碳酸钾等化学试剂降酸，虽能降低部分苹果酸，但对沙棘品质影响较大；传统生物降酸中也需要先通过物理降酸或化学降酸方法处理沙棘后才能进行生物降酸，该方法既影响感官品质，发酵时间也有所延长。
4.苹果酸-乳酸发酵是植物饮品降酸的一种有效方法，但大多乳酸菌的启动适用ph值在3.2-3.5，沙棘果浆的ph值一般为2.7-2.9，缓冲能力很高。乳酸菌用于沙棘果浆降酸难以直接启动，需要通过化学方法将样品ph调整至3.2以上再接种乳酸菌进行生物降酸。此外，苹果酸-乳酸发酵应用于葡萄或其他浆果汁降酸，由于样品中苹果酸的含量一般低于5g/l，降酸效果显著；然而沙棘果浆苹果酸的含量一般是其他浆果植物的3-4倍，单纯的采用苹果酸-乳酸发酵方法生物降酸效果甚微。
5.酿酒酵母的生长速率明显受到环境变化的影响，其中温度和ph值是主要的两个方面。酿酒酵母最适生长温度为28-30℃，最佳生长ph值约在ph 4-6之间。且ph值过高或过低均会影响酵母菌的生长，当ph值低于3时，酵母菌的停滞期会延长；当ph值在2.5时，酵母菌生长完全被抑制；当ph值为8时酵母菌生长速度显著降低，ph值为9时生长完全停止。由于沙棘的高酸特性，传统酿酒酵母接种后很难启动沙棘果浆发酵。
6.非酿酒酵母粟酒裂殖酵母因其特殊适应性可以将苹果酸代谢成乙醇和二氧化碳，可用于饮品的生物降酸。非酿酒酵母属能够在高酸的沙棘果浆中启动发酵，以沙棘果浆中苹果酸为碳源，有效降低酒精发酵过程中样品的苹果酸浓度。但是因粟酒裂殖酵母在果酒发酵过程中往往产生不良风味，且酒精发酵能力较弱，导致其目前尚未广泛应用于植物酒精饮品的发酵中。
7.因此，提出一种既能有效降低沙棘果浆酸度，又能改善沙棘产品品质的新型生物降酸方法非常有必要。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种非酿酒酵母与乳酸菌顺序发酵的沙棘生物降酸方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法能够提高苹果酸的降解率，增加沙棘产品风味物质种类，提升口感，对于高酸难发酵的产品发酵提供了新的方法及思路。
9.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
10.本发明提供一种非酿酒酵母与乳酸菌顺序发酵的沙棘生物降酸方法，包括以下步骤：
11.(1)原料预处理：取沙棘果实，将其破碎压榨，得沙棘原浆，再向沙棘原浆中加入偏重亚硫酸钾，室温静置后，得到沙棘果浆；
12.(2)接种非酿酒酵母：将非酿酒酵母接种到沙棘果浆中，25-28℃发酵4-6d，结束发酵后得第一发酵液；
13.(3)接种乳酸菌：向第一发酵液接种乳酸菌，20-24℃发酵9-12d,结束发酵后灭菌，得到低酸度沙棘发酵产品。
14.进一步地，在步骤(2)中，所述非酿酒酵母接种到沙棘果浆之前，先进行杀菌操作，具体为70-90℃温度，15-30min。
15.进一步地，步骤(2)中，所述非酿酒酵母在接种前还包括活化步骤，所述活化包括将非酿酒酵母接种于ypd液体培养基中28℃培养48h获得菌液。
16.进一步地，所述非酿酒酵母菌液接种量为所述沙棘果浆体积的2-5％。
17.进一步地，所述非酿酒酵母在菌液中的数目为107cfu/ml。
18.进一步地，在步骤(3)中，向第一发酵液接种乳酸菌之前还包括活化乳酸菌步骤，所述活化包括将乳酸菌接种在mrs液体培养基中，37℃活化培养18-24h。
19.进一步地，步骤(3)中，所述乳酸菌接种量为第一发酵液体积的0.5％。
20.进一步地，在步骤(2)中，所述非酿酒酵母包括粟酒裂殖酵母。
21.进一步地，在步骤(1)中，所述偏重亚硫酸钠在所述沙棘原浆中的浓度为60-62mg/l，所述静置时间为7-8h。
22.本发明还提供一种根据任一项上述的沙棘生物降酸方法制备得到的低酸度沙棘产品。
23.本发明公开了以下技术效果：
24.本发明首次将非酿酒酵母与乳酸菌顺序接种发酵运用于沙棘果浆降酸中，非酿酒酵母在苹果酸通透基因酶、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶的作用下将苹果酸转变为乙醇及丙酮酸类物质，增强降酸效果，从根源上解决了低ph条件下无法直接进行沙棘果浆生物降酸发酵的问题，然后接种乳酸菌启动苹果酸-乳酸发酵，继续降低沙棘的苹果酸含量，同时避免了粟酒裂殖酵母单独使用产生不良风味的问题，并增加了产品风味化合物种类，有效改善其发酵产品适口性，提升口感，由此可见，非酿酒酵母-乳酸菌顺序发酵的发酵方式对沙棘产品酸味的降低、口感改善和风味物质的产生提供了积极地作用。
25.本发明还通过非酿酒酵母-乳酸菌发酵方式，减少了沙棘的前处理，降低了前期成本，极大保留了沙棘原有品质。本发明为高酸难发酵的产品发酵提供了新的方法及思路，解决了高酸产品的收益低难以开发的问题，对沙棘产品的研发具有积极贡献。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发
明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.1.材料：中国沙棘(hippophae rhamnoides l.ssp.sinensis)。
32.2.辅料：偏重亚硫酸钠、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe,s.pombe)，甘肃农业大学葡萄酒微生物实验室保藏、乳酸菌(lactoenos sb3)，laffort公司，法国、ypd液体培养基、mrs液体培养基。
33.实施例1
34.一种非酿酒酵母与乳酸菌顺序发酵的沙棘生物降酸方法，包括以下步骤：
35.a、原料选择：挑选成熟的沙棘果实；
36.b、原料的预处理：沙棘果实分选、除梗、破碎压榨后，得到沙棘原浆，经检测，该沙棘原浆含糖量为68g/l，酸度为30g/l，ph 2.9；并加入偏重亚硫酸钠，添加至在沙棘原浆的终浓度是60mg/l，在室温下静置7h，得到沙棘果浆；
37.c、巴氏杀菌：沙棘果浆在70℃温度下巴氏杀菌30min；
38.d、非酿酒酵母活化:将粟酒裂殖酵母菌株接种于ypd液体培养基中28℃下培养48h，再以根据试验要求的接种量接入沙棘果浆中进行接种试验(各菌液细胞数达到107cfu/ml)；
39.e.非酿酒酵母接菌量：将ypd液体培养基中活化好的粟酒裂殖酵母菌液以体积百分比2％的接种量接入巴氏杀菌后的沙棘果浆中，在25℃条件下发酵6天；
40.f.乳酸菌活化：将乳酸菌在无菌条件下接种在mrs液体培养基中，37℃活化培养18h，备用；
41.g.乳酸菌接菌量：将在mrs液体培养基中活化好的乳酸菌以体积百分比0.5％的乳酸菌接种量接入发酵6天后的沙棘果浆中，20℃条件下发酵12天，发酵结束后得到沙棘发酵液；
42.h.灭菌：调控温度60℃，灭菌30min，即得沙棘发酵产品。
43.实施例2
44.一种非酿酒酵母与乳酸菌顺序发酵的沙棘生物降酸方法，包括以下步骤：
45.a、原料选择：挑选成熟的沙棘果实；
46.b、原料的预处理：沙棘果实分选、除梗、破碎压榨后，得到沙棘原浆，经检测，该沙棘原浆含糖量69g/l，酸度为33g/l，ph 2.8；并加入偏重亚硫酸钠，添加至在沙棘原浆的终浓度是61mg/l，在室温下静置7.5h，得到沙棘果浆；
47.c、巴氏杀菌：沙棘果浆在80℃温度下巴氏杀菌20min；
48.d、非酿酒酵母活化:将粟酒裂殖酵母菌株接种于ypd液体培养基中28℃下培养48h，再以根据试验要求的接种量接入沙棘果浆中进行接种试验(各菌液细胞数达到107cfu/ml)；
49.e.非酿酒酵母接菌量：将ypd液体培养基中活化好的粟酒裂殖酵母菌液以体积百分比3％的接种量接入巴氏杀菌后的沙棘果浆中，在26℃条件下发酵5天；
50.f.乳酸菌活化：将乳酸菌在无菌条件下接种在mrs液体培养基中，37℃活化培养20h，备用；
51.g.乳酸菌接菌量：将在mrs液体培养基中活化好的乳酸菌以体积百分比0.5％的乳酸菌接种量接入发酵5天后的沙棘果浆中，21℃条件下发酵11天，发酵结束后得到沙棘发酵液；
52.h.灭菌：调控温度62℃，灭菌25min，即得沙棘发酵产品。
53.实施例3
54.一种非酿酒酵母与乳酸菌顺序发酵的沙棘生物降酸方法，包括以下步骤：
55.a、原料选择：挑选成熟的沙棘果实；
56.b、原料的预处理：沙棘果实分选、除梗、破碎压榨后，得到沙棘原浆，经检测，该沙棘原浆含糖量70g/l，酸度为31g/l，ph 2.8；并加入偏重亚硫酸钠，添加至在沙棘原浆的终浓度是61mg/l，在室温下静置8h，得到沙棘果浆；
57.c、巴氏杀菌：沙棘果浆在75℃温度下巴氏杀菌25min；
58.d、非酿酒酵母活化:将粟酒裂殖酵母菌株接种于ypd液体培养基中28℃下培养48h，再以根据试验要求的接种量接入沙棘果浆中进行接种试验(各菌液细胞数达到107cfu/ml)；
59.e.非酿酒酵母接菌量：将ypd液体培养基中活化好的粟酒裂殖酵母菌液以体积百分比4％的接种量接入巴氏杀菌后的沙棘果浆中，在27℃条件下发酵4天；
60.f.乳酸菌活化：将乳酸菌在无菌条件接种在mrs液体培养基中，37℃活化培养22h，备用；
61.g.乳酸菌接菌量：将在mrs液体培养基中活化好的乳酸菌以体积百分比为0.5％的乳酸菌接种量接入发酵4天后的沙棘果浆中，22℃条件下发酵10天，发酵结束后得到沙棘发酵液；
62.h.灭菌：调控温度64℃，灭菌20min，即得沙棘发酵产品。
63.实施例4
64.一种非酿酒酵母与乳酸菌顺序发酵的沙棘生物降酸方法，包括以下步骤：
65.a、原料选择：挑选成熟的沙棘果实；
66.b、原料的预处理：沙棘果实分选、除梗、破碎压榨后，得到沙棘果浆，经检测，该沙棘原浆含糖量70g/l，酸度为35g/l，ph 2.7；并加入偏重亚硫酸钠，添加至在沙棘原浆的终浓度是62mg/l，在室温下静置8h，得到沙棘果浆；
67.c、巴氏杀菌：沙棘果浆在90℃温度下巴氏杀菌15min；
68.d、非酿酒酵母活化:将粟酒裂殖酵母菌株接种于ypd液体培养基中28℃下培养48h，再以根据试验要求的接种量接入沙棘果浆中进行接种试验(各菌液细胞数达到107cfu/ml)；
69.e.非酿酒酵母接菌量：将ypd液体培养基中活化好的粟酒裂殖酵母菌液以体积百分比5％的接种量接入巴氏杀菌后的沙棘果浆中，在28℃条件下发酵4天；
70.f.乳酸菌活化：将乳酸菌在无菌条件下接种在mrs液体培养基中，37℃活化培养24h，备用；
71.g.乳酸菌接菌量：将在mrs液体培养基中活化好的乳酸菌以体积百分比0.5％的乳酸菌接种量接入发酵4天后的沙棘果浆中，24℃条件下发酵9天，发酵结束后得到沙棘发酵液；
72.h.灭菌：调控温度65℃，灭菌10min，即得沙棘发酵产品。
73.对比例1
74.与实施例1的区别在于，不接种乳酸菌，只接种非酿酒酵母菌。
75.一种非酿酒酵母单菌发酵的沙棘生物降酸方法，包括以下步骤：
76.a、原料选择：挑选成熟的沙棘果实；
77.b、原料的预处理：沙棘果实分选、除梗、破碎压榨后，得到沙棘原浆，经检测，该沙棘原浆含糖量为68g/l，酸度为30g/l，ph 2.9；并加入偏重亚硫酸钠，添加至在沙棘原浆的终浓度是60mg/l，在室温下静置7h，得到沙棘果浆；
78.c、巴氏杀菌：沙棘果浆在70℃温度下巴氏杀菌30min；
79.d、非酿酒酵母活化:将粟酒裂殖酵母菌株接种于ypd液体培养基中28℃下培养48h，再以根据试验要求的接种量接入沙棘果浆中进行接种试验(各菌液细胞数达到107cfu/ml)；
80.e.非酿酒酵母接菌量：将ypd液体培养基中活化好的粟酒裂殖酵母菌液以体积百分比2％的接种量接入巴氏杀菌后的沙棘果浆中，在25℃条件下发酵18天；
81.f.灭菌：调控温度60℃，灭菌30min，即得沙棘发酵产品。
82.对比例2
83.与实施例1的区别在于，不接种非酿酒酵母菌，只接种乳酸菌。
84.一种乳酸菌单菌发酵的沙棘生物降酸方法，包括以下步骤：
85.a、原料选择：挑选成熟的沙棘果实；
86.b、原料的预处理：沙棘果实分选、除梗、破碎压榨后，得到沙棘原浆，经检测，该沙棘原浆含糖量为68g/l，酸度为30g/l，ph 2.9；2g/lcaco3调节ph至3.2，并加入偏重亚硫酸钠，添加至在沙棘原浆的终浓度是60mg/l，在室温下静置7h，得到沙棘果浆；
87.c、巴氏杀菌：沙棘果浆在70℃温度下巴氏杀菌30min；
88.d.乳酸菌活化：将乳酸菌在无菌条件下接种在mrs液体培养基中，37℃活化培养18h，备用；
89.e.乳酸菌接菌量：将在mrs液体培养基中活化好的乳酸菌以体积百分比0.5％的乳酸菌接种量接入ph＝3.2的沙棘果浆中，20℃条件下发酵18天，发酵结束后得到沙棘发酵液；
2021食品中总酸的测定)，计算其苹果酸降解率(陆敏等.2012)(如表3所示)。
107.表3不同发酵条件的沙棘发酵产品苹果酸降解结果
108.样品总酸含量(g/l)苹果酸降解率(％)实施例113.7660.16实施例211.8375.16实施例310.7683.16实施例49.1791.36对比例114.3654.45对比例214.6840.05对比例314.1310.67
109.试验例3
110.对实施例1-4以及对比例1-3制备的沙棘发酵产品进行gc-ms分析，结果如表4所示：
111.表4不同发酵条件的沙棘发酵产品gc-ms分析结果
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以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。