一株高效乳化原油铜绿假单胞菌XJ-1及其应用的制作方法

本发明属于微生物生物技术和环境生物，具体涉及一株高效乳化原油铜绿假单胞菌xj-1及其在微生物采油中的应用。

背景技术：

1、微生物强化采油(micro-bial enhanced oil recovery,meor)是近年来在国内外发展迅速的一项提高原油采收率技术，是利用微生物在油藏中的生长代谢活动或其代谢产物来提高原油采收率的综合性技术。该技术驱油潜力大、综合成本低、采出液不需特殊处理，是一项经济有效、绿色环保的采油技术。实验室内研究和现场实验研究证实了利用微生物在油藏原位的代谢产生表面活性剂提高原油采收率是一项切实可行的微生物采油技术。其基本原理是：①细菌产生的表面活性物质、有机溶剂、有机酸、生物聚合物或生物气等，在油藏中作用于残余油可改变原油的流动性；②利用微生物的代谢过程中，直接改变原油性质，如降解原油部分组分，引起原油性质变化，使原油易于流动，以提高残余油的洗油效率，从而起到提高采收率的作用③细菌代谢产生的生物聚合物，能起到调堵地层大孔道的作用，改善地层渗流规律，扩大水驱波及体积。与其它三次采油技术相比，meor具有高效、经济、无二次污染不损伤油层等优点，是最具潜力的一项提高原油采收率的技术。

2、期刊adv mat res，2010，93(94)：623-626报道了从城市下水道污泥中，筛选分离出一株可在厌氧条件下产鼠李糖脂表面活性剂的假单胞菌anbiosurf-1，期刊rscadv，2015，5(45):36044-36050报道了从新疆油田油藏采出液中筛选到了利用甘油能够厌氧合成鼠李糖脂的铜绿假单胞菌sg，但是菌株sg在厌氧条件下的鼠李糖脂产量仅为228mg/l。

3、meor技术的核心是微生物菌种，驱油用微生物菌种的优良与否直接关系到微生物采油技术的效果好坏及成本高低。因此，获得优质、高效的驱油菌种对于微生物采油技术的应用十分必要。目前已获得的厌氧产表面活性剂微生物菌种资源有限，并且有些厌氧产表面活性剂菌种并非从油藏环境中分离得到，其对于油藏环境的适应性还有待进一步评价。微生物菌种在厌氧条件下的表面活性剂产量较低成为油藏原位产表面活性剂提高采收率技术的瓶颈。因此，筛选油藏本源的厌氧产表面活性剂的菌种资源，并提高其在厌氧条件下的表面活性剂产量，对于不依赖于空气注入的厌氧产表面活性剂提高原油采收率技术的研发和应用具有重要意义。

技术实现思路

1、为克服以上技术问题，本发明提供了一种高效乳化原油铜绿假单胞菌xj-1菌株，该菌株能够利用廉价营养液产生鼠李糖脂，显著降低原油的粘度，对于油藏原位产表面活性剂提高原油采收率的技术具有重要的理论和应用价值。

2、一方面，本发明提供一种菌株，该菌株的分类命名为铜绿假单胞菌xj-1；分类命名的拉丁文名称为pseudomonas aeruginosa xj-1，已于2021年8月23日，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmcc no.23170，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

3、分类体系：变形菌门，γ-变形菌纲，假单胞菌目，假单胞菌科，假单胞菌属，铜绿假单胞菌xj-1变形菌门，γ-变形菌纲，假单胞菌目，假单胞菌科，假单胞菌属，铜绿假单胞菌xj-1(bacteria；proteobacteria；gammaproteobacteria；pseudomonadales；pseudomonadaceae；pseudomonas；pseudomonas aeruginosa group；pseudomonasaeruginosa；pseudomonas aeruginosa xj-1bacteria；proteobacteria；gammaproteobacteria；pseudomonadales；pseudomonadaceae；pseudomonas；pseudomonasaeruginosa group；pseudomonas aeruginosa；pseudomonas aeruginosa xj-1)。

4、另一方面，本发明还提供了铜绿假单胞菌xj-1菌株的分离方法。

5、优选地，所述分离方法中的采样环境为：由石油区域采集油水样中分离得到，并以植物油为唯一碳源，在37℃-42℃筛选获得。

6、优选地，所述石油区域为陆梁油田。

7、优选地，所述分离方法中的培养基为无机盐植物油培养基和/或lb培养基。

8、优选地，所述无机盐植物油培养基包含植物油、na2hpo4、kh2po4、nano3、feso4、mgso4、cacl2、酵母粉中的任意一种或多种。

9、优选地，所述无机盐植物油培养基由植物油、na2hpo4、kh2po4、nano3、feso4、mgso4、cacl2、酵母粉和蒸馏水组成。

10、优选地，按照重量百分数计，所述无机盐植物油培养基组分为：植物油3％-8％，na2hpo40.06％-0.08％，kh2po40.01％-0.03％，nano30.1％-0.3％，feso40.001％-0.003％，mgso40.02％-0.05％，cacl20.001％-0.003％，酵母粉0.001％-0.003％，其余为蒸馏水。

11、优选地，所述无机盐植物油培养基组分为：大豆油50g，na2hpo40.6g，kh2po40.2g，nano32g，feso40.01g，mgso40.3g，cacl20.01g，酵母粉0.01g，蒸馏水1l。

12、优选地，所述分离方法包括以下步骤：

13、(1)将油水样接种至无机盐基础培养基中，进行培养；

14、(2)将菌液涂布在lb平板上培养，得单菌落；

15、(3)将单菌落落接种到lb培养基中，培养到对数期，得种子液a；

16、(4)将种子液a接入发酵培养基中培养，得种子液b；

17、(5)将种子液b接入无机盐植物油培养基，进行培养。

18、(6)步骤(2)-(5)重复3-4次。

19、优选地，步骤(4)中，所述发酵培养基组成为：糖蜜，玉米浆，nano3，地层水。

20、优选地，按照重量百分数计，所述发酵培养基组分为：糖蜜2％-5％，玉米浆0.1％-0.5％，nano30.1％-0.5％，其余为地层水。

21、优选地，所述发酵培养基组分为：糖蜜35g，玉米浆5g，nano32g，地层水1l。

22、本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌株在生产鼠李糖脂中的应用。

23、本发明还提供了一种生产鼠李糖脂的产品，所述的产品包含所述的铜绿假单胞菌株xj-1；所述产品包含完整或不完整形式的微生物细胞、微生物发酵液、微生物冻干粉和固定化细胞中的任一种或多种。

24、优选地，所述微生物发酵液的制备方法为：将xj-1菌株在lb斜面上划线培养，用无菌水将菌体洗下，将对数期的菌液作为种子液接入发酵培养基中，将所得发酵液作为种子液接入发酵培养基中进行培养，得xj-1菌株发酵液。

25、优选地，所述微生物冻干粉的制备方法为：将发酵液浓缩后加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥机冻干后，得冻干粉。

26、优选地，所述固定化细胞的制备方法为：将所述xj-1菌株固定在水不溶性载体上，所述固定化的方法包括吸附法和包埋法；所述吸附法的载体包括硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维中的任一种或多种；所述包埋法包括凝胶包埋法和半透膜包埋法。

27、本发明还提供了一种生产鼠李糖脂的方法，所述方法为使用所述的铜绿假单胞菌株xj-1以营养培养基、无机盐培养基、废蜜糖和地沟油中的任一种或多种为碳源发酵生产鼠李糖脂。

28、本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌株在石油开采和加工中的应用；

29、本发明还提供了一种生产石油产品的制剂，所述的制剂包含所述的铜绿假单胞菌株xj-1；所述制剂包含完整或不完整形式的微生物细胞、微生物发酵液、微生物冻干粉和固定化细胞中的任一种或多种；所述的石油产品为石油燃料、石油溶剂与化工原料、润滑剂、石蜡、石油沥青或石油焦。

30、本发明还提供了一种石油开采的方法，所述方法为将所述的铜绿假单胞菌株xj-1或所述生产石油产品的制剂注入油藏进行发酵培养，或将所述的铜绿假单胞菌株xj-1或所述生产石油产品的制剂的发酵培养产物注入油藏。

31、本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌株在原油降粘中的应用。

32、本发明还提供了一种原油降粘制剂，所述的制剂包含所述的铜绿假单胞菌株xj-1；所述制剂包含完整或不完整形式的微生物细胞、微生物发酵液、微生物冻干粉和固定化细胞中的任一种或多种。

33、本发明还提供了一种原油降粘的方法，所述方法为将所述的铜绿假单胞菌株xj-1或所述原油降粘制剂注入原油中发酵培养，或将所述的铜绿假单胞菌株xj-1或所述降粘制剂的发酵培养产物注入原油。

34、本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌株在原油乳化中的应用。

35、本发明还提供了一种原油的乳化制剂，所述的制剂包含铜绿假单胞菌株xj-1；所述制剂包含完整或不完整形式的微生物细胞、微生物发酵液、微生物冻干粉和固定化细胞中的任一种或多种。

36、本发明还提供了一种原油乳化的方法，所述方法为将所述的铜绿假单胞菌株xj-1或所述原油的乳化制剂注入原油中发酵培养，或将所述的铜绿假单胞菌株xj-1或所述原油的乳化制剂的发酵培养产物注入原油。

37、本发明xj-1菌株的特性：

38、1.形态特征

39、xj-1菌株在lb平板上培养一天的菌落特征：菌落形态为浅褐色小菌落，表面凹状不透明，边缘整齐，无芽孢，如果是在液体培养基中则呈浑浊状生长产生浅绿色水溶性色素。

40、细胞形态特征：菌体呈短杆状，菌体的一端有单鞭毛，运动活泼，菌体大小1.5-5.0μm(长)×0.5-1.0μm(宽)，大多数菌体呈分散状，成对或短链状排列；生长温度28-42℃，最适温度为37℃。

41、2.生理化特性

42、xj-1可以在营养培养基，如lb、营养琼脂中生长，也可以在添加植物油、甘油、葡萄糖、十六烷的无机盐培养基中生长，也可以利用废糖蜜或地沟油为碳源生长；

43、该菌具有很高的利用廉价营养(如废糖蜜或地沟油)产鼠李糖脂能力。xj-1菌株降低表面张力及其稳定性良好，并且不会产生粘稠状物体，便于注入油藏。

44、将菌株xj-1的16s rdna的pcr扩增产物进行测序，铜绿假单胞菌xj-1的16s rdna基因序列与铜绿假单胞菌irmd和铜绿假单胞菌cgr的16s rdna序列相似性为99％。参照《bergey’s mannual ofsystematic bacteriology》，根据其形态特征和生理生化特性，以及根据其16s rdna基因序列在genbank中的搜索结果，鉴定其属于铜绿假单胞菌属(pseudomonas aeruginosa)，命名为铜绿假单胞菌xj-1。

45、与现有技术比，本发明的技术优势在于：

46、(1)本发明提供的一种铜绿假单胞菌xj-1菌株具有很高的利用廉价营养产鼠李糖的能力，利用废蜜糖或地沟油为碳源能产生鼠李糖脂的量为27g/l。所述菌株既可以在营养培养基，如lb、营养琼脂中生长，也可以在添加植物油、甘油、葡萄糖、十六烷的无机盐培养基中生长，还可以利用废糖蜜或地沟油为碳源生长，对于油藏开采有很好的应用价值。

47、(2)本发明提供的一种铜绿假单胞菌xj-1菌株，接菌后的发酵培养基的表面张力由接种前的62mn/m降低至32mn/m，xj-1菌株具有很好的降低表面张力的能力及稳定性，并且不会产生粘稠状物体，便于注入油藏。

48、(3)本发明提供的一种铜绿假单胞菌xj-1菌株对不同性质的原油都有很好的乳化降黏性能。所述菌株对稠油乳化降粘率为71％；对稀油乳化降粘率为9.1％；对高凝油乳化降粘率为62％。原油的粘度降低，其流动性能增强，一方面降低了原油的油水流度比，对原油起到驱油的效果；另一方面能够使大量原油分散于水中，使得运输压大大降低，提高了经济效益。