广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原IgY以及纳米抗体复合抗体及其制剂的制作方法

广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体及其制剂
技术领域
1.本发明涉及生物药品技术领域，具体涉及广谱抗冠状病毒保守表位抗原 和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体及其制剂。


背景技术：

2.大量的研究和临床经验显示：一般的冠状病毒和新型冠状病毒(又称新 冠病毒或2019-ncov或sars-cov-2)都极易产生变异，且变异后的病毒传染 性增强；同时，冠状病毒和这次出现的新型冠状病毒还具有免疫逃逸功能。 这些都将使常规方法制成的抗体之疗效大打折扣。
3.世界卫生组织已宣布，新型冠状病毒肺炎疫情符合“大流行 病”(pandemic)的标准。既然是“大流行病”，就意味着这个疾病将在人间 长期存在，并且将会不断出现新的冠状病毒。总而言之，新型冠状病毒转变 成“大流行病”，就会象每年都会来袭的流行性感冒一样，伴随着病毒不断 变异而长期在人间传播。考虑到在过去的二十年中发生了三起冠状病毒 (sars、mers和新型冠状病毒)爆发，即使这场新冠疫情最后消失，也不可 避免地会在未来发生另一起新颖的冠状病毒传播和疫情爆发。鉴于流行性感 冒和冠状病毒都具有天生的快速变异能力，并且具有通过与大量人畜共患病 毒重新组合而形成新病毒的能力；因此，完全有必要研究一种既可针对目前 流行的新冠病毒，又可针对未来可能出现的其他冠状病毒之具广泛保护作用 的“泛冠状病毒抗体”。另外，冠状病毒和新冠病毒非同寻常的糖基化是造 成冠状病毒和新冠病毒免疫逃逸的根本原因；因此，必须研究一种针对冠状 病毒和新冠病毒糖基化抗原的抗体，把这种抗糖基化抗原的抗体与广谱抗冠 状病毒保守表位igy组合起来形成一种复合抗体，以期达到从根源上解决冠 状病毒和新冠病毒变异以及免疫逃逸问题的目的。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种广谱抗 冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体及其制剂， 针对冠状病毒和新冠病毒易变异以及具有免疫逃逸功能的特点，解决因冠状 病毒和新冠病毒变异以及免疫逃逸带来的难题。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种抗冠状病毒保守表位 igy抗体的制备方法，包括以下步骤：
6.s1、制备冠状病毒保守表位抗原：筛选出若干种保守性强的抗原表位， 制备单一或复合的保守性强的抗原表位的抗原成份，然后加入佐剂，制得单 一冠状病毒保守表位抗原或复合冠状病毒保守表位抗原；
7.s2、制备免疫蛋：取步骤s1中的单一或复合冠状病毒保守表位抗原对产 蛋禽类进行免疫，得到单一或复合抗冠状病毒保守表位抗原免疫蛋；
8.s3、提取抗体：从单一或复合抗冠状病毒保守表位抗原免疫蛋中提取单 一抗冠状病毒保守表位igy抗体或复合抗冠状病毒保守表位igy抗体。
9.进一步地，在抗冠状病毒保守表位igy抗体的制备方法中，优选在s1步 骤中，保守性强抗原表位的抗原成份包括以下一种或几种的组合:新型冠状病 毒rbd侧面的保守性区域抗原成份、新型冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域 抗原成份、s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位抗原成份、新型冠状病毒n 末端结构域抗原成份、新型冠状病毒的n蛋白抗原成份、新型冠状病毒m蛋 白抗原成份。
10.进一步地，在抗冠状病毒保守表位igy抗体的制备方法中，优选在s1步 骤中，单一冠状病毒保守表位抗原的制备，分别包括以下步骤：分别取新型 冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原成份、新型冠状病毒亚基七肽重复区hr 结构域抗原成份、s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位抗原成份、新型冠状 病毒n末端结构域抗原成份、新型冠状病毒的n蛋白抗原成份、新型冠状病 毒m蛋白抗原成份与福氏佐剂或辅助佐剂按(1-10):(1-10)进行混合，置 入高速匀浆器高速匀化，形成油包水乳液，即分别制得六种单一冠状病毒保 守表位抗原。
11.进一步地，在抗冠状病毒保守表位igy抗体的制备方法中，优选在s1步 骤中，复合冠状病毒保守表位抗原分为四种，四种复合冠状病毒保守表位抗 原的制备分别包括以下步骤：
12.取新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原成份、新型冠状病毒亚基七 肽重复区hr结构域抗原成份、s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位抗原成 份按(1-10):(1-10)：(1-10)的比例混合均匀，再与福氏佐剂或辅助佐剂 按(1-10):(1-10)的比例进行混合，置入高速匀浆器高速匀化，形成油包 水乳液，即制得第一种复合冠状病毒保守表位抗原；
13.或取新型冠状病毒n末端结构域抗原成份、新型冠状病毒的n蛋白抗原 成份、新型冠状病毒m蛋白抗原成份按(1-10):(1-10):(1-10)的比例 混合均匀，再与福氏佐剂或辅助佐剂按(1-10):(1-10)的比例进行混合， 置入高速匀浆器高速匀化，形成油包水乳液，即制得第二种复合冠状病毒保 守表位抗原；
14.或取新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原成份、新型冠状病毒亚基 七肽重复区hr结构域抗原成份、s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位抗原 成份、新型冠状病毒n末端结构域抗原成份、新型冠状病毒的n蛋白抗原成 份、新型冠状病毒m蛋白抗原成份按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10): (1-10):(1-10)的比例混合均匀，再与福氏佐剂或辅助佐剂按(1-10): (1-10)的比例进行混合，置入高速匀浆器高速匀化，形成油包水乳液，即 制得第三种复合冠状病毒保守表位抗原；
15.或取新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原成份、新型冠状病毒亚基 七肽重复区hr结构域抗原成份、s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位抗原 成份、新型冠状病毒n末端结构域抗原成份、新型冠状病毒的n蛋白抗原成 份、新型冠状病毒m蛋白抗原成份中任意一种与其他1-5种按任意比例混合， 再与福氏佐剂或辅助佐剂按(1-10):(1-10)的比例进行混合，置入高速匀 浆器高速匀化，形成油包水乳液，即制得第四种复合冠状病毒保守表位抗原。
16.进一步地，在抗冠状病毒保守表位igy抗体的制备方法中，优选在s3步 骤中，单一抗冠状病毒保守表位igy抗体包括：单一抗新型冠状病毒rbd侧 面的保守性区域抗原igy抗
体、单一抗新型冠状病毒亚基七肽重复区hr结构 域抗原igy抗体、单一抗s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位抗原igy抗 体、单一抗新型冠状病毒n末端结构域抗原igy抗体、单一抗新型冠状病毒 的n蛋白抗原igy抗体、单一抗新型冠状病毒m蛋白抗原igy抗体；
17.复合抗冠状病毒保守表位igy抗体包括：由第一种复合冠状病毒表位抗原制 得的第一种复合抗新型冠状病毒保守表位igy抗体、由第二种复合冠状病毒 表位抗原制得的第二种复合抗新型冠状病毒保守表位igy抗体、由第三种复 合冠状病毒表位抗原制得的第三种复合抗新型冠状病毒保守表位igy抗体、 由第四种复合冠状病毒表位抗原制得的第四种复合抗新型冠状病毒保守表位 igy抗体。
18.一种抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体的制备方法，包括以下步骤：
19.s1、制备冠状病毒糖基化抗原：合成具有天然糖基化水平的糖基化抗原 成份，在糖基化抗原成份中加入佐剂，制得冠状病毒糖基化抗原；
20.s2、制备免疫蛋：采用步骤s1中的冠状病毒糖基化抗原对产蛋禽类进行 免疫，得到抗冠状病毒糖基化抗原免疫蛋；
21.s3、提取抗体：从免疫蛋中提取抗冠状病毒糖基化igy抗体。
22.进一步地，在抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体的制备方法中，优选s1步 骤中，糖基化抗原成份包括糖基化位点的糖基化s蛋白：
23.至少包含有22个n-连接糖基化位点和至少2个o-连接糖基化位点的糖 基化s蛋白；
24.或包含22个n-连接糖基化位点中保守的18个糖基化位点的糖基化s蛋 白；
25.或采用单糖、核心五糖以及复杂型九糖为n型糖链，氨基半乳糖为o型 糖链，合成的包含t323、n331、n343糖基化位点在内的至少1种不同糖型的 s-rbd蛋白。
26.进一步地，在抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体的制备方法中，优选至少 包含有22个n-连接糖基化位点和至少2个o-连接糖基化位点的糖基化s蛋 白中的22个n-连接糖基化位点分别是：n17、n61、n74、n112、n149、n165、 n234、n282、n331、n343、n603、n616、n657、n709、n717、n801、n1074、 n1098、n1134、n1158、n1173、n1194；
27.或包含22个n-连接糖基化位点中保守的18个糖基化位点的糖基化s蛋 白中的18个n-连接糖基化位点分别是：n17、n61、n74、n112、n149、n165、 n234、n282、n331、n343、n603、n616、n657、n1074、n1134、n1158、n1173、n1194。
28.进一步地，在抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体的制备方法中，优选在s1 步骤中，制备冠状病毒糖基化抗原，分别包括以下步骤：
29.分别采用hek293细胞、cho细胞和sf21细胞、tn5细胞作为宿主细胞 系表达至少包含有22个n-连接糖基化位点和至少2个o-连接糖基化位点的 糖基化s蛋白、包含22个n-连接糖基化位点中保守的18个糖基化位点的糖 基化s蛋白，再分别与福氏佐剂或辅助佐剂按(1-10):(1-10)进行混合， 置入高速匀浆器高速匀化，形成油包水乳液，即分别制得两种不同的冠状病 毒糖基化s蛋白抗原；
30.或采用hek293细胞、cho细胞和sf21细胞、tn5细胞作为宿主细胞系 表达包含t323、n331、n343糖基化位点在内的1种以上不同糖型的s-rbd蛋 白，再与福氏佐剂或辅助佐剂按(1-10):(1-10)：(1-10)的比例进行混合， 置入高速匀浆器高速匀化，形成油包水乳液，即制得冠状病毒糖基化s-rbd 蛋白抗原。
31.进一步地，在抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体的制备方法中，优选在s3 步骤中，包括分别由两种不同的冠状病毒糖基化s蛋白抗原、一种冠状病毒 糖基化s-rbd抗原制备所得的三种抗冠状病毒糖基化igy抗体。
32.一种抗冠状病毒通用表位igy抗体的制备方法，包括以下步骤：
33.s1、制备冠状病毒通用表位抗原：筛选冠状病毒的通用表位，制备通用 表位的抗原成份，在单一或复合通用表位的抗原成份中加入佐剂，制得单一 或复合冠状病毒通用表位抗原；
34.s2、制备免疫蛋：采用步骤s1中单一或复合冠状病毒通用表位抗原对产 蛋禽类进行免疫，得到单一或复合抗冠状病毒通用表位抗原免疫蛋；
35.s3、提取抗体：从免疫蛋中提取单一抗冠状病毒通用表位igy抗体或复 合抗冠状病毒通用表位igy抗体。
36.进一步地，在抗冠状病毒通用表位igy抗体的制备方法中，优选在s1步 骤中，冠状病毒通用表位的抗原成份包括以下一种或几种的组合:冠状病毒 的s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序列保守抗原表位抗原成份、 冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的drlitgrl片段保守抗原表位抗原 成份、冠状病毒共有的wdypkcdra片段多肽抗原成份、冠状病毒rna定向rna 聚合酶保守抗原表位蛋白抗原成份。
37.进一步地，在抗冠状病毒通用表位igy抗体的制备方法中，优选在s1步 骤中，单一或复合冠状病毒通用表位抗原的制备，分别包括以下步骤：
38.单一冠状病毒通用表位抗原：分别取冠状病毒的s蛋白c末端的通用保 守域ucd的124氨基酸序列保守抗原表位抗原成份、冠状病毒s蛋白的通用 保守域ucd中共有的drlitgrl片段保守抗原表位抗原成份、冠状病毒共有的 wdypkcdra片段多肽抗原成份、冠状病毒rna定向rna聚合酶保守抗原表位蛋 白抗原成份与福氏佐剂或辅助佐剂按(1-10):(1-10)的比例进行混合，置 入高速匀浆器高速匀化，形成油包水乳液，即分别制得四种不同的单一冠状 病毒通用表位抗原；
39.复合冠状病毒通用表位抗原：取冠状病毒的s蛋白c末端的通用保守域 ucd的124氨基酸序列保守抗原表位抗原成份、冠状病毒s蛋白的通用保守域 ucd中共有的drlitgrl片段保守抗原表位抗原成份、冠状病毒共有的 wdypkcdra片段多肽抗原成份、冠状病毒rna定向rna聚合酶保守抗原表位蛋 白抗原成份按(1-10):(1-10):(1-10):(1-10)的比例混合均匀，再与 福氏佐剂或辅助佐剂按(1-10):(1-10)的比例进行混合，置入高速匀浆器 高速匀化，形成油包水乳液，即制得复合冠状病毒通用表位抗原。
40.进一步地，在抗冠状病毒通用表位igy抗体的制备方法中，优选在s3步 骤中，包括由四种单一冠状病毒通用表位抗原分别制得的四种单一抗冠状病 毒通用表位igy抗体和一种由复合冠状病毒通用表位抗原制得的复合抗冠状 病毒通用表位igy抗体。
41.一种广谱抗冠状病毒保守表位igy抗体的制备方法，采用上述所述的抗 冠状病毒保守表位igy抗体和上述所述的抗冠状病毒通用表位igy抗体组合 形成。
42.进一步地，优选所述抗冠状病毒保守表位igy抗体和所述抗冠状病毒通 用表位igy抗体按(1-10):(1-10)的比例混合形成。
43.一种广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy复合抗 体的制备方法，采用上述所述的广谱抗冠状病毒保守表位igy抗体与上述所 述的抗冠状病毒糖基化
抗原igy抗体三种中任意一种组合形成。
44.进一步地，优选所述广谱抗冠状病毒保守表位igy抗体与所述抗冠状病 毒糖基化抗原igy抗体三种中任意一种按(1-10):(1-10)的比例混合形成。
45.一种广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳 米抗体复合抗体的制备方法，采用上述所述的广谱抗冠状病毒保守表位igy 和抗冠状病毒糖基化抗原igy复合抗体与抗新型冠状病毒纳米抗体组合形成。
46.所述广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy复合抗 体、抗新型冠状病毒纳米抗体按(1-10):(1-10)的比例混合形成。
47.一种广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳 米抗体复合抗体的应用，采用上述所述的一种广谱抗冠状病毒保守表位igy 和抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体用于制备防治新型冠病 毒感染和新型冠病毒肺炎的药物、消毒产品、保健品或医疗器械和检测试剂 盒。
48.一种广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳 米抗体复合抗体制剂，采用上述所述的广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠 状病毒糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体制成和/或加入辅料制成的稳定 制剂。
49.进一步地，优选所述稳定制剂为雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴 眼剂、中央空调雾化加湿填充剂、空气消毒剂、室内外消毒剂、喷雾消毒剂、 洗手液、粉剂、片剂、牙膏、漱口水、口含片、口服液、口服剂、胶囊剂中 的至少一种。
50.进一步地，优选所述辅料为赋形剂、填充剂、溶剂、膏体、助溶剂、表 面活性剂和胶囊辅料中一种或多种。
51.本发明的有益效果：本发明提供广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化 抗原igy以及纳米抗体复合抗体及其制剂,本发明通过优选人类冠状病毒株中 保守性强抗原表位，研发抗冠状病毒保守表位igy抗体；合成具有天然糖基 化水平的糖基化抗原成份，研发抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体；找到一种 或多种具有高度免疫原性并且在所有人类冠状病毒株中接近100％保守的通 用抗原表位，研发抗冠状病毒通用表位igy抗体；针对冠状病毒和新冠病毒 易变异以及具有免疫逃逸功能的特点，可有效抵御各种冠状病毒，有效防治 冠状病毒感染和新型冠状病毒肺炎。
具体实施方式
52.为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明 本发明的具体实施方式。
53.一、抗冠状病毒保守表位igy抗体的制备
54.本发明研制的抗新冠病毒保守表位igy抗体瞄准了所有冠状病毒共有的 保守表位，其中有的保守表位“自1960年以来(包括2003年冠状病毒突 变成sars的变异)一直保持保守”；显而易见的是，不管今后冠状病毒 如何变异，抗新冠病毒保守表位igy都能对付它。
55.抗冠状病毒保守表位igy抗体的制备方法，包括以下步骤：
56.s1、制备冠状病毒保守表位抗原：筛选出若干种保守性强的抗原表位， 制备单一或复合的保守性强的抗原表位的抗原成份，然后加入佐剂，制得单 一冠状病毒保守表位抗原或复合冠状病毒保守表位抗原；
57.s2、制备免疫蛋：取步骤s1中的单一或复合冠状病毒保守表位抗原对产 蛋禽类进行免疫，得到单一或复合抗冠状病毒保守表位抗原免疫蛋；
58.s3、提取抗体：从单一或复合抗冠状病毒保守表位抗原免疫蛋中提取单 一抗冠状病毒保守表位igy抗体或复合抗冠状病毒保守表位igy抗体。
59.(一)制备冠状病毒保守表位抗原
60.1.筛选保守性强的抗原表位。
61.本发明在深入剖析新冠病毒的结构以及各抗原表位功能的基础上，优选 出的六个有代表性的保守性强的抗原表位：
62.(1)新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域，是对冠状病毒具有广谱中和能 力的抗体h014所针对的抗原表位，是具代表性的一类全新的广谱性中和表 位；因此，选择新型冠状病毒rbd侧面的这个保守性区域作为保守性强的抗 原表位的抗原之一。
63.(2)s2亚基是相对高度保守的，其中含有促进病毒与细胞融合的关键蛋白 片段，包括融合肽，两个七肽重复区(hr1和hr2)以及跨膜结构域。鉴于s2 的跨膜结构域在不同属的冠状病毒间也是非常保守的；因此，选择新型冠状 病毒的亚基七肽重复区hr结构域作为保守性强的抗原表位的抗原之一。
64.(3)s309抗体与新型冠状病毒s蛋白结合的表位在新型冠状病毒中较保 守，迄今为止报道的11839个新型冠状病毒分离株(isolate)中只有4株在 这一表位上出现突变；因此，选择s309抗体结合的新型冠状病毒s1的这个 表位作为保守性强的抗原表位的抗原之一。
65.(4)n端结构域(ntd)ntd含有较为保守的结合rna的正电荷分布区域， 因此，选择新型冠状病毒的n末端结构域作为保守性强的抗原表位的抗原之 一。
66.(5)新型冠状病毒n蛋白的相应位点相对保守，是一种高度免疫原性的磷 蛋白，在病毒体组装过程中，n蛋白与病毒rna结合形成螺旋核衣壳；且与病 毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。鉴于新型冠状病毒的n蛋白也具有 高度保守性；因此，选择新型冠状病毒的n蛋白作为保守性强的抗原表位的 抗原之一。
67.(6)新型冠状病毒的的膜蛋白(membrane protein，m)通过靶向胞质内 rig-i/mda5介导的rna病毒识别通路实现对i型和iii干扰素反应的抑制， 进而实现免疫逃逸。对其编码的蛋白进行氨基酸同源性比对发现，其中膜蛋 白(m)的氨基酸同源性较高，而棘突蛋白(spike)s1的变异性较大。鉴于 膜蛋白(m)是新型冠状病毒产生免疫逃逸的重要因素，序列又相对保守；因 此，选择新型冠状病毒的m蛋白作为保守性强的抗原表位的抗原之一。
68.2.制备单一或复合的保守性强的抗原表位的抗原成份
69.本发明采用基因工程表达系统制备新型冠状病毒保守性强的抗原表位的抗 原成份。同样地，可以采用原核表达系统获得所需的目的蛋白，也可采用真 核表达系统来表达目的蛋白。下面以原核表达系统制备新型冠状病毒保守性 强的抗原表位抗原成份为例进行说明，其它真核表达系统表达，则根据新型 冠状病毒保守性强的抗原表位相对应基因序列，以病毒类基因载体或非病毒 基因载体进行克隆，通过昆虫细胞或其它细胞大规模发酵生产；或者将新型 冠状病毒保守性强的抗原表位相对应基因序列克隆于表达载体获得重组质 粒，把重组质粒转染cho细胞或在昆虫细胞表达系统中表达；从而，制备得 到新型冠状病毒保守性强的抗原表位蛋白抗原成份。其中以杆状病毒作为载 体是较优选择，杆状病
毒表达体系的主要特点是可以获得大量抗原性、免疫 原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。重组杆状病毒感染昆 虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基 化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用， 而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的 寡聚化装配。具体过程不赘述。
70.采用原核表达系统制备其中六种有代表性新型冠状病毒保守性强的抗原表 位抗原成份的方法说明如下。
71.(1)采用真核表达系统制作新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原成份
72.i.从genbank中获取新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域基因序列：
73.aacttgtgcc cttttggtga agtttttaac gccaccagat ttgcatctgt ttatgcttgg 60
74.aacaggaaga gaatcagcaa ctgtgttgct gattattctg tcctatataa ttccgcatca 120
75.ttttccactt ttaagtgtta tggagtgtct cctactaaat taaatgatct ctgctttact 180
76.aatgtctatg cagattcatt tgtaattaga ggtgatgaag tcagacaaat cgctccaggg 240
77.caaactggaa agattgctga ttataattat aaattaccag atgattttac aggctgcgtt 300
78.atagcttgga attctaacaa tcttgattct aaggttggtg gtaattataa ttacctgtat 360
79.agattgttta ggaagtctaa tctcaaacct tttgagagag atatttcaac tgaaatctat 420
80.caggccggta gcacaccttg taatggtgtt gaaggtttta attgttactt tcctttacaa 480
81.tcatatggtt tccaacccac taatggtgtt ggttaccaac catacagagt agtagtactt 540
82.tcttttgaac ttctacatgc accagcaact gtttgtggac ct 582。
83.ii.基因密码子优化与合成
84.基于大肠杆菌的密码子偏爱性对新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域基 因人工合成，5
′
端引入bglⅱ酶切位点，3
′
端引入xhoⅰ酶切位点。
85.iii.连接与转化
86.合成的新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域基因用bglⅱ和xhoⅰ在37℃ 下双酶切过夜，载体pgex-4t-1用bamhⅰ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，酶切后 的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收；将回收的目的基 因与载体以摩尔比5∶1的比例混合，16℃下连接过夜，构建含有目的基因的 重组质粒，转化大肠杆菌dh5。
87.iv.重组质粒的筛选与鉴定
88.挑取单个菌落于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基中37℃培养过夜后， 小提质粒，对目的基因的重组质粒进行测序，测序结果与ncbi数据库中公布 的序列以blast进行比较，结果完全一致的菌，挑取并保藏。
89.v.sds-page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析rbd侧面的保守性区域目的蛋 白的表达
90.经dna测序验证的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，挑取含重组原核表 达载体的单个菌落接种于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基，37℃培养过夜 后，按1％接种于新鲜的lb培养基(含50mg/l氨苄青霉素)，37℃继续培养至 od600约为1.0时，加入乳糖至终浓度为1g/l诱导9h，每隔1h取1ml菌液 作全菌sds-page电泳，考马斯亮蓝r2250染色。当诱导重组蛋白达到最佳表 达时间后收菌，4℃、10000r/m离心10min，弃上清液。菌体沉淀用适量谷氨 酰转肽酶裂解缓冲液重悬后，超声破碎菌体，4℃、12000r/m离心15min，分 别取上清液和沉淀留样电泳。电泳结果和ncbi(美国国立生物技术信息中心) 数据库中公布新型冠状
病毒rbd侧面的保守性区域蛋白大小及gst标签融合 和切除的蛋白大小比较。
91.vi.western blot(蛋白质印迹法或免疫印迹试验)鉴定目的rbd侧面的 保守性区域蛋白
92.将诱导表达的产物先行sds-page，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜 上，取下硝酸纤维素膜tbs短暂漂洗后经5％光明脱脂奶粉室温封闭1h，tbst 漂洗3次后，与gst tag单抗孵育过夜，次日tbst漂洗3次后，与irdye800 标记的羊抗鼠igg孵育1h，最后tbst 3次洗膜经odyssey红外激光成像系统 扫描实验果。通过和h014抗体的特异结合，来鉴定rbd基因在pgex-4t-1表 达的重组蛋白是目的新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域蛋白。
93.新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域重组目的蛋白表达的sds-page和 western blot鉴定试验重复三次，表明表达和生产的新型冠状病毒rbd侧面 的保守性区域重组蛋白抗原是正确的。
94.(2)采用真核表达系统制作新型冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域抗原 成份。
95.i.从genbank中获取新型冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域基因序列：
96.tcttatgtcc ttccctcagt cagcacctca tggtgtagtc ttcttgcatg tgacttatgt 60
97.ccctgcacaa gaaaagaact tcacaactgc tcctgccatt tgtcatgatg gaaaagcaca 120
98.ctttcctcgt gaaggtgtct ttgtttcaaa tggcacacac tggtttgtaa cacaaaggaa 180
99.tttttatgaa ccacaaatca ttactacaga caacacattt gtgtctggta actgtgatgt 240
100.tgtaatagga attgtcaaca acacagttta tgatcctttg caacctgaat tagactcatt 300
101.caaggaggag ttagataaat attttaagaa tcatacatca ccagatgttg atttaggtga 360
102.catctctggc attaatgctt cagttgtaaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga 420
103.ggttgccaag aatttaaatg aatctctcat cgatctccaa gaacttggaa agtat 475。
104.ii.大肠杆菌偏爱密码子优化新型冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域基 因与合成
105.根据ncbi公布的新型冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域基因序列，进 行大肠杆菌密码子优化并人工合成，5
′
端引入bglⅱ酶切位点，3
′
端引入 xhoⅰ酶切位点。
106.iii.连接与转化
107.大肠杆菌偏爱密码子优化的新型冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域基因 用bglⅱ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，载体pgex-4t-1用bamhⅰ和xhoⅰ37℃双 酶切过夜，酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收； 将回收的目的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合，16℃连接过夜，构建含 有目的基因的重组质粒，转化大肠杆菌dh5。
108.iv.重组质粒的筛选与鉴定
109.挑取单个菌落于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基中37℃培养过夜后， 小提质粒，目的基因的重组质粒进行测序，与大肠杆菌偏爱密码子优化新型 冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域基因比对。
110.v.sds-page分析亚基七肽重复区hr结构域目的蛋白的表达
111.经dna测序验证的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，挑取含重组原核表 达载体的单个菌落接种于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基，37℃培养过夜 后，按1％接种于新鲜的lb培养基(含50mg/l氨苄青霉素)，37℃继续培养至 od600约为1.0时，加入乳糖至终浓度为1g/l诱导9h，每隔1h取1ml菌液 作全菌sds2page电泳，考马斯亮蓝r2250染色。当诱导重
组蛋白达到最佳表 达时间后收菌，4℃、10000r/m离心10min，弃上清液。菌体沉淀用适量谷氨 酰转肽酶裂解缓冲液重悬后，超声破碎菌体，4℃、12000r/m离心15min，分 别取上清液和沉淀留样电泳。电泳结果和亚基七肽重复区hr结构域蛋白ncbi 数据库中公布亚基七肽重复区hr结构域蛋白大小及gst标签融合和切除的蛋 白大小比较。
112.vi.western blot鉴定亚基七肽重复区hr结构域目的蛋白 将诱导表达的产物先行sds-page，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜上， 取下硝酸纤维素膜tbs短暂漂洗后经5％光明脱脂奶粉室温封闭1h，tbst漂洗 3次后，与gst tag单抗孵育过夜，次日tbst漂洗3次后，与irdye800标记 的羊抗鼠igg孵育1h，最后tbst3次洗膜经odyssey红外激光成像系统扫描 实验果。通过和1a9抗体的特异结合，来鉴定亚基七肽重复区hr结构域基因 在pgex-4t-1表达的重组蛋白是目的蛋白。
113.重组亚基七肽重复区hr结构域蛋白表达的sds-page和western blot鉴 定试验重复三次，表明表达和生产的亚基七肽重复区hr结构域重组蛋白抗原 是正确的。
114.(3)采用真核表达系统制作s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位抗原成 份
115.i.从genbank中获取sars-cov-2之s309抗体结合的新型冠状病毒s1 表位基因序列：
116.117.118.119.120.121.[0122][0123]
ii.大肠杆菌偏爱密码子优化sars-cov-2之s309抗体结合的新型冠状病 毒s1表位基因与合成
[0124]
根据ncbi公布的sars-cov-2之s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位 基因序列，进行大肠杆菌密码子优化并人工合成，5
′
端引入bglⅱ酶切位点， 3
′
端引入xhoⅰ酶切位点。
[0125]
iii.连接与转化
[0126]
大肠杆菌偏爱密码子优化的sars-cov-2人工合成s309抗体结合的新型 冠状病毒s1表位基因用bglⅱ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，载体pgex-4t-1用 bamhⅰ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶 电泳后割胶纯化回收；将回收的目的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合， 16℃连接过夜，构建含有目的基因的重组质粒，转化大肠杆菌dh5。
[0127]
iv.重组质粒的筛选与鉴定
[0128]
挑取单个菌落于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基中37℃培养过夜后， 小提质粒，目的基因的重组质粒进行测序，与大肠杆菌偏爱密码子优化的 sars-cov-2人工合成s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位基因比对，结果 完全一致的菌，挑取并保藏。
[0129]
v.sds-page分析目的蛋白的表达
[0130]
经dna测序验证的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，挑取含重组原核表 达载体的单个菌落接种于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基，37℃培养过夜 后，按1％接种于新鲜的lb培养基(含50mg/l氨苄青霉素)，37℃继续培养至 od600约为1.0时，加入乳糖至终浓度为1g/l诱导9h，每隔1h取1ml菌液 作全菌sds2page电泳，考马斯亮蓝r2250染色。当诱导重组蛋白达到最佳表 达时间后收菌，4℃、10000r/m离心10min，弃上清液。菌体沉淀用适量谷氨 酰转肽酶裂解缓冲液重悬后，超声破碎菌体，4℃、12000r/m离心15min，分 别取上清液和沉淀留样电泳。电泳结果和ncbi数据库中公布sars-cov-2之 s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位基因蛋白大小及gst标签融合和切除的 蛋白大小比较。
[0131]
vi.western blot鉴定目的蛋白
[0132]
将诱导表达的产物先行sds-page，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜 上，取下硝酸纤维素膜tbs短暂漂洗后经5％光明脱脂奶粉室温封闭1h，tbst 漂洗3次后，与gst tag单抗孵育过夜，次日tbst漂洗3次后，与irdye800 标记的羊抗鼠igg孵育1h，最后tbst3次洗膜经odyssey红外激光成像系统 扫描实验果。通过和s309抗体的特异结合，来鉴定表达的重组蛋白是目的蛋 白。
[0133]
重组蛋白表达的sds-page和western blot鉴定试验重复三次，表明表 达和生产的重组sars-cov-2之s309抗体结合的新型冠状病毒s1表位基因蛋 白抗原是正确的。
[0134]
(4)采用真核表达系统制作新型冠状病毒的n末端结构域抗原成份
[0135]
i.从genbank中获取新型冠状病毒的n末端结构域(也称sars-cov-2 之ntd)基因序列：
[0136]
ttttattgcc actagtctct agtcagtgtg ttaatcttac aaccagaact caattacccc 60
[0137]
ctgcatacac taattctttc acacgtggtg tttattaccc tgacaaagtt ttcagatcct 120
[0138]
cagttttaca ttcaactcag gacttgttct tacctttctt ttccaatgtt acttggttcc 180
[0139]
atgctataca tgtctctggg accaatggta ctaagaggtt tgataaccct gtcctaccat 240
[0140]
ttaatgatgg tgtttatttt gcttccactg agaagtctaa cataataaga ggctggattt 300
[0141]
ttggtactac ttt 313。
[0142]
ii.基因密码子优化与合成
[0143]
基于大肠杆菌的密码子偏爱性对sars-cov-2之ntd基因人工合成，5
′ꢀ
端引入bglⅱ酶切位点，3
′
端引入xhoⅰ酶切位点。
[0144]
iii.合成的ntd基因用bglⅱ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，载体pgex-4t-1 用bamhⅰ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖 凝胶电泳后割胶纯化回收；将回收的目的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混 合，16℃连接过夜，构建含有ntd目的基因的重组质粒pgex-4t-1-ntd，转 化大肠杆菌dh5。
[0145]
iv.重组质粒pgex-4t-1-ntd的筛选与鉴定
[0146]
挑取单个菌落于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基中37℃培养过夜后，小提 质粒，
酶切并测序鉴定构建的pgex-4t-1-ntd质粒是含有密码子优化的ntd 序列。
[0147]
v.sds-page分析ntd目的蛋白的表达
[0148]
经dna测序验证的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，挑取含重组原核表 达载体的单个菌落接种于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基，37℃培养过夜 后，按1％接种于新鲜的lb培养基(含50mg/l氨苄青霉素)，37℃继续培养至 od600约为1.0时，加入乳糖至终浓度为1g/l诱导9h，每隔1h取1ml菌液 作全菌sds2page电泳，考马斯亮蓝r2250染色。当诱导重组蛋白达到最佳表 达时间后收菌，4℃、10000r/m离心10min，弃上清液。菌体沉淀用适量谷氨 酰转肽酶裂解缓冲液重悬后，超声破碎菌体，4℃、12000r/m离心15min，分 别取上清液和沉淀留样电泳。电泳结果和ntd蛋白ncbi数据库中公布ntd蛋 白大小及gst标签融合和切除的蛋白大小比较。
[0149]
vi.western blot鉴定ntd目的蛋白。
[0150]
将诱导表达的产物先行sds-page，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜上， 取下硝酸纤维素膜tbs短暂漂洗后经5％光明脱脂奶粉室温封闭1h，tbst漂洗 3次后，与gst tag单抗孵育过夜，次日tbst漂洗3次后，与irdye800标记 的羊抗鼠igg孵育1h，最后tbst 3次洗膜经odyssey红外激光成像系统扫描 实验果。通过和ntd抗体的特异结合，来鉴定ntd基因在pgex-4t-1表达的 重组蛋白是目的ntd蛋白。
[0151]
ntd重组目的蛋白表达的sds-page和western blot鉴定试验重复三次， 表明表达和生产的ntd重组蛋白抗原是正确的。
[0152]
(5)采用真核表达系统制作新型冠状病毒n蛋白抗原成份
[0153]
i.从genbank中获取sars-cov-2之n基因序列
[0154][0155][0156]
ii.大肠杆菌偏爱密码子优化sars-cov-2-n基因与合成
[0157]
根据ncbi公布的sars-cov-2-n基因序列，进行大肠杆菌密码子优化并 人工合成，5
′
端引入bglⅱ酶切位点，3
′
端引入xhoⅰ酶切位点。
[0158]
iii.连接与转化
[0159]
大肠杆菌偏爱密码子优化的sars-cov-2人工合成n基因用bglⅱ和xho
ꢀⅰ
37℃双酶切过夜，载体pgex-4t-1用bamhⅰ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，酶 切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收；将回收的目 的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合，16℃连接过夜，构建含有目的基因 的重组质粒pgex-4t-1-n，转化大肠杆菌dh5。
[0160]
iv.重组质粒pgex-4t-1-n的筛选与鉴定
[0161]
挑取单个菌落于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基中37℃培养过夜后， 小提质粒，对目的基因的重组质粒pgex-4t-1-n进行测序，测序结果与ncbi 数据库中公布的序列以blast进行比较，结果完全一致的菌，挑取并保藏。
[0162]
v.sds-page分析n目的蛋白的表达
[0163]
经dna测序验证的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，挑取含重组原核表 达载体的单个菌落接种于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基，37℃培养过夜 后，按1％接种于新鲜的lb培养基(含50mg/l氨苄青霉素)，37℃继续培养至od600约为1.0时，加入乳糖至终浓度为1g/l诱导9h，每隔1h取1ml菌液 作全菌sds2page电泳，考马斯亮蓝r2250染色。当诱导重组蛋白达到最佳表 达时间后收菌，4℃、10000r/m离心10min，弃上清液。菌体沉淀用适量谷氨 酰转肽酶裂解缓冲液重悬后，超声破碎菌体，4℃、12000r/m离心15min，分 别取上清液和沉淀留样电泳。电泳结果和n蛋白ncbi数据库中公布n蛋白大 小及gst标签融合和切除的蛋白大小比较。
[0164]
vi.western blot鉴定n目的蛋白
[0165]
将诱导表达的产物先行sds-page，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜 上，取下硝酸纤维素膜tbs短暂漂洗后经5％光明脱脂奶粉室温封闭1h，tbst 漂洗3次后，与gst tag单抗孵育过夜，次日tbst漂洗3次后，与irdye800 标记的羊抗鼠igg孵育1h，最后tbst3次洗膜经odyssey红外激光成像系统 扫描实验果。通过和n蛋白抗体的特异结合，来鉴定n基因在pgex-4t-1表 达的重组蛋白是目的n蛋白。
[0166]
重组n蛋白表达的sds-page和western blot鉴定试验重复三次，表明 表达和生产的n重组蛋白抗原是正确的。
[0167]
(6)采用真核表达系统制作新型冠状病毒m蛋白抗原成份。
[0168]
i.从genbank中获取新型冠状病毒(sars-cov-2)之m基因序列。
[0169]
[0170][0171]
ii.大肠杆菌偏爱密码子优化sars-cov-2-m基因与合成
[0172]
根据ncbi公布的sars-cov-2-m基因序列，进行大肠杆菌密码子优化并 人工合成，5
′
端引入bglⅱ酶切位点，3
′
端引入xhoⅰ酶切位点。
[0173]
iv.连接与转化
[0174]
大肠杆菌偏爱密码子优化的sars-cov-2人工合成m基因用bglⅱ和xho
ꢀⅰ
37℃双酶切过夜，载体pgex-4t-1用bamhⅰ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，酶 切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收；将回收的目 的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合，16℃连接过夜，构建含有目的基因 的重组质粒pgex-4t-1-m，转化大肠杆菌dh5。
[0175]
v.重组质粒pgex-4t-1-m的筛选与鉴定
[0176]
挑取单个菌落于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基中37℃培养过夜后， 小提质粒，对目的基因的重组质粒pgex-4t-1-m进行测序，与大肠杆菌偏爱 密码子优化m基因比对。
[0177]
v.sds-page分析m目的蛋白的表达
[0178]
经dna测序验证的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，挑取含重组原核表 达载体的单个菌落接种于含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基，37℃培养过夜 后，按1％接种于新鲜的lb培养基(含50mg/l氨苄青霉素)，37℃继续培养至od600约为1.0时，加入乳糖至终浓度为1g/l诱导9h，每隔1h取1ml菌液 作全菌sds2page电泳，考马斯亮蓝r2250染色。当诱导重组蛋白达到最佳表 达时间后收菌，4℃、10000r/m离心10min，弃上清液。菌体沉淀用适量谷氨 酰转肽酶裂解缓冲液重悬后，超声破碎菌体，4℃、12000r/m离心15min，分 别取上清液和沉淀留样电泳。电泳结果和ncbi数据库中公布m蛋白大小及gst 标签融合和切除的蛋白大小比较。
[0179]
vi.western blot鉴定m目的蛋白。
[0180]
将诱导表达的产物先行sds-page，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜 上，取下硝酸纤维素膜tbs短暂漂洗后经5％光明脱脂奶粉室温封闭1h，tbst 漂洗3次后，与gst tag单抗孵育过夜，次日tbst漂洗3次后，与irdye800 标记的羊抗鼠igg孵育1h，最后tbst3次洗膜经odyssey红外激光成像系统 扫描实验果。通过和n蛋白抗体的特异结合，来鉴定n基因在pgex-4t-1表 达的重组蛋白是目的m蛋白。
[0181]
重组m蛋白表达的sds-page和western blot鉴定试验重复三次，表明 表达和生产的m重组蛋白抗原是正确的。
[0182]
3.制备冠状病毒保守表位抗原。
[0183]
a.制作单一冠状病毒保守表位抗原。
[0184]
将按以上方法制成的六种不同的新型冠状病毒保守性强的抗原表位的抗 原成份：(1)新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原成份、(2)新型冠状病 毒亚基七肽重复区hr结构域抗原成份、(3)s309抗体结合的新型冠状病毒s1 表位抗原成份、(4)新型冠状病毒n末端结构域抗原成份、(5)新型冠状病毒 的n蛋白、(6)新型冠状病毒m蛋白抗原成份，分别与福氏佐剂或辅助佐剂混 合，福氏佐剂或辅助佐剂的加入可以增强抗原免疫效果，抗原成份与佐剂的 加入按1-10:1-10比例(通常为1:1)混合，加入量根据实际情况加入，具体 不做限定，混合后置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液， 即分别制得六种单一的冠状病毒保守表位抗原。
[0185]
b.制备复合冠状病毒保守表位抗原。
[0186]
将按以上方法制成的六种不同的新型冠状病毒保守性强的抗原表位抗原 成份任意分为两组，第一组(a组)可由以下三种新型冠状病毒保守性强的抗 原表位抗原成份组成：新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原成份、新型 冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域抗原成份、s309抗体结合的新型冠状病毒 s1表位抗原成份；第二组(b组)可由以下三种新型冠状病毒保守性强的抗 原表位抗原成份组成：新型冠状病毒n末端结构域抗原成份、新型冠状病毒 的n蛋白抗原成份、新型冠状病毒m蛋白抗原成份；然后，首先每组分别按 1-10:1-10:1-10比例(通常为1:1:1)混合均匀，加入量根据实际情况加入， 具体不做限定，分别制成两组新型冠状病毒保守性强的复合抗原表位抗原成 份，再分别按1-10:1-10比例(通常为1:1)加入福氏佐剂或辅助佐剂，加入 量根据实际情况加入，具体不做限定，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀 化，形成油包水乳液，即制得第一种复合冠状病毒保守表位抗原、第二种复 合冠状病毒保守表位抗原。
[0187]
或者，将按以上方法制成的六种不同的新型冠状病毒保守性强的抗原表 位的抗原成份：(1)新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原成份、(2)新型 冠状病毒亚基七肽重复区(hr)结构域抗原成份、(3)s309抗体结合的新型冠状 病毒s1表位抗原成份、(4)新型冠状病毒n末端结构域(ntd)抗原成份、 (5)新型冠状病毒的n蛋白、(6)新型冠状病毒m蛋白，按 1-10:1-10:1-10:1-10:1-10:1-10比例(通常为1:1:1:1:1:1)混合均匀制成 新型冠状病毒保守性强的抗原表位的复合抗原成份，再按1-10:1-10比例(通 常为1:1)在新型冠状病毒保守性强的抗原表位复合抗原成份中加入福氏佐剂 或辅助佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即 制得第三种复合冠状病毒保守表位抗原。
[0188]
或者，也可将六种新型冠状病毒保守性强抗原表位的抗原成份中的其中 一种与其它1-5种新型冠状病毒保守性强抗原表位的抗原成份按任意比例混 合制成新型冠状病毒保守性强抗原表位的复合抗原成份，然后再按1-10:1-10 比例(通常为1:1)与福氏佐剂或辅助佐剂混合，置入高速匀浆器以30,000rpm 高速匀化，形成油包水乳液，即制得第四种复合冠状病毒保守表位抗原。
[0189]
(二)制备抗冠状病毒保守表位抗原免疫蛋。
[0190]
本发明可选用任何产蛋禽类(包括鸡、鸵鸟、鸭、鹅等)进行免疫制备 免疫蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样 进行。
[0191]
分别采用前面方法制备的六种单一冠状病毒保守表位抗原和四种复合冠 状病毒保守表位抗原对产蛋鸡进行免疫，每隔两周注射一次，共注射2-5次， 最后一次注射后的至少第12天后检取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记， 得到六种抗不同的单一抗冠状病毒
t323、n331、n343糖基化位点的s-rbd蛋白；同时，上述含糖基化位点的s-rbd 蛋白还可以具有不同糖型，如d糖型，又或者l糖型。任取一种或任取几种 不同的糖基化位点、糖型的s-rbd蛋白混合，两种不同的s-rbd蛋白之间按 1-10：1-10的比例加入，三种不同的s-rbd蛋白之间按1-10：1-10：1-10的 比例加入。例如，取只含有n323糖基化位点的s-rbd蛋白、只含有n331糖 基化位点的s-rbd蛋白、只含有n343糖基化位点s-rbd蛋白按1-10:1-10:1-10 比例混合，投入量根据实际情况加入，具体不做限定，通常为1:1:1，三种以 上不同糖型的s-rbd蛋白的配比依此类推；然后加入福氏佐剂或辅助佐剂， 置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得冠状病毒 复合糖基化s-rbd蛋白抗原。
[0215]
(二)制备抗冠状病毒糖基化抗原免疫蛋
[0216]
本发明可选用任何产蛋禽类(包括鸡、鸵鸟、鸭、鹅等)免疫制备免疫 蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。
[0217]
分别采用前面方法制备的两种不同的冠状病毒糖基化s蛋白抗原和一种 冠状病毒复合糖基化s-rbd蛋白抗原对产蛋鸡进行免疫，每隔两周注射一次， 共注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后检取产蛋鸡所产免疫蛋，并 进行编码标记，得到两种不同的抗冠状病毒糖基化s蛋白抗原免疫蛋和一种 抗冠状病毒糖基化s-rbd抗原免疫蛋。
[0218]
(三)制备抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体粗提物
[0219]
采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法制备抗冠 状病毒糖基化抗原igy抗体的粗提物。本发明以纯水提取法为例说明，其他 制备方法参照常规方法操作，具体操作过程，这里就不赘述。
[0220]
纯水提取法制备抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体粗提物。具体操作方法 如下：
[0221]
取所制备的两种抗冠状病毒糖基化s蛋白抗原免疫蛋和一种抗冠状病毒 糖基化s-rbd抗原免疫蛋分别用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机分 别打碎这些免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；再按蛋 黄液体积的3-8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0n盐酸溶液调ph 至5.5-6.5；将调好ph值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至 2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于高速离心；取分离所得的上清液置 超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入浓度为1.0-3.0％的海藻酸钠液， 缓慢添加海藻酸钠液至终浓度为0.1-0.2％，搅拌至出现浑浊；再加入1.0-3.0％ 氯化钙溶液，至氯化钙终浓度为0.05-0.3％，搅拌均匀，3-4℃静置8-12小时； 高速离心并取上清液，得到三种不同的抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体的粗 提物。
[0222]
(四)制备抗新冠病毒糖基化抗原纯igy溶液或干粉
[0223]
分别将制得的三种不同的抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体的粗提物溶解 于ph7.0、0.01mol/l的磷酸盐缓冲液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶 层析柱或者亲和层析柱层析，得到三种抗新冠病毒糖基化抗原纯igy抗体溶 液。三种抗新冠病毒糖基化抗原纯igy抗体溶液经过冷冻干燥或中低温喷雾 干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式制得三种抗新冠病 毒糖基化抗原纯igy抗体干粉。
[0224]
本发明在深入剖析新冠病毒结构的基础上，选择糖基化s和s-rbd这个关键靶 标，合成的一种特别的、具有天然糖基化水平的糖基化位点抗原成份，将其 应用到抗冠状病毒igy抗体中，创新研制一种抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体， 解开了因新冠病毒高度糖基化而使普通新冠抗体药减效或失效的死结，从根 源上解决新冠病毒容易“免疫逃逸”而影响
新冠抗体药疗效的难题；从而， 显著提高所研制的抗新冠病毒igy抗体的疗效。另外，本发明选择n-连接糖 基化位点中保守的18个糖基化位点的糖基化s蛋白作为靶标，还可增强所研制 的抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体的抗变异能力。
[0225]
三、抗冠状病毒通用表位igy抗体的制备
[0226]
抗冠状病毒通用表位igy抗体的制备，包括以下步骤：
[0227]
s1、制备冠状病毒通用表位抗原：筛选冠状病毒的通用表位，制备通用 表位的抗原成份，在单一或复合通用表位的抗原成份中加入佐剂，制得单一 或复合冠状病毒通用表位抗原；
[0228]
s2、制备免疫蛋：采用步骤s1中单一或复合冠状病毒通用表位抗原对产 蛋禽类进行免疫，得到单一或复合抗冠状病毒通用表位抗原免疫蛋；
[0229]
s3、提取抗体：从免疫蛋中提取单一抗冠状病毒通用表位igy抗体或复 合抗冠状病毒通用表位igy抗体。
[0230]
要解决冠状病毒和新型冠状病毒易突变和变异以及“免疫逃逸”的问 题，就必须找到冠状病毒某种部位，这种部位对病毒的生存不可或缺，以至 于能在所有的冠状病毒中保留下来，不会随着病毒的变异而改变；这种高度 保守的部位即是“通用表位”，找到这种“通用表位”，就可利用这种“通 用表位”来制备可有效抵御各种冠状病毒的抗体。
[0231]
发现和选定“通用表位”是关键。通过对所有七种人类冠状病毒的刺突 蛋白(s蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)、膜蛋白(m蛋白)、核衣壳蛋白(n蛋白) 和复制酶多蛋白1ab进行了多序列比对。在e蛋白、m蛋白和n蛋白中未发 现通用的保守区域，而在s蛋白的s蛋白c末端中以及在复制酶多蛋白1ab 中则分别发现了通用的保守区域。
[0232]
(1)人类冠状病毒s蛋白中的“通用表位”。
[0233]
人类冠状病毒s蛋白包含一个n端信号序列、一个c端跨膜段和潜在的 n-连接糖基化位点。比较不同的冠状病毒的s蛋白在n端几乎没有同源性， 而在c端则具有高度保守的氨基酸序列，这是基于保守的c端编码所有冠状 病毒共有的关键结构特征。来自冠状病毒s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序列在冠状病毒中是高度保守的，并且具有很好的抗原性，可用作 通用免疫原。这个序列被称为“通用保守域”(ucd)，具有所有冠状病毒共有 的关键结构特征。以下几种冠状病毒的结构分析都说明了这个序列的共有特 性。
[0234]
a.人类冠状病毒血清群229e基因编码分离型lri281的s蛋白通用保守 结构域(ucd)的氨基酸序列【来自ncbi(genbank:y10052.1)】：
[0235][0236]
b.某地sars-cov-2中的通用保守结构域ucd的124个氨基酸序列位于新 冠病毒s蛋白中955-1078氨基酸位点：(来自ncbi reference sequence: yp_009724390.1)
[0237][0238]
其ucd的氨基酸序列与人冠状病毒229e高度相同。
[0239]
c.英国最先发现的新冠病毒变异毒sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021的s蛋白ucd的124个氨基酸序列
[0240]
[0241][0242]
其ucd的氨基酸序列与某地新冠病毒毒株高度相同。
[0243]
d.sars-cov-2/human/lbn/lebanon 6-b.1.1.7/2020的s蛋白ucd氨基酸 序列
[0244]
[0245][0246]
其ucd的氨基酸序列也与某地新冠病毒毒株高度相同。
[0247]
此外，下列新冠病毒毒株与某地新冠病毒毒株的s蛋白ucd的124个氨 基酸序列对比也高度相同。
[0248]
[0249][0250]
因此，本发明选择冠状病毒s蛋白的这个高度保守的区域—“通用保守 域”(ucd)作为冠状病毒“通用表位”。
[0251]
(2)所有冠状病毒s蛋白的通用保守结构域(ucd)中共有的8个氨基 酸序列(drlitgrl片段)保守抗原表位。
[0252]
进一步研究还发现冠状病毒s蛋白的“通用保守域”(ucd)中还隐藏一段 基因片段，其保守性最高，不但在人类冠状病毒s蛋白高度保守，在所有物 种中的冠状病毒s蛋白中都保持完全一样。
[0253]
因此，本发明同时选择冠状病毒s蛋白“通用保守域”(ucd)中最保守的 drlitgrl片段作为冠状病毒“通用表位”。
[0254]
(3)人类冠状病毒复制酶多蛋白1ab中的“通用表位”。
[0255]
之前，人们都围绕在人类冠状病毒的刺突蛋白(s蛋白)、包膜蛋白(e 蛋白)、膜蛋白(m蛋白)、核衣壳蛋白(n蛋白)等病毒部位寻找保守抗原位 点；实际上，在这些部位之外的“rna定向的rna聚合酶”中隐藏着一个最保 守的抗原位点。这个“通用的保守区域抗原位点”自1960年以来(包括2003 年冠状病毒突变成sars的变异)一直保持保守。
[0256]
这个保守区域位于rna定向的rna聚合酶中，其中的抗原决定簇wdypkcdra片段具有高度免疫原性，并且在所有人类冠状病毒株中100％保 守；因此，本发明选择wdypkcdra片段和整个rna定向rna聚合酶作为冠状 病毒通用的抗原表位即“通用表位”。
[0257]
2.制备冠状病毒通用表位抗原成份。
[0258]
本发明采用基因工程表达系统制备冠状病毒所发现的通用抗原表位抗原 成份。可以采用原核表达系统获得所发现的通用抗原表位蛋白，也可采用真 核表达系统来表达所发现的通用抗原表位蛋白。下面以原核表达系统制备所 发现的通用抗原表位蛋白抗原成份为例进行说明，其它真核表达系统表达， 则根据所发现的通用抗原表位相对应基因序列，以病毒类基因载体或非病毒 基因载体进行克隆，通过昆虫细胞或其它细胞大规模发酵生产；或者将通用 的抗原表位相对应基因序列克隆于表达载体获得重组质粒，把重组质粒转染 cho细胞或在昆虫细胞表达系统中表达；从而，制备得到多种通用表位抗原成 份。其中以杆状病毒作为载体是较优选择，杆状病毒表达体系的主要特点是 可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组 蛋白。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的 转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基
化、正确的信号肽切割、蛋白 水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一 细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配。具体过程不赘述。
[0259]
采用原核表达系统制备所发现的冠状病毒通用抗原表位抗原成份的方 法，分别说明如下。
[0260]
(1)冠状病毒的s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序列保 守抗原表位
[0261]
以人新冠病毒变异株sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021 的冠状病毒的s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序列保守抗原表 位为例，制备人冠状病毒的s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序 列保守抗原表位多肽，其它亚型的人新冠病毒s蛋白的通用保守结构域ucd 的抗原表位多肽制备方法可参照实施，具体过程不赘述。
[0262]
a.获取目的基因序列。
[0263]
从ncbi(genbank:mw686007.1)中获取人类新冠病毒变异株 sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021的s蛋白c末端的通用保守 结构域ucd的基因序列：
[0264][0265]
b.目的基因序列的合成和重组载体的构建。
[0266]
i.大肠杆菌偏爱密码子优化ucd的基因片段与合成。
[0267]
根据ncbi公布的人类新冠病毒变异株sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021的s蛋白通用保守结构域ucd的基因序列，进行大肠杆菌密 码子优化并人工合成，5
′
端加上启动子atg，3
′
端加上终止子taa，把加了 启动子和终止子的人工合成目的基因片段ucd两端分别加入限制性内切酶 ncoi和stui位点序列。
[0268]
ii.连接与转化。
[0269]
大肠杆菌偏爱密码子优化的人类新冠病毒变异株 sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021的s蛋白通用保守结构域 ucd的多肽人工合成基因用限制性内切酶ncoi和stui 37℃双酶切过夜，载 体pt7-blue同样用限制性内切酶ncoi和stui 37℃双酶切过夜，酶切后的目 的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收。将回收的目的基因与 载体以摩尔比5∶1的比例混合，16℃条件下采用t4 dna连接酶对目的基因 片段和酶切后的载体进行混合连接过夜，构建含有人类新冠病毒变异株 sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021的s蛋白c末端的通用保守 结构域ucd的多肽人工合成基因的重组质粒，重组质粒命名为 pt7-blue-b.1.1.7-ucd，转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。
[0270]
iii.重组质粒pt7-blue-b.1.1.7-ucd的筛选与鉴定。
[0271]
将转化过的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)铺于含卡那霉素的固体平 板，次日挑选克隆进行菌落pcr，筛选阳性克隆，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶 电泳，判断产物大小。对阳性克隆扩大培养并测序，测序正确的菌株保存备 用。
[0272]
将含重组质粒pt7-blue-b.1.1.7-ucd的转化菌落，提取质粒dna作限制 性内切核酸酶图谱，dna序列测定，与大肠杆菌偏爱密码子优化的目的基因比 对，确定无误后进行下一步。
[0273]
c.ucd多肽的原核重组表达。
[0274]
取测序正确的阳性菌株于37℃振荡过夜培养进行活化，隔日按1∶100的 比例转接至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中扩大培养，检测细菌生长密 度，菌液d600nm值约为0.4时加入iptg(终浓度为0.5mmol/l)，30℃振 荡诱导10h，每隔1h取1ml菌液作全菌sds-page电泳，考马斯亮蓝r2250 染色，当诱导重组多肽达到最佳表达时间后收菌。6000r/min离心5min弃 上清收集菌体，加入pbs充分混匀，在冰水状态下超声波破碎菌体，12000 r/min离心30min，分别取上清和沉淀进行sds-page，分析重组 pt7-blue-b.1.1.7-ucd的表达形式。电泳结果和ucd多肽大小比较。
[0275]
d.western blot鉴定人类新冠病毒变异株 sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021的s蛋白通用保守结构域 ucd的目的多肽。
[0276]
将诱导表达的产物先行sds-page，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜 上，取下硝酸纤维素膜tbs短暂漂洗后经5％脱脂奶粉室温封闭1h，tbst漂洗 3次后，与gst tag单抗孵育过夜，次日tbst漂洗3次后，与irdye800标记 的羊抗鼠igg孵育1h，最后用tbst 3次洗膜经odyssey红外激光成像系统扫 描实验果。通过和ucd抗体的特异结合，来鉴定ucd基因在 pt7-blue-b.1.1.7-ucd中表达的重组多肽是人类新冠病毒变异株 sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021的s蛋白c末端的通用保守 结构域ucd的人工合成基因目的多肽。
[0277]
对重组人类新冠病毒变异株sars-cov-2/human/lbn/lebanon1-b.1.1.7/2021的s蛋白c末端的通用保守结构域ucd的目的多肽的 sds-page和western blot鉴定试验重复三次，表明表达和生产的重组人类新 冠病毒变异株sars-cov-2/human/lbn/lebanon 1-b.1.1.7/2021的s蛋白c 末端的通用保守结构域ucd的124氨基酸序列保守抗原表位抗原是正确的。
[0278]
(2)制备冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的drlitgrl片段保 守抗原表位抗原成份
[0279]
a.获取drlitgrl多肽片段的目的基因序列。
[0280]
从ncbi(genbank:nc_045512.2)中获取在所有冠状病毒s蛋白的通用保守 域ucd中共有的drlitgrl片段保守表位基因序列：gataggttga tcacaggcagactt。
[0281]
b.目的基因序列的合成和重组载体的构建。
[0282]
i.大肠杆菌偏爱密码子优化drlitgrl多肽的基因片段与合成。
[0283]
根据ncbi公布的在所有冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的 drlitgrl片段保守表位基因序列，进行大肠杆菌密码子优化并人工合成，5
′ꢀ
端加上启动子atg，3
′
端加上终止子taa，把加了启动子和终止子的人工合 成目的基因片段重复拼接50次，然后在对应
的重复拼接50次的目的基因两 端分别加入限制性内切酶ncoi和stui位点序列。
[0284]
ii.连接与转化。
[0285]
大肠杆菌偏爱密码子优化的在所有冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中 共有的drlitgrl片段保守表位多肽的人工合成基因用限制性内切酶ncoi和 stui 37℃双酶切过夜，载体pt7-blue同样用限制性内切酶ncoi和stui 37℃ 双酶切过夜，酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回 收。将回收的目的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合，16℃条件下采用t4 dna连接酶对目的基因片段和酶切后的载体进行混合连接过夜，构建含有在所 有冠状病毒s蛋白中通用的drlitgrl片段保守抗原表位多肽人工合成基因的 重组质粒，重组质粒命名为pt7-blue-drlitgrl，转化至大肠杆菌bl21(de3) 感受态细胞。
[0286]
iii.重组质粒pt7-blue-drlitgrl的筛选与鉴定。
[0287]
将转化过的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)铺于含卡那霉素的固体平 板，次日挑选克隆进行菌落pcr，筛选阳性克隆，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶 电泳，判断产物大小。对阳性克隆扩大培养并测序，测序正确的菌株保存备 用。
[0288]
将含重组质粒pt7-blue-drlitgrl的转化菌落，提取质粒dna作限制性 内切核酸酶图谱，dna序列测定，与大肠杆菌偏爱密码子优化的目的基因比 对，确定无误后进行下一步。
[0289]
c.drlitgrl片段多肽的原核重组表达及鉴定。
[0290]
取测序正确的阳性菌株于37℃振荡过夜培养进行活化，隔日按1∶100的 比例转接至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中扩大培养，检测细菌生长密 度，菌液d600nm值约为0.4时加入iptg(终浓度为0.5mmol/l)，30℃振 荡诱导10h，每隔1h取1ml菌液作全菌sds-page电泳，考马斯亮蓝r2250 染色，当诱导重组多肽达到最佳表达时间后收菌。6000r/min离心5min弃 上清收集菌体，加入pbs充分混匀，在冰水状态下超声波破碎菌体，12000 r/min离心30min，分别取上清和沉淀进行能分离1kda小肽的 tricine-sds-page，分析重组pt7-blue-drlitgrl的表达形式。电泳结果和 drlitgrl片段多肽大小比较。
[0291]
对重组的在所有冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的drlitgrl片 段保守表位目的多肽的能分离1kda小肽的tricine-sds-page鉴定试验重复 三次，表明表达和生产的在冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的 drlitgrl片段保守抗原表位抗原多肽抗原是正确的。
[0292]
(3)制备冠状病毒共有的wdypkcdra片段多肽抗原成份。
[0293]
a.获取目的基因序列。
[0294]
从genbank(genbank:af124989.1)中获取冠状病毒的rna-directed rnapolymerase的wdypkcdra基因片段保守序列：tgggattatc ctaagtgtga tcgtgct 27。
[0295]
b.目的基因序列的合成和重组载体的构建。
[0296]
i.大肠杆菌偏爱密码子优化wdypkcdra基因片段与合成。
[0297]
根据ncbi公布的冠状病毒的rna定向rna聚合酶中的wdypkcdra基因片 段保守序列，进行大肠杆菌密码子优化并人工合成，5
′
端加上启动子atg，3
′ꢀ
端加上终止子taa，把加了启动子和终止子的人工合成目的基因片段重复拼接 50次，然后在对应的重复拼接50次的目的基因两端分别加入限制性内切酶 hindⅲ和xhoⅰ位点序列。
[0298]
ii.连接与转化。
[0299]
大肠杆菌偏爱密码子优化的冠状病毒的rna-directed rna polymerase 的wdypkcdra人工合成基因用限制性内切酶hindⅲ和xhoⅰ37℃双酶切过 夜，载体pgex-4t-1同样用限制性内切酶hindⅲ和xhoⅰ37℃双酶切过夜， 酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收。将回收的 目的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合，16℃条件下采用t4 dna连接酶 对目的基因片段和酶切后的载体进行混合连接过夜，构建含有rna-directedrna polymerase的wdypkcdra人工合成基因的重组质粒，重组质粒命名为 pgex-4t-1-wd，转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。
[0300]
iii.重组质粒pgex-4t-1-wd的筛选与鉴定。
[0301]
将转化过的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)铺于含卡那霉素的固体平 板，次日挑选克隆进行菌落pcr，筛选阳性克隆，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶 电泳，判断产物大小。对阳性克隆扩大培养并测序，测序正确的菌株保存备 用。
[0302]
将含重组质粒pgex-4t-1-wd的转化菌落，提取质粒dna作限制性内切核 酸酶图谱，dna序列测定，与大肠杆菌偏爱密码子优化的目的基因比对，确定 无误后进行下一步。
[0303]
c.wdypkcdra多肽的原核重组表达。
[0304]
取测序正确的阳性菌株于37℃振荡过夜培养进行活化，隔日按1∶100的 比例转接至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中扩大培养，检测细菌生长密 度，菌液d600nm值约为0.4时加入iptg(终浓度为0.5mmol/l)，30℃振 荡诱导10h，每隔1h取1ml菌液作全菌sds-page电泳，考马斯亮蓝r2250 染色，当诱导重组多肽达到最佳表达时间后收菌。6000r/min离心5min弃 上清收集菌体，加入pbs充分混匀，在冰水状态下超声波破碎菌体，12000 r/min离心30min，分别取上清和沉淀进行能分离1kda小肽的 tricine-sds-page，分析重组pgex-4t-1-wd的表达形式。电泳结果和 wdypkcdra多肽大小比较。
[0305]
对重组rna定向rna聚合酶中wdypkcdra多肽的sds-page鉴定试验重复 三次，表明表达和生产的重组rna定向rna聚合酶中wdypkcdra片段多肽抗 原是正确的。
[0306]
(4)制备冠状病毒rna定向rna聚合酶(rna-directed rna polymerase) 保守抗原表位蛋白抗原成份。
[0307]
a.获取目的基因序列。
[0308]
从genbank(genbank:af124989.1)中获取冠状病毒的rna定向rna聚 合酶基因序列：
[0309]
[0310][0311]
b.目的基因序列的人工合成和重组载体的构建。
[0312]
i.大肠杆菌偏爱密码子优化rna定向rna聚合酶基因与合成
[0313]
根据ncbi公布的冠状病毒的rna定向rna聚合酶的基因序列，进行大肠 杆菌密码子优化并人工合成，5
′
端加上启动子atg，3
′
端加上大肠杆菌终止 密码子taa，然后在对应的目的基因两端分别加入限制性内切酶hindⅲ和 xhoⅰ位点序列。
[0314]
ii.连接与转化。
[0315]
大肠杆菌偏爱密码子优化的冠状病毒的rna定向rna聚合酶的人工合成 基因用限制性内切酶hindⅲ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，载体pgex-4t-1同 样用限制性内切酶hindⅲ和xhoⅰ37℃双酶切过夜，酶切后的目的基因和载 体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收。将回收的目的基因与载体以摩尔 比5∶1的比例混合，16℃条件下采用t4 dna连接酶对目的基因片段和酶切 后的载体进行混合连接过夜，构建含有rna-directed rna polymerase的人 工合成基因的重组质粒，重组质粒命名为pgex-4t-1-rna polymerase，转化 至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。
[0316]
iii.重组质粒pgex-4t-1-rna polymerase的筛选与鉴定。
[0317]
将转化过的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)铺于含卡那霉素的固体平 板，次日挑选克隆进行菌落pcr，筛选阳性克隆，pcr产物行1％琼脂糖凝胶 电泳，判断产物大小。对阳
性克隆扩大培养并测序，测序正确的菌株保存备 用。
[0318]
将含重组质粒pgex-4t-1-rna polymerase的转化菌落，提取质粒dna作 限制性内切核酸酶图谱，dna序列测定，与大肠杆菌偏爱密码子优化的目的基 因比对，确定无误后进行下一步。
[0319]
c.rna-directed rna polymerase的原核重组表达。
[0320]
取测序正确的阳性菌株于37℃振荡过夜培养进行活化，隔日按1∶100的 比例转接至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中扩大培养，检测细菌生长密 度，菌液d600nm值约为0.4时加入iptg(终浓度为0.5mmol/l)，30℃振 荡诱导10h，每隔1h取1ml菌液作全菌sds-page电泳，考马斯亮蓝r2250 染色，当诱导重组多肽达到最佳表达时间后收菌。6000r/min离心5min弃 上清，收集菌体，加入pbs充分混匀，在冰水状态下超声波破碎菌体，12000 r/min离心30min，分别取上清和沉淀进行12％的sds-page，分析重组pgex-4t-1-rna polymerase的表达形式。电泳结果和ncbi数据库中 rna-directed rna polymerase大小比较。
[0321]
d.western blot鉴定rna-directed rna polymerase目的蛋白。
[0322]
将诱导表达的产物先行sds-page，然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜 上，取下硝酸纤维素膜tbs短暂漂洗后经5％光明脱脂奶粉室温封闭1h，tbst 漂洗3次后，与gst tag单抗孵育过夜，次日tbst漂洗3次后，与irdye800 标记的羊抗鼠igg孵育1h，最后用tbst 3次洗膜经odyssey红外激光成像系 统扫描实验果。通过和rna-directed rna polymerase蛋白抗体的特异结合， 来鉴定rna-directed rna polymerase基因在pgex-4t-1表达的重组蛋白是 目的rna-directed rna polymerase蛋白。
[0323]
对重组rna-directed rna polymerase蛋白表达的sds-page和westernblot鉴定试验重复三次，表明表达和生产的重组冠状病毒rna定向rna聚合 酶保守抗原表位蛋白抗原是正确的。
[0324]
3.制备单一冠状病毒通用表位抗原或复合冠状病毒通用表位抗原，具体 实施方法如下。
[0325]
分别取按以上方法制成的冠状病毒四种通用抗原表位的抗原成份：冠状 病毒的s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序列保守抗原表位抗原 成份、冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的drlitgrl片段保守抗原表 位抗原成份、冠状病毒共有的wdypkcdra片段多肽抗原成份、冠状病毒rna 定向rna聚合酶保守抗原表位蛋白抗原成份，分别与福氏佐剂或辅助佐剂混 合，按1-10:1-10比例混合，可以是1:10、10:1、2:8、7:6、1:1，通常为 1:1，投入量按实际情况加入，具体不作限定，置入高速匀浆器以30,000rpm 高速匀化，形成油包水乳液，即分别制得四种单一冠状病毒通用表位抗原： 冠状病毒的s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序列保守抗原表位 抗原、冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的drlitgrl片段保守抗原表 位抗原、冠状病毒共有的wdypkcdra片段多肽抗原、冠状病毒rna定向rna 聚合酶保守抗原表位蛋白抗原。
[0326]
当然，也可将这四种抗原成份：冠状病毒的s蛋白c末端的通用保守域 ucd的124氨基酸序列保守抗原表位、冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共 有的drlitgrl片段保守抗原表位抗原成份、冠状病毒共有的wdypkcdra片段 多肽抗原成份、冠状病毒rna定向rna聚合酶保守抗原表位蛋白抗原成份按 1-10:1-10:1-10:1-10比例(通常为1:1:1:1)混合均匀，可以是1:10、10:1、 2:8、7:6、1:1，通常为1:1，投入量按实际情况加入，具体不作限定，
再分 别按1-10:1-10比例(通常为1:1)加入福氏佐剂或辅助佐剂，可以是1:10、 10:1、2:8、7:6、1:1，通常为1:1，投入量按实际情况加入，具体不作限定， 置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即复合冠状病毒 通用表位抗原。
[0327]
(二)制备单一或复合抗冠状病毒通用表位抗原免疫蛋。
[0328]
本发明可选用任何产蛋禽类(包括鸡、鸵鸟、鸭、鹅等)免疫制备免疫 蛋，限于篇幅仅以母鸡为例说明，其它禽类完全可依下文所述方法同样进行。
[0329]
分别采用前面方法制备的四种单一冠状病毒通用表位抗原(冠状病毒的s 蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序列保守抗原表位抗原、冠状病 毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的drlitgrl片段保守抗原表位抗原、冠状 病毒共有的wdypkcdra片段多肽抗原、冠状病毒rna定向rna聚合酶保守抗 原表位蛋白抗原)和一种复合冠状病毒通用表位抗原对产蛋鸡进行免疫，每 隔两周注射一次，共注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后检取产蛋 鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗冠状病毒的s蛋白c末端的通用保 守域ucd的124氨基酸序列保守抗原表位抗原免疫蛋、抗冠状病毒s蛋白的 通用保守域ucd中共有的drlitgrl片段保守抗原表位抗原免疫蛋、抗冠状病 毒共有的wdypkcdra片段多肽抗原免疫蛋、抗冠状病毒rna定向rna聚合酶 保守抗原表位蛋白抗原免疫蛋和一种复合抗冠状病毒通用表位抗原免疫蛋。
[0330]
(三)提取单一抗冠状病毒通用表位igy抗体的粗提物和复合的抗冠状 病毒通用表位igy抗体的粗提物。
[0331]
采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法制备抗冠 状病毒通用保守表位igy抗体粗提物。本发明以纯水提取法为例说明，其他 制备方法参照常规方法操作，具体操作过程，这里就不赘述。
[0332]
纯水提取法提取单一抗冠状病毒通用表位igy抗体的粗提物和复合的抗 冠状病毒通用表位igy抗体的粗提物。
[0333]
具体操作方法如下：把所制备的四种单一抗冠状病毒通用表位抗原免疫 蛋和一种复合抗冠状病毒通用表位抗原免疫蛋分别用流动水洗净，酒精擦洗 消毒，再用打蛋机分别打碎四种单一抗冠状病毒通用表位抗原免疫蛋和一种 复合抗冠状病毒通用表位抗原免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄， 搅拌均匀；再按蛋黄液体积的3-8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用 1.0n盐酸溶液调ph至5.5-6.5；将调好ph值的稀释液进一步充分搅拌均匀， 然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于高速离心；取分 离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入浓度为1.0-3.0％ 的海藻酸钠液，缓慢添加海藻酸钠液至终浓度为0.1-0.2％，搅拌至出现浑浊； 再加入1.0-3.0％氯化钙溶液，至氯化钙终浓度为0.05-0.3％，搅拌均匀，3-4℃ 静置8-12小时；高速离心并取上清液，得到四种单一抗冠状病毒通用表位igy 抗体的粗提物和一种复合抗冠状病毒复合通用表位igy抗体的粗提物。
[0334]
(四)制备单一抗冠状病毒通用表位igy抗体和复合抗冠状病毒通用表 位igy抗体溶液或干粉。
[0335]
分别将制得的四种单一抗冠状病毒通用表位igy抗体和复合抗冠状病毒 通用表位igy抗体溶液或干粉溶解于ph7.0、0.01mol/l的mpb磷酸盐缓冲 液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱或者亲和层析柱层析，分别得 到四种单一抗冠状病毒通用表位纯igy
抗体溶液或一种复合抗冠状病毒通用 表位纯igy抗体溶液。分别得到四种单一抗冠状病毒通用表位纯igy抗体溶 液或一种复合抗冠状病毒通用表位纯igy抗体溶液经过冷冻干燥或中低温喷 雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式制得四种单一抗 冠状病毒通用表位纯igy抗体干粉或一种复合抗冠状病毒通用表位纯igy抗 体干粉。
[0336]
四、广谱抗冠状病毒保守表位igy抗体的制备
[0337]
采用(一)中制备的抗冠状病毒保守表位igy抗体和(三)中制备的抗 冠状病毒通用表位igy抗体组合形成，抗冠状病毒保守表位igy抗体包括十 种igy抗体，分别为：抗新型冠状病毒rbd侧面的保守性区域抗原igy抗体、 抗新型冠状病毒亚基七肽重复区hr结构域抗原igy抗体、抗s309抗体结合 的新型冠状病毒s1表位抗原igy抗体、抗新型冠状病毒n末端结构域抗原igy 抗体、抗新型冠状病毒的n蛋白抗原igy抗体、抗新型冠状病毒m蛋白抗原 igy抗体、第一种复合抗新型冠状病毒保守表位igy抗体、第二种复合抗新型 冠状病毒保守表位igy抗体、第三种复合抗新型冠状病毒保守表位igy抗体、 第四种复合抗新型冠状病毒保守表位igy抗体；抗冠状病毒通用表位igy抗 体包括：分别由冠状病毒的s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序 列保守抗原、冠状病毒s蛋白的通用保守域ucd中共有的drlitgrl片段保守 抗原表位抗原、冠状病毒共有的wdypkcdra片段多肽抗原、冠状病毒rna定 向rna聚合酶保守抗原表位蛋白抗原制备的单一冠状病毒通用表位igy抗体 和一种复合抗冠状病毒通用表位igy抗体；抗冠状病毒保守表位igy抗体中 任选任意一种或几种与抗冠状病毒通用表位igy抗体中的一种或几种混合， 抗冠状病毒保守表位igy抗体与抗冠状病毒通用表位igy抗体按(1-10): (1-10)的比例混合，可以是1:10、10:1、2:8、7:6、1:1，通常为1:1，投 入量按实际情况加入，具体不作限定，形成广谱抗冠状病毒保守表位igy抗 体。
[0338]
五、广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy复合抗 体的制备
[0339]
采用中(四)中制备的广谱抗冠状病毒保守表位igy抗体与中(二)中 制备的抗冠状病毒糖基化抗原igy抗体三种中任意一种组合形成，抗冠状病 毒糖基化抗原igy抗体包括：分别由至少包含有22个n-连接糖基化位点和至 少2个o-连接糖基化位点的糖基化s蛋白抗原、包含22个n-连接糖基化位 点中保守的18个糖基化位点的糖基化s蛋白抗原、至少包含t323、n331、n343 糖基化位点在内的至少1种不同糖型的s-rbd蛋白抗原制备的三种不同的抗 冠状病毒糖基化抗原igy抗体；广谱抗冠状病毒保守表位igy抗体与抗冠状 病毒糖基化抗原igy抗体三种中任意一种按(1-10):(1-10)的比例混合形 成，可以是1:10、10:1、2:8、9:3、1:1，通常为1:1，投入量按实际情况加 入，具体不作限定，形成广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化 抗原igy复合抗体的制备。
[0340]
六、广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳 米抗体复合抗体的制备
[0341]
采用(五)中制备的广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化 抗原igy复合抗体与抗新型冠状病毒纳米抗体组合形成，广谱抗冠状病毒保 守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy复合抗体、抗新型冠状病毒纳米抗 体按(1-10):(1-10)的比例混合，可以是1:10、10:1、2:8、9:3、1:1， 通常为1:1，投入量按实际情况加入，具体不作限定，形成广谱抗冠状病毒保 守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体；纳米抗体 采用现有技术免疫羊鸵制得。纳米抗体与普通抗体相比较特异性更高，亲和 力以及结合抗原
的能力更强；鉴于纳米抗体呈椭圆形、体积小，相对分子质 量仅为单克隆抗体的1/10，其还具有较强的组织穿透能力。本发明将广谱抗 冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy复合抗体与抗新型冠状 病毒纳米抗体组合混合，制成一种广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗 原igy以及纳米抗体复合抗体，结合了广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠 状病毒糖基化抗原igy复合抗体与抗新型冠状病毒纳米抗体各自的优势，使 得对于冠状病毒预防、治疗的疗效进一步提高。
[0342]
一种广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳 米抗体复合抗体的应用，采用(六)制备的广谱抗冠状病毒保守表位igy和 抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体制得，将几种不同功能和 特点的抗体混合组成复合抗体，结合不同抗体的协同作用达到最佳的效果， 不但可以预防冠状病毒感染，还可治疗受感染的患者特别是治疗对群体防疫 造成极大困扰的无症状感染者；联合用药，既可有效避免病毒的逃逸突变， 还可防止病毒变异导致的药效减弱或消失。使用多种个抗体组合的另一优势 是它们往往有协同效应，也就是说，它们产生中和作用的总剂量要比其中任 何一个抗体药单独使用的剂量低，从而降低用药成本，因此用于制备防治新 型冠病毒感染和新型冠病毒肺炎的药物、消毒产品、保健品或医疗器械和检 测试剂盒，
[0343]
一种广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗冠状病毒糖基化抗原igy以及纳 米抗体复合抗体制剂，采用(六)制备的广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗 冠状病毒糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体制成和/或加入辅料制成的稳 定制剂，复合抗体可直接制成稳定制剂，也可加入辅料制成稳定制剂；稳定 制剂为雾化剂、口喷剂、鼻喷剂、滴鼻剂、滴眼剂、中央空调雾化加湿填充 剂、空气消毒剂、室内外消毒剂、喷雾消毒剂、洗手液、粉剂、片剂、牙膏、 漱口水、口含片、口服液、口服剂、胶囊剂中的至少一种，但稳定制剂包括 但不限于以上制剂；辅料为赋形剂、填充剂、溶剂、膏体、助溶剂、表面活 性剂和胶囊辅料中一种或多种。
[0344]
本发明还提供了一种组合物，包括了广谱抗冠状病毒保守表位igy和抗 冠状病毒糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体溶液或干粉以及至少一种其 它药学上可接受的组分；还提供了上述的组合物在制备用于防治新冠病毒感 染和未来出现的冠状病毒感染及其引起的肺炎之药物、消毒产品、保健品或 医疗器械和检测试剂盒中的应用。
[0345]
实施本发明的广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米 抗体复合抗体及其制剂，应用于防治冠状病毒、新型冠病毒感染和未来可能 出现的冠状病毒感染及其引起的肺炎，具有以下创新性，并可带来以下有益 效果：
[0346]
1.由于本发明研制的广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体瞄准了所有冠状 病毒共有的保守表位，不管今后冠状病毒如何变异，这种广谱抗新冠病毒保 守表位igy都能对付它。另外，本发明的广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体 及其产品不但可以预防，还可治疗受感染的患者特别是治疗对群体防疫造成 极大困扰的无症状感染者。如果将本发明的广谱抗新冠病毒保守表位igy抗 体系列产品作为世界各国的战略储备，一旦发生疫情，只需人手分发一支广 谱抗新冠病毒保守表位igy抗体喷雾剂和手持雾化器，并在所有公共场所中 央空调中加入这种抗体的雾化剂清除空气中的冠状病毒，就可以迅速将疫情 扑灭在萌芽期。未来发生新一轮和多轮冠状病毒传播和疫情爆发是不以人的 意志转移的事，对于这一点，世界许多顶尖级科学家都早已发出警告；因此， 这种广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体
以及各种复合抗体不但有助于抗击这 场疫情以度过目前的危机，还完全有必要列入世界各国公共卫生战略储备物 质清单，成为人类对付将来未知的冠状病毒传染疫情的有力武器，避免人类 在因新的冠状病毒感染爆发时导致巨大的社会成本；从而，给世界带来福音。 因此，具有重大的社会意义和经济意义。
[0347]
2.鉴于新冠病毒高度糖基化是“免疫逃逸”的根本原因，而且这是原始 毒株和不断出现的变异毒株都固有的特性；因此，如果不从源头上解决糖基 化问题，是不可能解决“免疫逃逃”问题的。本发明在深入剖析新冠病毒结 构的基础上，选择糖基化s和s-rbd这个关键靶标，合成一种特别的、具有天 然糖基化水平的糖基化位点抗原成份，将其应用到抗新冠病毒igy抗体中，创 新研制一种抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体，解开了因新冠病毒高度糖基化而 使普通新冠抗体药减效或失效的死结，从根源上解决新冠病毒容易“免疫逃 逸”而影响新冠抗体药疗效的难题；从而，显著提高所研制的抗新冠病毒igy 抗体的疗效。另外，本发明选择n-连接糖基化位点中保守的18个糖基化位点 的糖基化s蛋白作为靶标，还可增强所研制的抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体 的抗变异能力。
[0348]
3.本发明研制的广谱抗新冠病毒保守表位igy和抗新冠病毒糖基化抗原 igy复合抗体以及抗新型冠状病毒纳米抗体及其组合抗体可以常温存储和外 用，可采用喷雾或雾化吸入方式将高浓度抗体直接作用在新冠病毒聚集的咽 喉和肺泡处，比注射到体内进入血液循环的施药方式更精准高效和安全。
[0349]
4.本发明的广谱抗新冠病毒保守表位igy和抗新冠病毒糖基化抗原igy 复合抗体以及抗新冠病毒纳米抗体及其组合抗体除了可制成各种制剂用于防 治新冠病毒感染和未来出现的冠状病毒感染及其引起的肺炎外，还特别的可 用于中央空调杀灭新冠病毒、净化空气。具体做法是将广谱抗新冠病毒保守 表位igy和抗新冠病毒糖基化抗原igy复合抗体以及抗新冠病毒纳米抗体及 其组合抗体单一使用或组合使用，按一定比例添加到中央空调加湿器的水 中，充分搅拌均匀，再经过雾化后与空调新风混合输送入室内。这样，一方 面，室内的人就不会被室内可能散布的新冠病毒感染了；另一方面，空调系 统排放到室外的空气中也就不会残留新冠病毒了；从而，既有效防止室内的 人感染新冠病毒，又避免空调废气将新冠病毒排放到室外空间而造成疫情扩 散。由于igy是国际公认的天然安全物质，美国食品医药管理局(fda)已将igy 列入「一般公认安全物质(generally accepted as safe,gras)」范畴，人 体吸入igy不但没有任何毒副作用，而且，鉴于igy是一种天然成份的免疫 球蛋白，吸入体内还能增强免疫力；这是酒精和其它化学消毒剂完全不可相 提并论的。值得高度重视的是：我国这次再度出现零散疫情，其中有不少就 是由于国际机场的空调排气系统将海外旅客呼出的毒株播撒到机场周边村庄 或住宅而酿成的。在所有机场特别是国际机场采用本发明的广谱抗新冠病毒 保守表位igy和抗新冠病毒糖基化抗原igy复合抗体以及抗新冠病毒纳米抗 体及其组合抗体的雾化剂加入中央空调系统或空调器柜或移动喷雾消毒器 中，杀灭空气中散布的新冠病毒、彻底净化机场内空气，是阻止海外流行的 传染性更强的新冠病毒在我国传播，杜绝这种悲剧重演的有力措施。
[0350]
5.无症状感染者在人群中难于发现，其导致的传播也很难预防。及时治 疗无症状新冠患者对控制新冠的传播至关重要。本发明研制的广谱抗新冠病 毒保守表位igy和抗新冠病毒糖基化抗原igy复合抗体以及抗新冠病毒纳米 抗体及其组合抗体的雾化装置为治疗无症状感染者提供了一条捷径。这样， 无症状感染者不必住院治疗，只要居家隔离，定时
自助使用手持的igy抗体 超声雾化仪吸入广谱抗新冠病毒保守表位igy和抗新冠病毒糖基化抗原igy 复合抗体以及抗新冠病毒纳米抗体及其组合抗体，清除咽喉和呼吸道及肺部 的新冠病毒，就可轻松自如地实现阳转阴。
[0351]
6.鉴于禽类与以人为代表的哺乳动物亲缘关系较远，采用igy抗体防治 新冠肺炎有利于疾病控制；不会将疾病的病原微生物引入到病人的体内，可 以解决治疗上的后顾之忧。
[0352]
7.将本发明的广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体用于免疫学检测，特别 是用于冠状病毒载量和抗体的检测，一方面检测范围广，既可检测人类感染 的各种亚型冠状病毒，也可检测动物感染的各种亚型冠状病毒；另一方面， 由于哺乳动物igg抗体会激活人类的补体系统引起免疫检测中的干扰，而igy 抗体不会激活人的补体系统，因此，可以减少干扰，获得比采用传统的哺乳 动物igg抗体更准确的检测结果。
[0353]
下面结合试验例和实施例，对本发明的广谱抗冠状病毒保守表位抗原和 糖基化抗原igy以及纳米抗体复合抗体及其组合抗体的具体实施应用作进一 步说明。
[0354]
试验例1
[0355]
广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体对冠状病毒的s蛋白c末端的通用保 守域ucd的124氨基酸序列保守抗原表位抗原、冠状病毒共有的wdypkcdra 片段保守抗原表位抗原、冠状病毒rna定向rna聚合酶保守抗原表位蛋白抗 原的抗体结合效价检测。
[0356]
分别选择复合冠状病毒通用保守表位抗原和冠状病毒s蛋白通用保守域 ucd中共有的drlitgrl片段保守抗原表位抗原以及冠状病毒共有的 wdypkcdra片段多肽抗原和冠状病毒rna定向rna聚合酶保守表位抗原，用
ꢀ“
elisa”方法(酶联免疫法)检测所制得的广谱抗新冠病毒保守表位igy和 抗新冠病毒糖基化抗原igy复合抗体的抗体结合效价，结果如下表所示：
[0357][0358]
注：测试样本中的广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体溶液浓度为1mg/ml。
[0359]
从以上检测结果可看出，所制备的广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体对 相对应的冠状病毒的s蛋白c末端的通用保守域ucd的124氨基酸序列保守 抗原表位抗原、冠状病毒共有的wdypkcdra片段保守抗原表位抗原、冠状病 毒rna定向rna聚合酶保守抗原表位蛋白抗原都有很高的抗体结合效价。
[0360]
试验例2。
[0361]
广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体对灭活的sars病毒和原始新冠病毒以 及变异新冠病毒毒株的抗体结合效价检测。
[0362]
分别选择：(1)sars冠状病毒株、(2)原始新冠病毒、(3)德尔塔新冠病毒 毒株，用“elisa”方法(酶联免疫法)检测所制得的广谱抗新冠病毒保守表 位igy的抗体效价，结果如下表所示。
[0363]
[0364]
注：测试样本中的广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体溶液浓度为1mg/ml。
[0365]
从以上检测结果可看出，所制备的广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体对 sars病毒和原始新冠病毒以及德尔塔新冠病毒毒株都有很高的抗体结合效 价。
[0366]
试验例3：
[0367]
抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体对两种不同的冠状病毒糖基化s蛋白抗 原和一种冠状病毒糖基化s-rbd蛋白抗原的抗体结合效价检测。
[0368]
分别选择两种冠状病毒糖基化抗原和一种复合冠状病毒糖基化抗原，用
ꢀ“
elisa”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗新冠病毒糖基化抗原igy的抗 体结合效价，结果如下表所示：
[0369][0370]
注：测试样本中的抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体溶液浓度为1mg/ml。
[0371]
从以上检测结果可看出，所制备的抗新冠病毒糖基化抗原igy抗体对相 对应的至少包含有22个n-连接糖基化位点和至少2个o-连接糖基化位点的 糖基化s蛋白和包含22个n-连接糖基化位点中保守的18个糖基化位点的糖 基化s蛋白以及至少包含t323、n331、n343糖基化位点在内的至少1种不同 糖型的s-rbd蛋白都有很高的抗体结合效价。
[0372]
试验例4
[0373]
广谱抗新冠病毒保守表位igy抗体中和新冠病毒活病毒株的试验。
[0374]
采用先进的蚀斑法中和病毒试验测定。
[0375]
设「广谱抗新冠病毒保守表位igy」、病毒对照、正常细胞对照。
[0376]
方法：基于斑点半数减少实验(50％focus reduction neutralizationtest,frnt50)检测igy中和滴度，绘制抗体中和能力曲线计算ic50。
[0377]
实验内容：
[0378]
1.实验毒株和细胞
[0379]
新冠病毒毒株(sars-cov-2/human/chn/iqtco 1/2020毒株)，vero e6 细胞。
[0380]
2.测试方法
[0381]
2.1细胞铺板
[0382]
在bsl-2实验室准备vero e6细胞，96孔细胞培养板2*104cells/well。 置于细胞培养箱内培养18h。
[0383]
2.2抗体稀释
[0384]
选用dmem培养基(含有2％fbs)稀释待测广谱抗新冠病毒保守表位igy 抗体，起始抗体浓度为100ug/ml，3倍梯度稀释，共计12个稀释度。
[0385]
2.3病毒中和检测
[0386]
3.测试结果
[0387]
本实验设置待测抗体中和作用浓度为100ug/ml、33.3ug/ml、11.1 ug/ml、3.7ug/ml、1.23ug/ml、0.41ug/ml、0.137/ugl》0.0457ug/ml、 0.0152p/ml、0.0051/ug/ml、0.0017ug/ml、0.00057ug/ml。根据试验结果 显示，在100ug/ml至1.23ug/ml浓度之间具有明显的中和效果。
[0388]
试验结论：通过frnt50试验证明广谱抗新冠病毒保守表位igy具有抗新 冠病毒的中和作用，经过抑制率曲线拟合得出ic50为0.52ug/ml。
[0389]
实施例1
[0390]
生产用于中央空调的广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以 及纳米抗体复合抗体雾化剂。复合抗体中的纳米抗体(抗新冠病毒纳米抗体) 采用现有技术免疫羊鸵制得。
[0391]
将这种雾化剂按一定比例添加到中央空调加湿器的水中，充分搅拌均 匀，再经过雾化后与空调新风混合输送入室内，达到杀灭室内空气中可能存 在的新冠病毒的效果。配方如下表。
[0392][0393]
工艺：
[0394]
(1)将配方量医药级甘油用紫外光照射灭菌消毒24小时，无菌密封备用；
[0395]
(2)按配方量蒸馏水加热至至90℃，保持10分钟，再冷却至60℃，然 后加入医药级甘油，，低速揽拌60分钟至充分溶解；然后，冷却至室温，形 成溶液a；
[0396]
(3)一边搅拌一边将广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以 及纳米抗
体复合抗体溶液或干粉加入溶液a中，低速搅拌60min，直至完全混 合均匀，得溶液b；
[0397]
(4)用ph计测量溶液b的ph值，用柠檬酸调节ph值至6.8
±
0.1；
[0398]
(5)静置至上部泡沫全部消溶后，再将溶液b分装在清洗消毒过的塑料 桶中，贴上标签出厂。
[0399]
实施例2
[0400]
生产广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合 抗体雾化剂。复合抗体中的纳米抗体(抗新冠病毒纳米抗体)采用现有技术 制得。
[0401]
用于各种雾化吸入机和公共环境空气消毒机、空气清新器和家庭用空气 消毒器、空气清新器以及手持雾化器。配方如下表：
[0402][0403]
工艺：
[0404]
(1)将配方量k-30、s-40、吐温-80、薄荷油、香精用紫外光照射灭菌 消毒24小时，无菌密封备用；
[0405]
(2)按配方量蒸馏水加热至至90℃，保持10分钟，然后分别加入s-40 和k-30分散剂，搅拌30分钟以上，溶解均匀；再冷却至60℃，分别缓慢加 入吐温(滴加)和薄荷油以及甘油(滴加)，低速揽拌60分钟至充分溶解； 然后，冷却至室温，形成溶液a；
[0406]
(3)一边搅拌一边将广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以 及纳米抗体复合抗体溶液或干粉加入溶液a中，低速搅拌60min，直至完全混 合均匀，得溶液b；
[0407]
(4)一边搅拌一边将香精加入溶液b中，低速搅拌60min，直至完全溶解， 得溶液c；
[0408]
(5)用ph计测量溶液c的ph值，用柠檬酸调节ph值至6.8
±
0.1；
[0409]
(6)静置至上部泡沫全部消溶后，再将溶液c分装在清洗消毒过的喷雾 瓶或雾化器中，贴上标签出厂。
[0410]
实施例3
[0411]
生产广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合 抗体及其制剂鼻喷剂或滴鼻剂或滴眼剂。复合抗体中的纳米抗体(抗新冠病 毒纳米抗体)采用现有技术制得。
[0412]
配方如下表
[0413][0414][0415]
工艺：
[0416]
(1)将配方量k-30、s-40、吐温-80、薄荷油、香精用紫外光照射灭菌 消毒24小时，无菌密封备用；
[0417]
(2)按配方量蒸馏水加热至至90℃，再分别加入s-40和k-30分散剂， 搅拌30分钟以上，溶解均匀；再冷却至60℃，分别缓慢加入吐温(滴加)和 薄荷油以及甘油(滴加)，低速揽拌60分钟至充分溶解；然后，冷却至室温， 形成溶液a；
[0418]
(3)一边搅拌一边将广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以 及纳米抗体复合抗体溶液或干粉加入溶液a中，低速搅拌60min，直至完全混 合均匀，得溶液b；
[0419]
(4)一边搅拌一边将香精加入溶液b中，低速搅拌60min，直至完全溶解， 得溶液c；
[0420]
(5)用ph计测量溶液c的ph值，用柠檬酸调节ph值至6.8
±
0.1；
[0421]
(6)静置至上部泡沫全部消溶后，再将溶液c分装在清洗消毒过的滴鼻 器或滴眼器以及鼻用喷雾瓶中，贴上标签出厂。
[0422]
实施例4
[0423]
生产广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合 抗体口喷剂或漱口水。复合抗体中的纳米抗体(抗新冠病毒纳米抗体)采用 现有技术制得。
[0424]
配方如下表。
[0425][0426][0427]
工艺：
[0428]
(1)将配方量k-30、s-40、吐温-80、薄荷油、香精用紫外光照射灭菌 消毒24小时，无菌密封备用；
[0429]
(2)按配方量蒸馏水加热至至90℃，再分别加入s-40和k-30分散剂， 搅拌30分钟以上，溶解均匀；再冷却至60℃，分别缓慢加入吐温(滴加)和 薄荷油以及甘油(滴加)，低速揽拌60分钟至充分溶解；然后，冷却至室温， 形成溶液a；
[0430]
(3)一边搅拌一边将广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以 及纳米抗体复合抗体溶液或干粉加入溶液a中，低速搅拌60min，直至完全混 合均匀，得溶液b；
[0431]
(4)一边搅拌一边将香精加入溶液b中，低速搅拌60min，直至完全溶解， 得溶液c；
[0432]
(5)用ph计测量溶液c的ph值，用柠檬酸调节ph值至6.8
±
0.1；
[0433]
(6)静置至上部泡沫全部消溶后，再将溶液c分装在清洗消毒过的口腔 用喷雾罐或漱口瓶中，贴上标签出厂。
[0434]
实施例5
[0435]
生产广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合 抗体洗手液。复合抗体中的纳米抗体(抗新冠病毒纳米抗体)采用现有技术 制得。
[0436]
配方如下表
[0437][0438]
工艺：
[0439]
(1)将配方量海藻精华、医药级甘油、薄荷油、香精以及403、503发泡 剂用紫外光照射灭菌消毒24小时，无菌密封备用；
[0440]
(2)将配方量蒸馏水加热至90℃，停留15分钟；再冷却至60℃，一边 搅拌一边先后加入海藻精华和医药级甘油，低速揽拌30分钟，直至完全溶解， 冷却至室温，得溶液a；
[0441]
(3)一边搅拌一边将香精(玫瑰花香精)加入溶液a中，低速搅拌60min， 直至完全溶解，得溶液b；
[0442]
(4)将403加热至80℃，然后一边搅拌一边将503徐徐滴加入到403中， 低速搅拌30min，得到溶液c；
[0443]
(5)保持溶液c温度在80℃，一边搅拌一边将薄荷油徐徐滴加入到溶液 c中，低速搅拌60min，得到溶液d；
[0444]
(6)将溶液d加热至90℃高温灭菌5min，然后冷却至室温；
[0445]
(7)一边搅拌一边将溶液b缓慢地加到溶液d中，低速搅拌60min；如未 形成均质稳定的乳状溶液，则需延长搅拌时间，制得溶液e；
[0446]
(8)一边搅拌一边将广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以 及纳米抗体复合抗体溶液或干粉缓慢地加到溶液e中，低速搅拌60min；如未 形成均质稳定的乳状溶液，则需延长搅拌时间，制得溶液f；
[0447]
(9)用ph计测量溶液f的ph值，采用柠檬酸或ph4.5磷酸氢二钠
–
柠 檬酸缓冲液调节ph值至4.5
±
0.1；
[0448]
(10)静置一夜，直至上部泡沫全部消溶后，再将溶液f液分装在清洗消 毒过的洗手液容器中，贴上标签出厂。
[0449]
实施例6
[0450]
生产广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合 抗体口含片。复合抗体中的抗新冠病毒纳米抗体采用现有技术制得。
[0451]
配比如下表
[0452][0453][0454]
工艺：
[0455]
(1)山梨糖醇过60目筛两次备用；
[0456]
(2)羧甲基纤维素分散于30％乙醇中制成1％乙醇溶液；
[0457]
(3)将(1)项用适量(2)项制软材，14目筛网制粒，60℃通风干燥， 18目筛整粒；用40目筛筛出适量细粉与广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基 化抗原igy以及纳米抗体复合抗体干粉充分混匀；
[0458]
(4)再拌入硬脂酸镁，一起与整批颗粒混合均匀，密闭4小时以上；
[0459]
(5)压片机压片，每片600mg；
[0460]
(6)检验合格后，包装，全验出厂。
[0461]
实施例7
[0462]
生产广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米抗体复合 抗体粉剂，供粉未雾化装置作药用粉剂。组合抗体中的纳米抗体(抗新冠病 毒纳米抗体)采用现有技术制得。
[0463]
配方如下表
[0464]
[0465]
工艺：
[0466]
(1)将配方量广谱抗冠状病毒保守表位抗原和糖基化抗原igy以及纳米 抗体复合抗体干粉和配方量药用葡萄糖混合，充分搅拌均匀；
[0467]
(2)将粉剂分装，检验出厂。
[0468]
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[0469]
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