一种编码MITF基因突变体的核酸及其应用的制作方法

一种编码mitf基因突变体的核酸及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种编码mitf基因突变体的核酸及其应用。


背景技术：

2.耳聋(hearing loss,hl)是最常见的感官功能障碍类疾病，相当一部分的耳聋患者的发病与遗传因素有关。通过基因检测手段确定耳聋发病的分子机制，从而进一步采取产前基因诊断和干预措施，是降低耳聋发生率的有效手段，也是耳聋防治的根本途径之一。根据是否有并发的其他临床表型，遗传性耳聋可分为综合征型耳聋(syndromic hearing loss,shl)和非综合征型耳聋(non-syndromic hearing loss,nshl)。
3.综合征型耳聋在先天性遗传性耳聋中占比30％左右，由不同致病基因导致的综合征型耳聋在发病年龄、听力损失程度、进行性等方面存在明显差异。确定耳聋发病的致病基因有助于为患者选取合适的听力干预手段，更好地提高耳聋患者的生活质量。
4.mitf基因位于3p13区域，包括9个外显子。mitf基因突变会导致waardenburg综合症2a型和tietz albinism-deafness综合征，临床表型包括耳聋，色素沉着异常(头发，皮肤，眼睛)。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种编码mitf基因突变体的核酸，其为一个尚未公开的遗传性耳聋致病突变，可作为耳聋筛查产品的候选筛查位点开发诊断试剂盒、诊断芯片等，可增加临床突变数据库数据量。
6.第一方面，本发明要求保护一种核酸。
7.本发明要求保护的核酸与野生型mitf基因(cdna)相比，具有c.481c》t突变。
8.进一步地，所述核酸为dna。
9.进一步地，所述核酸除了第481位核苷酸以外，其他部分与所述野生型mitf基因(cdna)的序列相同。
10.所述野生型mitf基因(cdna)如genbank登录号为nm_000248.4(up date:pri 31-oct-2021)的第132-1391位所示。
11.本发明要求保护的所述核酸的序列具体如seq id no.1所示(即具有c.481c》t突变位点的mitf基因的cdna)。
12.第二方面，本发明要求保护一种蛋白。
13.本发明要求保护的蛋白与由野生型mitf基因表达的蛋白相比，在氨基酸161位置发生了编码蛋白提前终止(即p.gln161ter)。
14.即，本发明请求保护的所述蛋白的氨基酸序列为所述由野生型mitf基因(cdna)表达的氨基酸的第1-160位。
15.本发明请求保护的所述蛋白的氨基酸序列具体如seq id no.2所示。
16.第三方面，本发明要求保护用于检测前文第一方面中所述的核酸或前文第二方面
中所述的蛋白的试剂在制备试剂盒中的用途；所述试剂盒用于诊断或筛查综合征型耳聋。
17.进一步地，所述综合征型耳聋为常染色体显性综合征型耳聋。
18.更进一步地，所述常染色体显性综合征型耳聋由mitf基因cdna序列的第481位由c突变为t所引起
19.进一步地，所述试剂可为抗体、探针、引物对和质谱检测试剂等中的至少一种。
20.所述试剂可为：能够与所述蛋白特异性结合的物质(如能够特异性检测所述蛋白的抗体)；或者，能够特异性扩增所述核酸的引物对和/或探针。
21.更进一步地，所述引物对中的上游引物根据seq id no.5的第252位上游的序列设计得到，下游引物根据seq id no.5的第252位下游的序列设计得到(用于以基因组dna作为模板使用)。
22.在本发明的具体实施方式中，所述引物对中的上游引物的序列如seq id no.3所示，下游引物的序列如seq id no.4所示(以基因组dna作为模板使用)。
23.第四方面，本发明要求保护一种构建体。
24.本发明要求保护的构建体包含前文第一方面中所述的核酸。
25.所述构建体具体可指携带有所述核酸的表达盒或者重组载体。
26.第五方面，本发明要求保护一种重组细胞。
27.本发明要求保护的重组细胞是通过将前文第四方面中所述的构建体转化受体细胞或者在受体细胞中表达前文第二方面中所述蛋白而获得的。
28.第六方面，本发明要求保护一种用于诊断或筛查综合征型耳聋的试剂盒。
29.本发明要求保护的用于诊断或筛查综合征型耳聋的试剂盒，包括用于检测前文第一方面中所述的核酸的试剂，和/或用于检测前文第二方面中所述的蛋白的试剂。
30.进一步地，所述综合征型耳聋为常染色体显性综合征型耳聋。
31.更进一步地，所述常染色体显性综合征型耳聋由野生型mitf基因(cdna)发生c.481c》t突变所引起。
32.进一步地，所述试剂可为抗体、探针、引物对和质谱检测试剂等中的至少一种。
33.所述试剂可为：能够与所述蛋白特异性结合的物质(如能够特异性检测所述蛋白的抗体)；或者，能够特异性扩增所述核酸的引物对和/或探针。
34.更进一步地，所述引物对中的上游引物根据seq id no.5的第252位上游的序列设计得到，下游引物根据seq id no.5的第252位下游的序列设计得到(用于以基因组dna作为模板使用)。
35.在本发明的具体实施方式中，所述引物对中的上游引物的序列如seq id no.3所示，下游引物的序列如seq id no.4所示(以基因组dna作为模板使用)。
36.第七方面，本发明要求保护生物模型在筛选药物中的用途。
37.所述生物模型携带下列至少之一：
38.(1)前文第一方面中所述核酸；
39.(2)前文第二方面中所述蛋白。
40.进一步地，所述生物模型可为细胞模型或者动物模型。
41.进一步地，所述药物可为治疗综合征型耳聋的药物。
42.更进一步地，所述综合征型耳聋为常染色体显性综合征型耳聋。
43.更加具体地，所述常染色体显性综合征型耳聋由野生型mitf基因(cdna)发生c.481c》t突变所引起。
44.第八方面，本发明要求保护一种用于诊断或筛查综合征型耳聋的系统。
45.本发明要求保护的用于诊断或筛查综合征型耳聋的系统，可包括：
46.(a1)用于检测前文第一方面中所述的核酸的试剂，和/或用于检测前文第二方面中所述的蛋白的试剂；
47.进一步地，所述试剂可为抗体、探针、引物对和质谱检测试剂等中的至少一种。
48.所述试剂可为：能够与所述蛋白特异性结合的物质(如能够特异性检测所述蛋白的抗体)；或者，能够特异性扩增所述核酸的引物对和/或探针。
49.更进一步地，所述引物对中的上游引物根据seq id no.5的第252位上游的序列设计得到，下游引物根据seq id no.5的第252位下游的序列设计得到(用于以基因组dna作为模板使用)。
50.在本发明的具体实施方式中，所述引物对中的上游引物的序列如seq id no.3所示，下游引物的序列如seq id no.4所示(以基因组dna作为模板使用)。
51.(a2)装置，包括数据输入模块、数据处理及结论输出模块；
52.所述数据输入模块被配置为采集(a1)检测得到的待测者的“mitf基因是否发生c.481c》t突变”的结果数据；或者“由mitf基因表达的蛋白是否发生p.gln161ter”的结果数据；
53.所述数据处理及结论输出模块被配置为接收来自于所述数据输入模块发送的所述结果数据，并按照如下输出结论：
54.若所述待测者的mitf基因发生c.481c》t突变，则所述待测者为或候选为综合征型耳聋；或
55.若所述待测者的由mitf基因表达的蛋白发生p.gln161ter突变，则所述待测者为或候选为综合征型耳聋。
56.进一步地，所述综合征型耳聋为常染色体显性综合征型耳聋。
57.更进一步地，所述常染色体显性综合征型耳聋由野生型mitf基因(cdna)发生c.481c》t突变所引起。
58.第九方面，本发明要求保护能够使前文第一方面中所述的核酸回复突变的物质在制备用于治疗综合征型耳聋的产品中的应用。
59.进一步地，所述综合征型耳聋为常染色体显性综合征型耳聋。
60.更进一步地，所述常染色体显性综合征型耳聋由野生型mitf基因(cdna)发生c.481c》t突变所引起。
61.本发明发现了常染色体显性耳聋致病基因mitf的1个新的致病突变(c.481c》t)，该突变位点可用于常染色体显性耳聋患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简便、早期诊断率高，检测结果可以为常染色体显性耳聋的早期诊断、鉴别诊断及药物治疗提供科学依据。
附图说明
62.图1为本发明中1个显性遗传综合型耳聋trio家系。该家系包含3名成员，女儿为耳
聋患者(即家系图中的ii-1)，父母为正常人(即家系图中的i-1、i-2)，其中，实心图标为患者，箭头所指为先证者。
63.图2为患者家系中患者的听力图结果。横坐标表示听力的频率，纵坐标表示听力级别。
64.图3为患者家系中所有家系成员的mitf基因的c.481c》t突变位点的代表性sanger测序验证峰图。患者为mitfc.481c》t突变的杂合携带者，患者父亲和母亲都未携带该变异。
具体实施方式
65.本发明针对自行收集的一例耳聋trio家系(父母+先证者)，通过全外显子测序、家系分析联合sanger测序验证的方法进行致病变异检测和验证。最终，根据各项检测结果，本发明确定了1个新的致病突变位点——mitf基因的c.481c》t突变，导致了常染色体显性综合征型耳聋的发生。
66.全外显子测序(whole-exome sequencing，wes)是应用频率最高的基因组测序方法。外显子是人基因组的蛋白编码区域，利用序列捕获技术可以将其dna捕获并且富集。虽然外显子区域仅占全基因组1％左右，却包含了85％的致病突变。相比全基因组测序，全外显子测序更加经济、高效。外显子组测序主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及utr区域内的突变。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得突变与疾病的关系。
67.下述实施例中野生型mitf基因的dna序列(例如内含子序列、外显子序列等)、rna序列、编码蛋白信息等有关该野生型mitf基因的信息均在ncbi数据库中有收录，可以参考下述网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_000072.7？report＝genbank&from＝97783966&to＝97998321。
68.野生型mitf基因的cdna序列参见genbank登录号为nm_000248.4(up date:pri 31-oct-2021)的第132-1391位所示。
69.c.481c》t突变指野生型mitf基因的cdna序列的第481位由c突变为t，突变后的mitf基因的序列具体如seq id no.1所示，第481位为突变位点(即具有c.481c》t突变位点的mitf基因的cdna)。seq id no.1编码seq id no.2所示蛋白(即突变后的mitf蛋白)。
70.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
71.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
72.实施例1、确定常染色体显性耳聋致病突变
73.1、样本搜集
74.本发明搜集一个中国汉族耳聋患者trio家系(父母+先证者)，其家系图见图1。如图1所示，该家系包含3名成员，女儿为表现为耳聋和左侧虹膜颜色深(即家系图中的ii-1)、父母为正常人(即家系图中的i-1、i-2)。其中，实心图标为患者，箭头所指为先证者。
75.该家系中患者的听力结果见图2。在图2中，横坐标表示听力的频率，纵坐标表示听
力级别，如果听力正常，阈值曲线应该是在0附近浮动。如图2所示，听力图提示患者ii-1双耳极重度耳聋。
76.本发明收集了该家系内所有成员的外周血样本，加入edta抗凝，-80℃保存。所有血液样本均已签属知情同意书。
77.2、dna提取
78.取上述家系所有成员的外周血，分别利用qiampbloodkit(qiagen,hilden,germany)抽提外周血白细胞的基因组dna，并利用qubitfluorometer和琼脂糖凝胶电泳测量dna的浓度及纯度，所得的每个标本基因组dnaod260/od280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于50纳克/微升，总量不少于3微克。
79.3、捕获测序
80.利用agilent等液相捕获系统，结合illumina hiseq2500的高通量测序技术，对所有家系成员的样本进行测序。捕获范围包括全基因组外显子区域(约占全基因组1％)，捕获区域总长可达50m，测序数据量10-12gb，100
×
有效测序深度。主要步骤包括打断、文库制备和上机测序。
81.测序数据下机后，使用内部定制流程进行突变检测、注释以及数据库比对，根据人群频率、软件预测结果、家系分析等手段，确定候选致病位点。
82.结果：与父亲和母亲相比，患者的全外显子组测序结果中，仅仅是在患者的mitf基因上发现单杂合的c.481c》t突变。家系分析显示，患者的父亲和母亲均未携带该突变，提示该突变为新发突变。
83.若mitf基因的c.481c》t突变经sanger验证为真阳性，则可确认该突变为患者的耳聋致病原因。
84.实施例2、sanger法测序验证
85.分别对实施例1中所述的常染色体显性综合型耳聋患者家系中的所有家系成员(包括患者和听力正常的父母)的mitf基因进行检测：针对mitf基因c.481c》t突变设计引物，然后通过pcr扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定序列检测结果属于突变型还是野生型，验证mitf基因的c.481c》t突变是否在样本中检出。
86.具体步骤如下：
87.1、dna提取
88.按照实施例1所述的dna提取方法，提取受试者外周静脉血中的基因组dna备用。
89.2、引物设计及pcr反应
90.首先，参考人类基因组参考序列grch37/hg19，针对mitf基因的c.481c》t突变设计特异性引物，具体序列如下：
91.上游引物：5
’‑
gcctcaaagggaactggttg-3’(seq id no.3)；
92.下游引物：5
’‑
acatgcagtaatggtggccc-3’(seq id no.4)。
93.然后，按照以下配比配制各dna样本的pcr反应体系(表1)以及反应条件(表2)进行pcr反应。
94.表1、反应体系(20μl)
95.试剂名称单个反应标准量(μl)ddh2o12.8
10
×
buffer2.0dntp(2.5mm)2.0上游引物(10pmol)1.0下游引物(10pmol)1.0taq酶(5u/μl)0.2dna模板1.0总量20.0
96.表2、pcr反应条件
[0097][0098]
由此，获得各受试者基因组dna样本的pcr扩增产物。
[0099]
3、sanger测序
[0100]
将步骤2得到的pcr产物经纯化后，直接进行dna测序，测序使用abi3730xl型测序仪进行正反向测序。
[0101]
基于测序结果，如图3所示，在所示的常染色体显性耳聋患者trio家系中，患者携带mitf基因c.481c》t突变(发生突变后的扩增产物的序列如seq id no.5所示，第252位为突变位点)，听力正常的父亲和母亲都未检出该突变，提示为新发变异。
[0102]
结合以上信息，可以确认mitf基因的c.481c》t突变是导致患者ii-1耳聋的致病原因。
[0103]
实施例3、检测试剂盒
[0104]
制备检测试剂盒，其包含能够检测mitf基因的c.481c》t突变的引物，用于诊断常染色体显性综合型耳聋的生物样品，其中，这些引物为mitf基因特异性引物，其序列如实施例2中seq id no.3和seq id no.4所示。
[0105]
利用上述试剂盒诊断常染色体显性综合型耳聋的生物样品的具体步骤为：
[0106]
按照实施例1的步骤2所述的方法提取待测者dna，以所提取的dna为模板，利用上述mitf基因的特异性引物进行pcr反应(pcr反应体系和反应条件可参见实施例2)，并按照本领域常规方法对pcr产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.481c》t突变(如果mitf基因携带c.481c》t突变则待测者患有患常染色体显性综合型耳聋)，能够有效地检测本发明的mitf基因突变体在待测者dna中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否患常染色体显性综合型耳聋。
[0107]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。