一种蚕豆苷的分离纯化方法及其产品和应用与流程

1.本发明涉及水产功能性饲料技术领域，特别涉及一种蚕豆苷的分离纯化方法及其产品和应用。


背景技术：

2.蚕豆是一类豆科植物，近年来在食品加工中发展较为迅速。蚕豆是富含蛋白、矿物质、维生素的一种作物，是优质的营养来源之一。但是蚕豆中的抗营养因子会降低蚕豆营养成分的合理利用。现有很多处理方法已应用于蚕豆的加工和处理，其中去壳、浸泡、漂洗和发芽等几种方法可降低抗营养因子的含量。
3.研究表明，蚕豆作为单一的摄食来源显著改善鱼类肌肉口感，特别是具有“脆”的特性。草鱼投喂蚕豆100天后，其肌肉硬度增加，胶原蛋白含量升高，具有“脆”的肌肉特性，这种脆化后的草鱼被称为“脆肉鲩”。极大地增加了草鱼养殖的经济效益，但是研究也表明蚕豆在改善肌肉特性的同时也有一定缺陷：(1)蚕豆缺乏部分氨基酸或者部分氨基酸含量不足还有抗营养因子等造成鱼类生长率低；(2)蚕豆含有一些抗营养成分如蛋白酶和淀粉酶抑制剂、蚕豆嘧啶葡糖苷、伴蚕豆嘧啶核苷、植酸盐等可能会引起肠道炎症；(3)蚕豆会引起溶血及氧化损伤等问题。因此，如何去减少或消除以上缺陷，是解决蚕豆作为肌肉品质改良中的应用的关键之所在。
4.目前，已有学者通过添加蚕豆粉、蚕豆浓缩蛋白和蚕豆水-乙醇提物等制成提升鱼类品质的脆化配合饲料，但只有蚕豆粉脆化配合饲料具有脆化效果；然而蚕豆粉脆化配合饲料饲喂的鱼类生长率普遍较低，并且其中仍然含有对健康生长有不利影响的抗营养因子，因此，并不能满足脆化鱼类肌肉的同时实现快速生长的要求。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种蚕豆苷的分离纯化方法及其产品和应用。通过本发明的分离提纯方法得到的蚕豆苷，不仅能够保留蚕豆中脆化肌肉的功能性成分，有效提升鱼类品质，还能够最大限度地去除蚕豆中的抗营养因子。以其制备的蚕豆苷饲料饲喂鱼类，可对鱼类肌肉产生脆化作用，并提高鱼类生长性能，促进了水产功能性饲料的发展，对于开发营养价值高且具有特定功能的水产饲料有着重要的意义。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
7.本发明技术方案之一：提供一种蚕豆苷的分离纯化方法，包括以下步骤：
8.(1)将蚕豆粉与水混合，加可溶性金属氢氧化物溶液调节ph值至碱性，提取后过滤，滤液加酸调节ph值至酸性，过滤，除去滤液中溶剂，制得蚕豆水提取物；
9.(2)将步骤(1)所得蚕豆水提取物溶于水中，以离子交换树脂为填料进行柱层析，氨水溶液解析，解析液浓缩后加丙酮萃取，萃取液浓缩结晶，再以水为溶剂重结晶，所得结晶即为蚕豆苷。
10.优选地，步骤(1)中所述蚕豆粉为脱壳后蚕豆粉碎过60目筛的粉末。
11.优选地，步骤(1)中所述蚕豆粉与所述水的质量比为1:10～1:12；所述酸为盐酸溶液，更优选为4m的盐酸水溶液。
12.优选地，所述可溶性金属氢氧化物溶液为氢氧化钙的饱和水溶液。
13.优选地，步骤(1)所述调节ph值至碱性为调节ph值至8.8～9.2；所述调节ph值至酸性为调节ph值至4.5～5.0；所述提取为超声提取。
14.更优选地，所述超声提取的温度为45℃，时间为1h。
15.优选地，步骤(2)中所述氨水溶液的质量分数为0.5％。
16.更优选地，步骤(2)中所述蚕豆水提取物与所述水的质量体积比为100～300g:1l；所述柱层析时填料装量为径高比1:8～1:10，蚕豆水提取物水溶液上样量为3～5bv、流速为0.2～0.6bv/h，氨水溶液的用量为8～10bv、流速为0.7～1.1bv/h；所述丙酮萃取时丙酮与浓缩后解析液的体积比为3:1。
17.更优选地，步骤(2)中所述离子交换树脂为001
×
7阳离子交换树脂。
18.更优选地，步骤(2)中解析液浓缩后加丙酮萃取，萃取液浓缩结晶的具体操作步骤为：解析液浓缩100倍，加入丙酮振摇，5000rpm离心5min，分离上层溶液，浓缩至3～4ml，调节ph值至7.0，4℃静置24h以上，使之结晶，4℃下8000rpm离心10min，得蚕豆苷结晶。
19.优选地，步骤(2)中所述以水为溶剂重结晶，重结晶步骤包括：将步骤(2)中丙酮萃取液浓缩后的结晶加水溶解，浓度为1g/80ml，调节ph值至7.0，4℃静置24h以上，使之重新结晶。
20.本发明技术方案之二：提供一种根据上述蚕豆苷的分离纯化方法分离得到的蚕豆苷。
21.本发明技术方案之三，提供一种上述蚕豆苷在蚕豆苷饲料中的应用，所述的蚕豆苷饲料用于脆化鱼类肌肉。
22.优选地，所述蚕豆苷饲料的组分包括蚕豆苷和鱼类饲料，其中蚕豆苷与鱼类饲料的质量比为20:1000。
23.更优选地，所述蚕豆苷饲料的制备步骤为将蚕豆苷与鱼类饲料混合后，加入混合料质量20～30％的水，造粒、晾干、包装，得到蚕豆苷饲料。
24.草鱼长期摄食蚕豆可以使其肌肉品质发生改变，使其肌肉富有韧性、久煮不烂、耐咀嚼，然而由于蚕豆的营养成分不均衡且含有大量抗营养因子，长期饲喂蚕豆又会对鱼体的消化、代谢机能产生影响。蚕豆的氨基酸组成丰富，赖氨酸含量高于谷类3倍，其第一限制氨基酸是含硫氨基酸。此外，蚕豆的微量元素及维生素含量也较高，但因其含有较多的抗营养因子而限制了其利用范围，蚕豆水溶液提取物中可分离得到高分子量的缩合单宁及低分子量的多酚类化合物，其中缩合单宁是蚕豆中主要的抗营养因子。与此同时，发明人研究发现，蚕豆苷(蚕豆嘧啶葡糖苷，vicine)是导致草鱼肌肉品质发生改变的主要作用物质，在草鱼饲料中添加一定含量的蚕豆苷能够促使草鱼在保证生长性能和成活率的前提下改良其肌肉品质。
25.而本发明先用碱液超声处理蚕豆粉，碱性溶液和超声处理可以促进蚕豆粉的溶解，进而提高蚕豆水提物的提取率。同时尽管一些抗营养因子可溶于水，但是他们更容易与金属离子结合，因此本发明通过氢氧化物调节溶液ph值的同时引入金属离子，使抗营养因子更加容易与金属离子结合形成不溶性化合物，从而使这部分抗营养因子在水提过程中并
不是溶于水，而是作为沉淀残留在水中，并最终得以通过过滤除去。然后将滤液调节为酸性并沉淀过夜，旋蒸浓缩制得的蚕豆水提物，在最大限度地保留蚕豆脆化肌肉的功能性成分的同时去除了影响鱼类生长发育的抗营养因子。此外，本发明通过利用蚕豆苷的高极性的特点以及离子交换树脂对蚕豆苷的静态吸附作用，将蚕豆苷从上述蚕豆水提物中分离，并利用洗脱剂氨水溶液进行洗脱，最后加入丙酮进行离心，分离蚕豆苷和伴蚕豆苷，重结晶得到蚕豆苷晶体。
26.然后将提取的蚕豆苷晶体按照配方制作成蚕豆苷饲料，在作为鱼类饲料时，不仅可以提高鱼类对蚕豆脆化肌肉的的功能利用率，同时也避免了长期饲喂蚕豆所造成的鱼类消化、代谢功能的影响，提高鱼类生长性能。
27.本发明的有益技术效果如下：
28.本发明提供的分离提纯方法可有效分离去除除蚕豆苷外的其他物质，进而提取得到高纯度的蚕豆苷。
29.提取得到的蚕豆苷制成的蚕豆苷饲料，可以显著提高鱼类的肌肉硬度、咀嚼性和粘聚性、促进鱼类生长性能，这是在鱼类养殖中的创新应用。
具体实施方式
30.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
31.另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
32.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
33.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
34.实施例1
35.蚕豆苷的分离提纯：
36.(1)将20kg蚕豆的外壳用脱壳机进行去除，中药流水式粉碎机粉碎后过60目筛，得到蚕豆粉。
37.(2)饱和氢氧化钙溶液的制备：称取10g氢氧化钙固体倒入烧杯，加1000ml蒸馏水进行搅拌溶解，静止过夜放置后取上清液装入试剂瓶。
38.(3)4m氢氧化钠溶液的制备：称取160g氢氧化钠固体倒入烧杯，用蒸馏水溶解后静置至室温(25℃)，使用玻璃棒引流注入1000ml容量瓶中，洗涤烧杯和玻璃棒2至3次，将洗涤液引流注入容量瓶中，然后先容量瓶中加水至距离刻度线1到2厘米，使用胶头滴管滴加剩余蒸馏水至刻度线，盖上塞子摇匀，装入试剂瓶。
39.(4)4m盐酸制备：量取333ml浓盐酸(12mol/l)倒入烧杯，用蒸馏水溶解后静置至室
温(25℃)，用玻璃棒引流注入1000ml容量瓶，洗涤烧杯和玻璃棒2至3次，洗涤液也要引流注入容量瓶中，然后向容量瓶中加水至距离刻度线1至2厘米，改用胶头滴管滴加，直到液面与刻度线相平，盖上塞子摇匀，装入试剂瓶。
40.(5)0.5％氨水溶液的制备：量取20ml氨水(质量浓度为25％，可选择范围为25％～28％)倒入烧杯，用蒸馏水溶解后静置至室温(25℃)，用玻璃棒引流注入1000ml容量瓶，洗涤烧杯和玻璃棒2至3次，洗涤液也要引流注入容量瓶中，然后向容量瓶中加水至距离刻度线1至2厘米，改用胶头滴管滴加，直到液面与刻度线相平，盖上塞子摇匀，装入试剂瓶。
41.(6)向步骤(1)所得蚕豆粉中加入其12倍质量的蒸馏水，饱和氢氧化钙调ph至9.0，45℃超声1h后过滤，滤液用4m盐酸调ph至4.8，4℃沉淀12h后过滤，用旋转蒸发仪将滤液55℃浓缩至干。
42.(7)用中药流水式粉碎机将提取的蚕豆水提物固体粉碎后过60目筛，得到蚕豆水提物粉2.372kg。
43.(8)将蚕豆水提物溶解于25l蒸馏水中，使用4m盐酸溶液调节ph至4.8。
44.(9)将001
×
7树脂装柱后进行预处理：用蒸馏水浸泡24h，用蒸馏水洗至流出液澄清，不带颜色，倾去水后加4m氢氧化钠溶液浸泡24h，蒸馏水洗至中性，加入4m盐酸溶液浸泡24h，蒸馏水洗至中性。预处理中所用酸碱溶液的体积均为加入树脂的体积的3倍(可选择2～3倍)。
45.(10)将步骤(8)配制的ph4.8的蚕豆苷水提物溶液，以0.5bv/h的流速通过径高比1:10的树脂柱，上样4.5bv，4bv蒸馏水洗树脂除杂，随后用0.5％氨水以1bv/h的流速解析树脂，洗脱9bv，解析液浓缩约100倍(浓缩至约5-8ml)，加3倍丙酮震摇，5000rpm离心5min，分离上层溶液，浓缩至最小体积(约3-4ml)，使用4m氢氧化钠溶液调ph值至7.0，4℃静置26h，使之结晶，4℃下8000rpm离心10min，得蚕豆苷粗结晶，50℃烘干；将蚕豆苷粗结晶重新溶于水中(1g/80ml)，使用4m氢氧化钠溶液调ph至7.0，4℃静置26h，最后获得晶体物质。
46.(11)将步骤(10)中晶体物质使用高效液相色谱法进行检测，以蚕豆苷为对照品，所用色谱柱为ecosil 120-5-c18 aq柱(250
×
4.6mm，5um)，流动相为0.3％甲酸，检测波长为275nm，流速为0.8ml/min，柱温30℃，进样量10μl。测得结晶物质中主要成分为蚕豆苷，其中蚕豆苷含量为95％。
47.实施例2
48.蚕豆苷饲料与普通饲料的制备：
49.按照表1所述配方，将各组分混合均匀，加入混合料质量30％的水，搅拌均匀后用电动饸烙机压制出条状，晾干后剁碎得到蚕豆苷饲料与普通饲料。
50.表1蚕豆苷饲料与普通饲料配方
[0051][0052]
试验例1
[0053]
(1)蚕豆的处理：干蚕豆用盐水(1％nacl溶液)在室温下浸泡24h得浸泡过的蚕豆；
[0054]
(2)实验的准备：在珠江水产研究所养殖室基地准备6个宽2米，长2米，高1.1米的水泥鱼池，分为三组分别是普通饲料组、蚕豆组和蚕豆苷饲料组，每池放养1kg左右的体质健壮，无伤病的草鱼8尾，在饲养期间三组池子分别投喂实施例2制备的普通饲料、本试验例步骤(1)制备的浸泡过的蚕豆和实施例2制备的蚕豆苷饲料。
[0055]
(3)饲养过程：正式开始投喂前，以少量的浸泡过的蚕豆和蚕豆苷饲料驯化草鱼一周，然后每天以鱼体质量3％投喂量饲养草鱼100天，在饲料投喂过程中要遵循定时(9:00-10:00，16:30-17:30)、定位、定质、定量的“四定”投喂原则。
[0056]
(4)100天后三组池子分别抓取6尾鱼测定体重、体长，解剖后测定内脏团重、肝脏重、腹腔脂肪重，计算鱼体增重率(wgr)、肥满度(cf)、肝体比(li)、内脏比(vsi)和腹腔脂肪指数(afi)，公式如下：
[0057]
wgr(％)＝100
×
(终末体重-初始体重)/初始体重；
[0058]
cf＝g/l3×
100，其中g为体质量(g)，l为体长(cm)；
[0059]
肝体比(li)＝100
×
肝脏重/体重；
[0060]
内脏比(vsi)＝100
×
内脏团重/体重；
[0061]
腹腔脂肪指数(afi)＝100
×
腹腔脂肪重/体重；
[0062]
(5)草鱼麻醉处死后，去鳞片和鱼皮，从背部取肌肉切成2cm
×
2cm
×
1cm肌肉块，进行质构试验检测，结果见表4。其中质构检测试验条件为两个连续的30％压缩循环，循环之间间隔5秒。测试前、测试中和测试后的速度分别为1mm/s、1mm/s和5mm/s，压缩间隔为2s，压缩比为25％。
[0063]
(6)采用spss22统计分析软件进行单因素方差分析，当p《0.05时认为差异显著，p《0.01为极显著。
[0064]
所得实验结果见表2。
[0065]
表2投喂各组饲料对草鱼生长性能的影响(n＝12)
[0066][0067]
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0068]
由表2可以看出，蚕豆经过一系列处理后得到蚕豆苷制成的蚕豆苷饲料喂养的草鱼在100天内增重率较大(p《0.01)，肥满度上升(p《0.05)。说明了蚕豆经提取处理后，有利于草鱼对蚕豆活性成分的消化吸收，提高了草鱼的生长性能。
[0069]
对实施例2制备的蚕豆苷饲料、普通饲料以及本试验例步骤(1)制备的蚕豆进行成分分析，结果见表3。
[0070]
表3各组饲料的成分分析(每100g干物质中含量)
[0071]
项目普通饲料蚕豆蚕豆苷饲料蛋白质(g)28.7628.028.85脂肪(g)5.51.45.60碳水化合物(g)46.7352.146.66粗纤维(g)8.24.17.97
[0072]
由表3可以看出，蚕豆苷添加入配合饲料，蛋白质、脂肪、碳水化合物等含量较普通配合饲料基本没有变化(p《0.05)，结合表2的数据，可以证明在饲料中添加蚕豆苷能够有效避免蚕豆中抗营养因子的添加，进而利于提高草鱼的生长性能。
[0073]
将普通饲料组、蚕豆组、蚕豆苷饲料组的草鱼肌肉样品切成2
×2×
1cm的方块，用质构仪进行检测，得出肌肉的硬度、咀嚼性、弹性、内聚性、和回复性等指标，测定结果见表4。
[0074]
表4蚕豆水提物对草鱼肌肉质构的影响
[0075] 硬度(gf)咀嚼性(gf)弹性普通饲料组639.40
±
34.57c225.34
±
13.11c0.602
±
0.010c蚕豆组1447.33
±
28.62a681.50
±
8.76a0.686
±
0.027a蚕豆苷饲料组1289.72
±
24.54b479.94
±
14.31b0.643
±
0.013
ab 内聚性回复性 普通饲料组0.604
±
0.0016
ab
0.291
±
0.025
ab 蚕豆组0.657
±
0.011a0.286
±
0.012
ab 蚕豆苷饲料组0.602
±
0.010
ab
0.308
±
0.018
a [0076]
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0077]
由表4可以看出，蚕豆经过提取处理后制作成蚕豆苷饲料相比于普通饲料可显著提高草鱼肌肉的硬度、咀嚼性、弹性(p《0.05)，基本上可达到与蚕豆等同的脆化效果。说明了蚕豆苷对草鱼肌肉有较好的致脆作用，是一种能够改善草鱼肌肉品质的优良饲料添加剂。
[0078]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。