一种肿瘤基因诊断试剂盒的制作方法

no.4所示。
10.优选地，本发明所述的试剂盒的判定公式为y＝0.058*ahsa_circ_0000907+0.068*bhsa_circ_0021346；其中，ahsa_circ_0000907是hsa_circ_0000907的表达量，bhsa_circ_0021346是hsa_circ_0021346的表达量；当y≥0.45时判断为阳性，表示可能aml；当y＜0.45时判为阴性，表示正常。
11.再一方面，本发明还公开了一种治疗急性髓系白血病的药物组合物，所述药物组合物包括hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的抑制剂。
12.优选地，本发明所述的hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的抑制剂为si-hsa_circ_0000907和si-hsa_circ_0021346。
13.优选地，本发明所述的si-hsa_circ_0000907和si-hsa_circ_0021346的序列如seq id no.5和seq id no.6所示。
14.本发明具有以下有益效果：
15.本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，筛选用于aml诊断和治疗的环状rna标志物。我们选择hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346作为组合标记物(在aml中，hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346均上调)。在此基础上，本发明提供了联合检测hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的表达水平的试剂在制备诊断aml的产品中的应用以及相关的检测试剂盒。本发明的试剂盒能够作为aml诊断的手段之一，具有检测快速方便、检测灵敏度高、特异度好、成本低等特点。
16.另外，本发明还提供了一种潜在的治疗aml的药物组合物的应用以及相关的药物组合物。本发明的药物组合物对aml有较好的抑制作用，在aml治疗中具有重要的参考意义和现实意义。
附图说明
17.图1hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346实时荧光定量pcr反应的溶解曲线图。
18.图2白血病小鼠模型生存率统计结果。
具体实施方式
19.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
20.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
21.实施例1急性髓性白血病(aml)外周血中环状rna的检测
22.样本收集：收集5例正常外周血以及5例aml外周血。所有参与者均签署了知情同意书，并经过医院伦理委员会批准。所有参与者均于早晨空腹状态下留取外周静脉血5ml，保存于-70℃冰箱。
23.rna提取：采用trizol(15596026，invitrogen，car，cal，usa)一步法提取外周血总rna，nanodrop nd-2000仪检测纯度和浓度，a260/a280比值均在1.8～2.0之间。
24.rna文库建立及测序：使用circrna enrichment kit(购自美国cloud-seq公司)和truseq stranded total rna library prep kit(购自美国illumina公司)富集和预处理环状rna，生成测序文库并检测质量。在illumina hiseq 4000测序仪上进行测序。
25.生物信息学分析：经测序仪测序，使用cutadapt软件处理，获得高质量clean reads。将clean reads进行比对，利用dcc软件检测和鉴定环状rna。使用t检验进行两组样品的差异环状rnas鉴定，利用标准化的reads数，以倍数变化(fold change)＞2.0，p-value＜0.05作为差异环状rna的阈值，即差异表达的环状rna。结果显示，与正常组相比，aml组中有275个环状rna表达上调，84个表达下调；其中hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346均为表达上调，且并跟预后相关；故选择hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346作为本研究的重点的环状rna。其中hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示。
26.实施例2 aml外周血中的hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346检测
27.扩大收集样本：共收集40例样本，其中20份为aml患者，20例为正常外周血，置于-70℃冰箱保存。所有参与者均签署知情同意书。
28.rna提取：采用trizol(15596026，invitrogen，car，cal，usa)一步法提取外周血总rna，nanodrop nd-2000仪检测纯度和浓度，a260/a280比值均在1.8～2.0之间。
29.逆转录：参照easyscript first-strand cdna synthesis supermix(目录号ae301-02，北京全式金，中国)说明书将rna反转录成cdna，实验体系20μl。
30.引物设计和合成：采用primer5.0设计引物，hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的序列如实施例1所示，选u6为内参。引物设计后由南京金斯瑞科技有限公司合成。具体引物序列如下表所示：
[0031][0032]
实时荧光定量pcr反应：使用qpcr sybr green master mix(购自上海云序生物科技有限公司)在实时荧光定量pcr仪(abi 7500，usa)进行pcr反应，反应体系：2
×
master mix 5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cdna 2μl，rnase free dh2o 2μl。反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，连续进行40个循环。收集荧光。扩增反应后，设置95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s；并从60℃缓慢加热到99℃。记录各孔ct值，以u6为内参。
[0033]
结果显示：在aml中，hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346含量明显高于正常组，p＜0.01，与高通量测序结果一致；且引物设计符合检测要求。具体结果见图1和下表：
[0034]
基因名称aml(平均2
‑△△
ct
)正常(平均2
‑△△
ct
)p值hsa_circ_000090713.82
±
5.123.27
±
1.58＜0.001hsa_circ_002134610.59
±
2.471.59
±
0.49＜0.001
[0035]
通过logistic回归方程拟合两个指标发现，拟合后的灵敏度和特异性均高于单独指标。通过数据分析，得到判断公式(回归方程)为：
[0036]
y＝0.058*a
hsa_circ_0000907
+0.068*b
hsa_circ_0021346
；其中，a
hsa_circ_0000907
是hsa_circ_0000907的表达量，b
hsa_circ_0021346
是hsa_circ_0021346的表达量。
[0037]
当y≥0.45时判断为阳性，表示可能aml；当y＜0.45时判为阴性，表示正常。
[0038]
实施例3试剂盒的组装及其检测
[0039]
在实施例2的基础上，组装用于检测aml的诊断试剂盒，该试剂盒包括以下成分组成：(1)3组引物对：分别为hsa_circ_0000907、hsa_circ_0021346和u6的引物对，其中hsa_circ_0000907、hsa_circ_0021346的引物对分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示；u6的引物对如seq id no.9和seq id no.10所示。(2)sybr green聚合酶链式反应体系：qpcr sybr green master mix。(3)阳性对照和阴性对照：其中阳性对照为hsa_circ_0000907、hsa_circ_0021346的cdna样本混合物，阴性对照为rnase free dh2o。
[0040]
确定的反应体系如下表所示：
[0041]
组分体积2
×
master mix5μl上游引物0.5μl下游引物0.5μlcdna2μlrnase free dh2o2μl合计10μl
[0042]
最佳反应条件为：95℃10min；95℃15s，60℃1min，连续进行40个循环。收集荧光。
[0043]
数据处理和计算：检测后，统计各个样本的ct值并按照以下公司进行计算，y＝0.058*a
hsa_circ_0000907
+0.068*b
hsa_circ_0021346
；其中，a
hsa_circ_0000907
是hsa_circ_0000907的表达量，b
hsa_circ_0021346
是hsa_circ_0021346的表达量。当y≥0.45时判断为阳性，表示可能aml；当y＜0.45时判为阴性，表示正常。
[0044]
试剂盒的检测：取受检者的外周血，按照常规方法提起rna并进行逆转率获取cdna，使用上述试剂盒中的试剂，对cdna进行实时荧光定量pcr检测，对检测结果按照上述的方法进行计算和处理，检测结果可用于对该个体进行aml可能性的风险评估或疾病诊断和自然预后；也可以用于对该个体进行aml治疗的疗效评估和治疗预后。
[0045]
本发明的试剂盒通过最精简和具有特异性的引物对来检测circrna基因的表达情况，稳定而且精确，检测也方便，大大提高了诊断aml的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导早期诊断和更有效的个体化治疗。
[0046]
实施例4 aml小鼠体外治疗研究
[0047]
hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的抑制剂的制备：根据环状rna的序列，设计hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的干扰rna，所述的hsa_circ_0000907和hsa_circ_0021346的干扰rna的序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。
[0048]
细胞培养与分选(参见中国发明专利2020102945010制备)，具体为：人aml细胞系kg1a(atcc,manassas,va)用含10％胎牛血清(fbs)和100u/ml青霉素和链霉素的dmem培养基进行悬浮培养。由于白血病干细胞(leukemia stem cells,lscs)为cd34
+
cd38-的kg1a细胞，所有kg1a细胞均为cd34
+
，因此lscs通过cd38-fitc抗体和anti-fitc磁珠间接标记进行富集(miltenyi biotec,bergisch gladbach，德国)。简单地说，细胞悬浮液以125g离心10分钟，用pbs洗涤。然后，细胞沉淀用分离缓冲液(含0.5％bsa的pbs)悬浮，并与cd38-fitc抗
体孵育30分钟。pbs洗涤后，细胞沉淀在含有抗fitc微球的分离缓冲液中孵育15分钟。经过洗涤后，滤液(cd34
+
cd38-细胞)使用midimacs分离器系统的ld柱收集。在整个分选过程中，将细胞置于4℃，并用流式细胞术进行分析。lscs损耗后剩余细胞定义为aml细胞，用于共培养研究。
[0049]
裸鼠移植瘤实验：nod/scid/il2rγ(null)mice(nsg)(6-9week-old)(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)。将nod/scid小鼠随机分为4组，每组10只。对4组进行全身x射线照射1.8gy。实验分组如下：(1)空白对照组，24h后取对数生长期的稳定转染生理盐水的aml尾静脉注射5
×
106个/只；(2)si-hsa_circ_0000907组，24h后取对数生长期的稳定转染si-hsa_circ_0000907的aml尾静脉注射5
×
106个/只；(3)si-hsa_circ_0021346组，24h后取对数生长期的稳定转染si-hsa_circ_0021346的aml尾静脉注射5
×
106个/只；(4)si-hsa_circ_0000907+si-hsa_circ_0021346组，24h后取对数生长期的稳定转染si-hsa_circ_0000907和si-hsa_circ_0021346的aml尾静脉注射5
×
106个/只。观察检测两组小鼠的生存率。本研究中所有动物实验均符合当地实验动物的管理。
[0050]
实验结果显示：与对照组相比，si-hsa_circ_0000907组、si-hsa_circ_0021346组和si-hsa_circ_0000907+si-hsa_circ_0021346组小鼠整体生存率显著升高(图2)。以上研究结果表明：在白血病小鼠体内，si-hsa_circ_0000907、si-hsa_circ_0021346均可抑制amlsc自我更新，提高白血病小鼠生存率，且两者联合使用的效果更好。
[0051]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。