靶向DNA去甲基化的方法、融合蛋白及其应用

靶向dna去甲基化的方法、融合蛋白及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种靶向dna去甲基化的方法、融合蛋白及其应用。


背景技术：

2.dna甲基化是最常见的一种dna修饰形式，通常是在胞嘧啶5号碳位上共价连接一个甲基基团，使得胞嘧啶(c)转为5-甲基胞嘧啶(5mc)。dna甲基化导致染色质结构、dna与蛋白质结合能力等的改变，从而影响基因表达和遗传性状。dna甲基化是可逆的，通常甲基化抑制基因表达，而去甲基化促进基因表达。因此，甲基化和去甲基化在不改变dna序列的前提下调控了基因表达，是最常见的表观遗传调控类型之一。真核生物的dna甲基化通常发生在基因组上cpg岛位置(cpg岛是指基因组富含cg双核苷酸的某些区段，主要位于基因的启动子和外显子区域)。正确的dna甲基化与生长发育、生理状态等密切相关，错误的dna甲基化会导致生长发育异常、促进癌症发生和发展。例如，ras相关区域家族1a(ras association domain family 1a，rassf1a)是一个典型的抑癌基因，其编码蛋白通过抑制ras活化从而抑制肿瘤形成。人类肿瘤中因rassf1a基因的启动子区域甲基化导致rassf1a表达缺失是普遍事件，已在近40种不同癌症中发现rassf1a的甲基化失活。而作为全世界发病率和死亡率最高的癌症之一的肺癌，rassf1a启动子高甲基化在100％的小细胞肺癌细胞系(sclc)、63％的非小细胞肺癌细胞系(nsclc)、30％的原发性nsclc中被检测到，在正常的肺上皮细胞中未有检出。由此可见，抑癌基因的启动子高甲基化导致抑癌基因失活是各类肿瘤的共同特征之一。基于这一现象，dna甲基化小分子抑制剂已应用于多种癌症的临床治疗。但小分子抑制剂是非选择性去甲基化，导致大量原本沉默的基因异常激活。因此，如果能发展一种靶向的dna去甲基化技术，通过靶向抑癌基因启动子从而特异性地提高抑癌基因表达，是癌症精准医疗的重要发展方向。同理，靶向的dna去甲基化还可应用于存在dna异常甲基化现象的其他疾病的治疗，将产生广泛而巨大的临床影响。
3.dna甲基化在原核和真核生物中广泛存在。真核生物的dna去甲基化包括被动和主动两种方式。被动去甲基化是指dna甲基转移酶(dnmt)失活后，新复制的dna无法甲基化，原有5mc随着细胞分裂和复制而逐渐减少。对于主动去甲基化，动物和植物采用了不同的策略。动物利用双加氧酶tet(包括tet1、tet2、tet3)将5mc氧化为一系列衍生物，一方面这些衍生物不能被dnmt识别从而无法维持甲基化状态，另一方面胸腺嘧啶dna糖基化酶(tdg)会切除这些氧化衍生物，通过碱基切除修复(ber)实现去甲基化。而植物中利用dna糖苷酶dme(包括ros1、dml2、dml3)直接识别并切除5mc，再通过ber完成去甲基化。
4.目前去甲基化技术可分为非靶向和靶向两类。非靶向的方法主要使用dna甲基化小分子抑制剂，例如5-azacytidine(阿扎胞苷、维达莎)、5-aza-2'-deoxycytidine(5-氮杂-2'-脱氧胞苷、地西他滨)，以及针对dnmt的sirna基因沉默等。靶向的方法主要在锌指蛋白(znfs)、转录激活因子样效应子(tales)、规律成簇间隔短回文重复(crispr)等具有靶向dna能力的系统的基础上融合表达一个或多个去甲基化效应子，从而达到对特定dna序列去
甲基化的目的。目前使用的去甲基化效应子包括全长tet1、截短的tet1(tet1-cd)、全长的ros1。
5.利用crispr的靶向dna技术发展最为迅速。crispr系统包括两个关键元件：单向导rna(single guide rna，sgrna)和crispr相关核酸内切酶(crispr-associated endonuclease，cas)。自然界中cas种类多样，cas9是目前基因工程领域应用最多的一类，并且cas9可以来源于不同的细菌。sgrna由一段结合cas9所必需的骨架序列(scaffold)和一段识别靶dna的识别序列(targeting)组成，通过改变识别序列，可选择dna上的不同靶点或不同的靶dna。在体外或体内，sgrna与cas9形成复合体后，sgrna引导cas9结合到特定dna靶点并切割dna。cas9的核酸酶切割活性取决于ruvc和hnh两个结构域，这两个结构域分别负责切割dna两条链。通过工程化改造cas9，可获得切割活性缺失、仍具有靶向能力的核酸酶失活的cas9(dead cas9，dcas9)。crispr靶向dna的特异性由两方面决定的，一方面是sgrna识别序列和dna靶点序列之间的碱基配对，另一方面是cas9和一个特定短dna序列的结合。这个短dna序列通常在dna靶点序列的3'末端，被称为原型间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif，pam)。不同来源的cas9识别不同的pam序列。目前最常用的cas9来自streptococcus pyogenes(spcas9)，spcas9包含1368个氨基酸，pam序列为5
’‑
ngg-3’。相较于spcas9，新发现的来自campylobacter jejuni的cas9(cjcas9)包含984个氨基酸，是自然界已发现cas9中尺寸最小的，cjcas9的pam序列为5
’‑
nnnvyrac-3’、5
’‑
nnnnaca-3’或5
’‑
nnnnyrac-3’。研究表明cjcas9具有和spcas9一样优秀的基因编辑潜力。
6.目前已开发的dna去甲基化技术存在各自的不足。对于非靶向的去甲基化，由于非特异性降低了基因组整体的甲基化水平，大量基因会异常表达，严重制约其实际应用。对于靶向的去甲基化，其局限性主要有三方面：(1)靶向性不高。例如，相较于crispr，znfs和tales不但需要对每个dna靶点进行专门设计，且存在与基因组的“脱靶”结合。(2)特异性不高。例如，目前最常用的去甲基化效应子是全长或截短tet1，但tet1去甲基化过程中产生的5mc衍生物同样携带表观遗传信息，在去甲基过程中会造成额外的表观遗传效应。(3)融合蛋白过大。目前最常用的spcas9和去甲基化效应子的氨基酸序列均较长，使得表达载体上用于二者融合表达的插入片段过长，而常用的基因治疗病毒载体(慢病毒、腺相关病毒等)对外源插入片段有大小限制，这就影响了病毒载体包装和体内应用，所以难以实现基于病毒递送的去甲基化基因治疗。
7.为了克服上述不足，我们开发了一种新的靶向的dna去甲基化技术，即miniature cjcas9-ros1 induced specific demethylation(缩小的cjcas9-ros1诱导的特异性去甲基化，简称mini-crisd)。相较于现有技术，mini-crisd基于crispr-cjcas9系统，很好地保证了靶向性；使用缩小的cjcas9蛋白和去甲基化效应子ros1，便于进行基于病毒递送的去甲基化基因治疗；并且去甲基化过程中不产生5mc系列衍生物，不造成额外的表观遗传信号。


技术实现要素：

8.本发明的目的提供了一种靶向的dna去甲基化方法(mini-crisd)和该方法中所用到的融合蛋白。
9.本发明所述mini-crisd方法通过工程化的缩小cjcas9递送工程化的缩小ros1去
甲基化效应子至特定dna序列和/或特定基因组位置(如cpg岛)来靶向递送去甲基化活性，可以对特定dna实现靶向去甲基化。
10.本发明的第一个方面，提供了一种融合蛋白，其包括由截短后的核酸酶失活的cjcas9(dcjcas9
△
hnh)以及截短后的ros1(ros1
△
n)通过包括连接子的中间序列连接而成，其中,所述截短后的cjcas9(dcjcas9
△
hnh)为:cjcas9蛋白被移除其481-640位氨基酸、剩余氨基酸用连接子连接、并进行d8a点突变(第8个氨基酸由d突变为a)的氨基酸片段；所述截短后的ros1(ros1
△
n)为:ros1蛋白被移除其1-509位氨基酸和628-855位氨基酸、剩余氨基酸用连接子连接的氨基酸片段，且ros1蛋白的971位的氨基酸为天冬氨酸(asp)。
11.本发明第二个方面，提供了编码上述融合蛋白的核苷酸序列，或为上述核苷酸序列且具有一个多个核苷酸突变，但编码相同氨基酸的核苷酸序列。例如上述核苷酸序列基础上由于密码子优化或密码子简并性的编码相同氨基酸的序列。
12.本发明第三个方面，提供能表达上述融合蛋白的表达载体。
13.本发明第四个方面，提供一种靶向dna去甲基化的试剂盒，其包括能表达上述融合蛋白的表达载体，或者包括上述融合蛋白。
14.本发明的第五个方面，提供了一种靶向dna去甲基化方法，包括以下步骤：
15.s1.构建表达上述融合蛋白的表达载体；
16.s2.获得sgrna，所述sgrna序列包括与cjcas9δhnh(截短后的cjcas9)结合的骨架序列和与靶dna上的靶点序列完全互补的识别序列；
17.s3.将所述表达载体与所述sgrna导入含有靶dna的目标物，进行靶向去甲基化。
18.本发明的第六个方面，提供了上述融合蛋白或者表达载体的应用。
19.上述融合蛋白或者表达载体在体内和/或离体和/或体外诱导的靶向dna去甲基化的应用。
20.上述融合蛋白或者表达载体在制备基于靶向dna去甲基化进行癌症治疗的药物中的应用。
21.上述融合蛋白或者表达载体在制备dna甲基化异常导致的疾病治疗的药物中的应用。
22.本发明的第七个方面，还提供了一种融合对照蛋白，其包括由截短后的cjcas9(dcjcas9
△
hnh)以及截短后的ros1(ros1
△
n)通过包括连接子的中间序列连接而成，其中,所述截短后的cjcas9为:cjcas9蛋白被移除其481-640位氨基酸、剩余氨基酸用连接子连接、并进行d8a点突变(第8个氨基酸由d突变为a)的氨基酸片段；所述截短后的ros1(ros1
△
n)为:ros1蛋白被移除其1-509位氨基酸和628-855位氨基酸、剩余氨基酸用连接子连接的氨基酸片段，且ros1蛋白的971位的氨基酸不是天冬氨酸(asp)。
23.本发明的靶向dna去甲基化方法(mini-crisd)是首次将截短的dcjcas9作为dna靶向的工具，也是首次将截短的ros1应用于dna去甲基化，更是首次将两者经过合适处理后结合在一起应用于靶向dna去甲基化。相较现有技术，mini-crisd的优势主要有：(1)遗传调控的优势，来自于植物的ros1糖苷酶在去甲基化过程中不产生5mc衍生物，避免了目前使用tet1等来自动物的去甲基化效应子的方法中产生5mc衍生物并引入的额外遗传信号的问题。(2)分子技术的优势，mini-crisd具有全新的序列设计，相对于目前使用的crispr系统具有较小的基因序列、较高的活性，使得表达载体具有更小的尺寸，使得原先因载体尺寸而
难以实现的基于病毒递送的去甲基化基因治疗成为可能。(3)基因靶向性的优势，mini-crisd基于crispr原理，相较于其他靶向系统如znfs和tales的靶向效果更好，脱靶率低。mini-crisd可以靶向基因启动子区域，实现对甲基化基因的靶向去甲基化，提高目的基因的表达，并且整个去甲基化过程不会造成额外的表观遗传变化；本发明的所述mini-crisd为存在dna异常甲基化现象的各类疾病的体内和/或离体和/或体外诱导的基因治疗提供了一种新方法。
附图说明
24.图1为本发明的靶向的dna去甲基化方法的流程示意图。
25.图2为mini-crisd载体质粒的构建流程示意图。
26.图3为mini-crisd的载体质粒示意图。
27.图4为hpaii限制性内切酶切割后琼脂糖凝胶电泳结果示意图。
28.图5为去甲基化测试流程示意图。
29.图6为实施例4中对mini-crisd的去甲基化效果示意图。
30.图7为实施例5中对mini-crisd的去甲基化效果示意图。
31.图8为实施例6中dna靶点在基因组和rassf1a启动子上的相对位置示意图。
32.图9为实施例6中针对抑癌基因rassf1a启动子区域去甲基化效果示意图。
33.图10为实施例7中针对抑癌基因rassf1a启动子区域去甲基化效果示意图。
具体实施方式
34.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
35.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
36.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
37.本发明的一些实施例中涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包括由截短后的核酸酶失活的cjcas9(dcjcas9
△
hnh)以及截短后的ros1(ros1
△
n)通过包括柔性连接子的中间序列连接而成，其中,所述截短后的cjcas9(dcjcas9
△
hnh)为:cjcas9蛋白被移除其481-640位氨基酸、剩余氨基酸用柔性的连接子连接、并进行d8a点突变(第8个氨基酸由d突变为a)的氨基酸片段；所述截短后的ros1(ros1
△
n)为:ros1蛋白被移除其1-509位氨基酸和628-855位氨基酸、剩余氨基酸用柔性的连接子连接的氨基酸片段，且ros1蛋白的971位的氨基酸为天冬氨酸(asp)。
38.在其中一些实施例中，所述截短后的cjcas9的氨基酸组成从n端到c端依次为：
39.seq id no.1或其经过一个或多个氨基酸突变、取代但生物活性不变的序列、柔性连接子、和seq id no.2经过一个或多个氨基酸突变、取代但生物活性不变的序列。
40.在其中一些实施例中，所述截短后的ros1的氨基酸组成从n端到c端依次为:
41.seq id no.3或其经过一个或多个氨基酸突变、取代但生物活性不变的序列、
42.柔性连接子、和seq id no.4经过一个或多个氨基酸突变、取代但生物活性不变的序列。
43.本发明所述融合蛋白按照cjcas9δhnh-ros1δn的顺序，即cjcas9δhnh的c端与ros1δn的n端融合；但所述融合蛋白也可以按照ros1δn-cjcas9δhnh的顺序，即cjcas9δhnh的n端与ros1δn的c端融合。
44.在其中一些优选的实施例中，所述融合蛋白(cjcas9δhnh-ros1δn)从n端到c端的包括：
45.seq id no.1或其经过一个或多个氨基酸突变、取代但生物活性不变的序列、柔性连接子、和seq id no.2经过一个或多个氨基酸突变、取代但生物活性不变的序列；
46.中间序列；
47.seq id no.3或其经过一个或多个氨基酸突变、取代但生物活性不变的序列、柔性连接子、和seq id no.4经过一个或多个氨基酸突变、取代但生物活性不变的序列。
48.在其中一些实施例中，所述截短后的cjcas9和截短后的ros1之间由中间序列连接。所述中间序列主要包括nls核定位信号肽、柔性的连接子、和分子克隆中使用的酶切位点。
49.在本发明的一些实施例中，所述中间序列如spkkkrkveasklggggsggggsggggsvd所示。
50.在其中一些实施例中，所述融合蛋白的截短后的cjcas9的前端还具有前序序列，所述前序序列包括nls核定位信号肽和酶切位点。例如，该前序序列为spkkkrkveas。
51.所述连接子，其为用于可连接多肽的接头序列，其能够连接两个多肽并将其自然折叠成所期望结构，通常其是具有一段有疏水性和一定伸展性的短肽，在本发明中的目的是可将融合的两段氨基酸序列分开，以缓解二者相互干扰作用，并且保持其各自的活性和功能。此类肽接头包括但不限于例如各种以下氨基酸组成的软性连接子：ggggsggggsggggs，gssgn，gggsgg。
52.核定位信号(nls)提供nls与其连接的蛋白质的核转运，例如在本发明中，dcjcas9
△
hnh和ros1
△
n与nls相连后将进入细胞核，提高在细胞核中对dna的去甲基化效率。此类核定位信号包括但不限于，spkkkrkveas，gpkkkrkv。为了便于在蛋白表达和定位研究中检测融合蛋白的表达，可以在融合蛋白中加入标签序列，在本发明的一些实施例中，该标签序列为在前序序列中加入了dykddddk(flag标签)。
53.本发明的另一些实施例中涉及编码上述融合蛋白的核苷酸序列，或为上述核苷酸序列且具有一个多个核苷酸突变，但编码相同氨基酸的核苷酸序列。例如上述核苷酸序列基础上由于密码子优化或密码子简并性的编码相同氨基酸的序列。
54.本发明的另一些实施例中涉及能表达上述融合蛋白的表达载体(mini-crisd质粒)。
55.所述载体可以是质粒、病毒(如腺病毒载体、逆转录病毒或慢病毒载体，或腺相关
病毒载体)或本领域所知的其他表达载体。
56.在其中一些实施例中，所述载体还包括用于表达sgrna的dna序列，每个sgrna序列包括与cjcas9δhnh(截短后的cjcas9)结合的骨架序列和识别靶dna的识别序列。
57.所述识别序列所含的核苷酸针对不同dna靶点相应改变、并与dna靶点序列完全互补，识别序列的长度通常优选是20、21或22个核苷酸，但识别序列的长度可以是从10到35个核苷酸。
58.所述骨架序列是固定不变的73个核苷酸的片段，其如seq id no.21所示。相应地，载体上用于表达sgrna骨架序列的dna序列如seq id no.22所示。
59.本发明的另一些实施例中涉及一种靶向dna去甲基化的试剂盒，其包括能表达上述融合蛋白的表达载体，或者包括上述融合蛋白。
60.在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括sgrna序列，每个sgrna序列包括能与所述截短后的cjcas9结合的骨架序列和识别靶dna的识别序列。
61.所述sgrna序列在上述表达载体中表达获得，即所述表达载体还包括用于表达sgrna的dna序列。
62.所述sgrna序列也可以单独在另一个表达载体中表达获得，不需要在上述表达融合蛋白的同一载体中表达，即所述试剂盒还包括能表达sgrna的dna序列的表达载体。
63.本发明的另一些实施例中涉及一种靶向dna去甲基化方法，包括以下步骤：
64.s1.构建表达上述融合蛋白的表达载体；
65.s2.获得sgrna，所述sgrna序列包括与cjcas9δhnh(截短后的cjcas9)结合的骨架序列和与靶dna上的靶点序列完全互补的识别序列；
66.s3.将所述表达载体与所述sgrna导入含有靶dna的目标物，进行靶向去甲基化。
67.上述步骤s2中，获得所述sgrna，包括将在表达上述融合蛋白的表达载体中插入有表达所述sgrna的dna序列，也可以是在另一个单独的载体中插入表达所述所述sgrna的dna序列；也可以是合成获得所述sgrna序列。
68.本发明的另一些实施例中涉及上述融合蛋白或者表达载体在体内和/或离体和/或体外诱导的靶向dna去甲基化的应用。
69.具体的，体内和/或离体：使用病毒载体(例如腺相关病毒、慢病毒)或非病毒载体(例如脂质体、纳米材料)，将表达载体或者融合蛋白递送到体内和/或离体。
70.体外：使用病毒载体(例如腺相关病毒、慢病毒)或非病毒载体(例如脂质体、纳米材料)或其他递送手段(例如电穿孔、显微注射)，将表达载体或者融合蛋白递送到细胞中。
71.上述融合蛋白或者表达载体在制备基于靶向dna去甲基化进行癌症治疗的药物中的应用。
72.上述融合蛋白或者表达载体在制备dna甲基化异常导致的疾病治疗的药物中的应用。
73.所述dna甲基化异常导致的疾病包括肿瘤或者癌症，或者代谢性疾病等相关疾病。
74.本发明的一些实施例中，还涉及到一种融合对照蛋白，其包括由截短后的cjcas9(dcjcas9
△
hnh)以及截短后的ros1(ros1
△
n)通过包括柔性连接子的中间序列连接而成，其中,所述截短后的cjcas9为:cjcas9蛋白被移除其481-640位氨基酸、剩余氨基酸用柔性的连接子连接、并进行d8a点突变(第8个氨基酸由d突变为a)的氨基酸片段；所述截短后的
ros1(ros1
△
n)为:ros1蛋白被移除其1-509位氨基酸和628-855位氨基酸、剩余氨基酸用柔性的连接子连接的氨基酸片段，且ros1蛋白的971位的氨基酸不是天冬氨酸(asp)。
75.所述融合融合对照蛋白，可以用于实验对照，ros1蛋白的971位的氨基酸不是天冬氨酸(asp)，例如为天冬氨酸突变为天门冬酰胺(asn)。
76.以下通过具体的实施例对本发明做进一步的阐述，但不用于限制本发明的保护范围。
77.实施例1
78.为了实现mini-crisd，我们分别对cjcas9和ros1蛋白进行工程化改造截短、并在此基础上进行融合表达。mini-crisd在保留cas9的靶向性、ros1去甲基化功能的同时，极大地缩小了融合蛋白的尺寸(亦即表达载体上插入序列的大小)，便于体内和体外的基因递送，同时又能保留相应的生物活性。mini-crisd首先基于已被证实的2个发现：(1)cjcas9在移除481-640位氨基酸的hnh结构域后(被称为cjcas9
△
hnh)，ruvc结构域在体外实验中保留了单链切割功能(yamada m,watanabe y,gootenberg j s,et al.crystal structure of the minimal cas9 from campylobacter jejuni reveals the molecular diversity in the crispr-cas9 systems.mol cell,2017,65(6):1109-1121)；(2)体外纯化的ros1在移除蛋白n端的1-509位和628-855位氨基酸后，剩余的氨基酸序列(被称作ros1δn)在体外实验中保留了去甲基化的能力(hong s,hashimoto h,kow y w,et al.the carboxy-terminal domain of ros1 is essential for 5-methylcytosine dna glycosylase activity.j mol biol,2014,426(22):3703-3712)。在此基础上，我们进一步通过d8a点突变，彻底失活cjcas9内切酶活性，仅保留其靶向dna能力(被称作dcjcas9δhnh)；同时我们也证实了ros1δn在体内同样具有去甲基化酶活性；再通过将dcjcas9δhnh与ros1δn融合表达，并配合相应的sgrna，使得融合表达蛋白具备体内靶向的dna去甲基化能力。并且我们创造性地使用截短的dcjcas9δhnh和截短的ros1δn蛋白，这极大地缩小了融合蛋白的尺寸，使表达载体上插入序列极大地缩小，从而实现体内和体外的基因递送，同时又能保留相应的生物活性。
79.相较于现有技术，本发明所述mini-crisd的优势主要有：(1)遗传调控的优势，来自于植物的ros1糖苷酶在去甲基化过程中不产生5mc衍生物，避免了目前使用tet1等来自动物的去甲基化效应子的方法中产生5mc衍生物并引入的额外遗传信号的问题。(2)分子技术的优势，mini-crisd具有全新的序列设计，相对于目前使用的crispr系统具有较小的基因序列、较高的活性，使得表达载体具有更小的尺寸，使得原先因载体尺寸而难以实现的基于病毒递送的去甲基化基因治疗成为可能。(3)基因靶向性的优势，mini-crisd基于crispr原理，相较于其他靶向系统如znfs和tales的靶向效果更好，脱靶率低。我们的靶向dna去甲基化技术是首次将dcjcas9作为dna靶向的工具，也是首次将截短的ros1应用于靶向dna去甲基化。
80.本发明所述靶向dna去甲基化的方法，包含以下步骤进行构建(参见图1)：
81.1.构建表达mini-crisd复合物(dcjcas9δhnh与ros1δn融合表达蛋白及sgrna)的表达质粒载体(简称为mini-crisd质粒)。该质粒包含实现靶向的dna去甲基化的3个关键元件：(1)一段dna序列，可以表达dcjcas9δhnh。dcjcas9δhnh是指cjcas9蛋白移除其hnh结构域(481-640位氨基酸)、剩余氨基酸用柔性的连接子(如gggsgg)连接、并进行d8a点突
变。(2)一段dna序列，可以表达ros1δn。ros1δn是指ros1蛋白移除其1-509位氨基酸和628-855位氨基酸、剩余氨基酸用柔性的连接子(如gssgn)连接。(3)一段dna序列，用于表达一条或多条sgrna，每个sgrna序列包括2部分，一部分是固定的与cjcas9δhnh结合的骨架序列(scaffold)；另一部分是根据不同dna靶点而改变的识别序列(targeting)，并且该部分可以由一段空白序列(spacer)代替；空白序列上包含酶切位点(例如bsmbi、bbsi等)，便于将空白序列替换为识别序列。除上述3个关键元件外，该质粒还包含以下4个辅助元件以实现mini-crisd：(4)在dcjcas9δhnh的两端引入核定位信号肽(nls)，用于将融合表达的蛋白导入细胞核中。(5)在dcjcas9δhnh和ros1δn之间用柔性的连接子(如ggggsggggsgggg)连接。(6)驱动dcjcas9δhnh-ros1δn序列表达的启动子，如cmv启动子、ef1α启动子等。(7)驱动sgrna序列转录的启动子，如u6启动子、h1启动子等。
82.此外，靶dna序列上应含有cjcas9所需的pam序列，即靶点序列的3’端应紧邻5
’‑
nnnnaca-3’、5
’‑
nnnnryac-3’或5
’‑
nnnvryac-3’(其中n为a/t/c/g任一碱基，v为a/g/c任一碱基；r为a/g任一碱基；y为t/c任一碱基)。根据dna靶点序列设计相应的识别序列并替换掉mini-crisd质粒上的空白序列，获得针对特定dna靶点的mini-crisd质粒(携带靶向特定dna的sgrna)。
83.2.将mini-crisd质粒导入含有靶dna的细胞中。对于体外/离体实验，通过脂质体转染、电穿孔等任何一种有效的导入方法将所构建的载体导入细胞；对于体内实验，通过病毒感染、脂质体包裹等任何一种有效的导入方法，将所构建的载体全部、或含有其功能片段的部分载体、或mini-crisd的关键元件导入体内。通过dcjcas9δhnh-ros1δn融合蛋白和sgrna组装为复合物后，将靶向特定dna序列并实现去甲基化这一目的。
84.需要强调的是，mini-crisd也适用于不使用单个载体的情形，即dcjcas9δhnh-ros1δn融合蛋白和sgrna不是必须如步骤1所述构建在同一载体上。例如，融合蛋白和sgrna可以使用不同的载体进行共表达，或单独表达后再混合在一起形成复合物，或sgrna通过化学合成的方式获得。只要通过适当的手段获得了dcjcas9δhnh-ros1δn融合蛋白和sgrna，就可以进行本发明提供的靶向dna去甲基化。
85.靶向dna去甲基化时，所述融合蛋白的cjcas9δhnh与sgrna骨架序列结合从而使融合蛋白与sgrna形成复合物；然后该复合物通过sgrna识别序列结合到靶dna的靶点序列上，并通过融合蛋白的ros1δn所具有的去甲基化酶活性实现对靶dna的去甲基化。
86.87.88.89.90.91.92.93.94.95.96.[0097][0098]
mini-crisd载体质粒的构建，以及mini-crisd-dead(d971n活性位点突变，dead意为丧失了去甲基化能力)对照质粒的构建(具体序列见表1)。质粒的设计思路如图2所示。
[0099]
本发明质粒构建的详细步骤如下：
[0100]
1.通过全基因合成的方式构建一个包含上述技术方案步骤1中所述的mini-crisd各关键和辅助元件的载体质粒(如图3所示)，该合成由南京擎科生物科技有限公司完成。
[0101]
该载体质粒的设计包括：(1)移除cjcas9的hnh结构域(481-640位氨基酸)、并进行d8a点突变，从而使cjcas9失去内切酶活性，仅保留靶向dna能力(被称作dcjcas9δhnh)。(2)移除ros1蛋白的1-509位、628-855位氨基酸，剩余氨基酸序列(被称作ros1δn)保留去甲基化活性。(3)dcjcas9δhnh与ros1δn通过柔性连接子表达为一个融合蛋白(dcjcas9δhnh-ros1δn)。(4)两个sgrna的表达元件，每个sgrna序列由固定的骨架序列(scaffold)和可通过bsmbi或bbsi酶切移除的空白序列(spacer)组成。
[0102]
骨架序列(scaffold)核苷酸如下所示，guuuuagucccugaaaagggacuaaaauaaagaguuugcgggacucugcgggguuacaauccccuaaaaccgc(seq id no.21)。
[0103]
相应地，表达sgrna骨架序列的dna序列为gttttagtccctgaaaagggactaaaataaagagtttgcgggactctgcggggttacaatcccctaaaaccgc(seq id no.22)
[0104]
当通过适当的分子克隆手段，将载体质粒上的空白序列替换为针对特定dna靶点的识别序列(targeting)后，即获得携带靶向特定dna的sgrna的mini-crisd表达质粒。
[0105]
需要强调的是，mini-crisd也适用于不使用上述载体质粒的情形，即dcjcas9δ
hnh-ros1δn融合蛋白和sgrna不是必须如步骤1中所述构建在同一质粒上。例如，融合蛋白和sgrna可以使用不同的质粒进行共表达，或者通过mrna等其他非质粒的形式进行表达，或者使用病毒载体等本领域所知的其他表达载体；再例如，融合蛋白可以通过体外表达纯化的方式获得，并与通过化学合成的方式获得的sgrna混合在一起形成复合物。只要通过适当手段获得了dcjcas9δhnh-ros1δn融合蛋白和sgrna，就可以进行本发明提供的靶向dna去甲基化。因此mini-crisd不限于本实施例中所描述的特定质粒。
[0106]
2.构建mini-crisd-dead对照质粒，该质粒通过引入d971n氨基酸点突变使得ros1失去了去甲基化能力，作为后文其他实施例中mini-crisd的对照。具体构建方法如下：
[0107]
以mini-crisd质粒为模板进行点突变。使用碧云天quickmutation基因定点突变试剂盒(货号d0206)，按照实验要求设计两条互补引物(引物序列见下表)。
[0108]
ros1-dead-d971n-fttggcattcccagtgaacacaaacgttggaag(seq id no.9)ros1-dead-d971n-rcttccaacgtttgtgttcactgggaatgccaa(seq id no.10)
[0109]
点突变pcr反应体系如下：
[0110]
试剂最终浓度体积10x beyofusion缓冲液1x5μl引物混合物(10μm)0.4μm2μldntp mix(2.5mm)0.25mm5μlmini-crisd质粒200ng1μlbeyofusion dna聚合酶1/501μl加无核酶水后总体积-50μl
[0111]
pcr的反应条件如下：
[0112]
步骤循环数温度时间1195℃3min22095℃30sec
ꢀꢀ
55℃30sec
ꢀꢀ
68℃60sec/kb3168℃15min414℃长时间保持
[0113]
pcr反应后，直接在pcr反应体系中加入1μl dpni，混匀后37℃孵育5min。dpni消化后，每100μl感受态细菌(擎科trelief 5αchemically competent cell货号：tsc-c01)中加入5-10μl经过dpni消化后的产物，进行转化。对于得到的转化克隆子，挑取3-5个克隆送样测序去测序，测序结果显示获得了预期的点突变。
[0114]
实施例2：构建不同程度甲基化的荧光报告质粒。
[0115]
利用cpg甲基转移酶m.sssi(neb公司，货号m0226s)不同的孵育时间，可以实现对质粒dna不同程度的甲基化。对甲基化后的质粒进行hpaii酶切鉴定，由于hpaii只切割未甲基化的质粒，根据hpaii切割的情况可以评估质粒的甲基化程度。详细步骤如下：
[0116]
1.对pegfp-n1荧光报告质粒(clontech公司)进行体外甲基化，通过cpg甲基转移酶m.sssi对质粒不同的孵育时间可获得不同程度甲基化。体外甲基化反应体系和条件如
下：
[0117][0118][0119]
2.对上述进行了体外甲基化反应的荧光报告质粒进行hpaii限制性内切酶切割。琼脂糖凝胶电泳后，根据hpaii切割和未切割的dna含量确定甲基化的程度(图4)。
[0120]
实施例3：构建靶向pegfp-n1荧光报告质粒上cmv启动子的mini-crisd表达质粒。选取cmv启动子上符合cjcas9 pam序列要求的识别序列4条，见下表：
[0121]
p
cmv-sgrna-3tcaaaccgctatccacgcccat(seq id no.11)p
cmv-sgrna-4attgacgtcaatgggagtttgt(seq id no.12)p
cmv-sgrna-5cattgacgcaaatgggcggtag(seq id no.13)p
cmv-sgrna-6ctctgcttatatagacctccca(seq id no.14)
[0122]
1.对mini-crisd载体质粒进行bsmbi限制性内切酶切割。
[0123]
2.琼脂糖凝胶电泳回收载体片段。
[0124]
3.合成包含上述识别序列的引物，每个识别序列合成2条互补引物、且引物末端含有bsmbi切割后的粘端序列，在pcr仪上对引物进行退火反应以形成带bsmbi粘末端的双链接头。退火方式：2条引物各100um溶于te缓冲液中，95℃孵育5分钟后，缓慢降温至室温。
[0125]
4.退火后的接头片段与酶切回收的mini-crisd载体质粒在t4连接酶16度条件下反应过夜。
[0126]
5.转化并获得单克隆。测序显示表达质粒构建成功，即根据cmv启动子设计的识别序列替换掉了mini-crisd载体质粒上的空白序列，获得4个靶向cmv启动子的mini-crisd表达质粒(携带靶向cmv启动子的sgrna)。
[0127]
实施例4
[0128]
在a549细胞中使用mini-crisd方法对甲基化的荧光报告质粒进行去甲基化测试。详细步骤如下。
[0129]
1)a549细胞以5000个/孔的密度均匀接种于96孔板，使用ham's f-12k培养基(含10％胎牛血清)，在37℃、5％co2的恒温培养箱中培养。
[0130]
2)24小时后使用lipofectamine 3000向a549细胞同时转染从实施例2中获得的50％甲基化的荧光报告质粒与实施例3中获得的mini-crisd表达质粒各50ng(携带p
cmv-sgrna3、4、5、6中的一个)。对照组为同时转染50％甲基化的荧光报告质粒和mini-crisd载体(不含sgrna)质粒各50ng。
[0131]
3)48小时后去除培养基，pbs漂洗2遍后用4％多聚甲醛固定，15分钟后吸去4％多聚甲醛，pbs漂洗一遍，每孔加入30μl dapi染色液，5分钟后吸去染色液，pbs漂洗2遍，每孔加入100μl pbs。
[0132]
4)使用thermo scientific cell insight cx7-lzr高内涵分析系统内置软件hcs navigator version6.6.1采集图像和数据处理。96孔板每孔选取25个视野，每个视野拍摄405nm和488nm激发波长下的图像；dapi染色后细胞核在405nm激发波长下呈蓝色，细胞中表达的gfp荧光蛋白在488nm激发波长下呈绿色；系统通过识别蓝色区域精确定位细胞核位置，以细胞核外扩固定值识别细胞范围，并计算每个细胞范围内绿色荧光值，最后计算25个视野中所有标记细胞范围内的绿色荧光强度的平均值。
[0133]
本实施例的测试思路如图5所示。启动子发生甲基化的基因无法发生转录和蛋白表达，因此当pegfp-n1荧光报告质粒发生100％甲基化时，观察不到gfp绿色荧光蛋白在细胞中的表达；而当pegfp-n1荧光报告质粒发生部分甲基化时，gfp绿色荧光蛋白在细胞中低表达；而如果mini-crisd可以对启动子区域去甲基化，则gfp绿色荧光蛋白能够重新表达。因此，在本实施例中，gfp荧光强度与质粒甲基化程度呈反向线性相关。
[0134]
为了对mini-crisd的去甲基化效果进行定量，我们以50％甲基化的荧光报告质粒为例。如图6所示，50％甲基化的荧光报告质粒在细胞中的荧光强度很低；加入mini-crisd后，mini-crisd在靶向cmv启动子区域的sgrna引导下对该区域特性的去甲基化，显著提高了gfp荧光蛋白的表达和荧光强度。而在不加入sgrna的对照组，即使有mini-crisd融合蛋白也没有提高荧光强度，证实观测到的gfp表达量增加(即荧光强度增强)是因为靶向的dna去甲基化所致。
[0135]
实施例5：
[0136]
在293t细胞中使用mini-crisd方法对甲基化的荧光报告质粒进行去甲基化测试。详细步骤如下。
[0137]
1)293t细胞以12000个/孔的密度均匀接种于96孔板，使用dmem高糖培养基(含10％胎牛血清)，在37℃、5％co2的恒温培养箱中培养。
[0138]
2)24小时后使用lipofectamine 3000向293t细胞同时转染从实施例2中获得的75％甲基化的荧光报告质粒与实施例3中获得的mini-crisd表达质粒各50ng(携带p
cmv-sgrna3、4、5、6中的一个)。对照组为同时转染50％甲基化的荧光报告质粒和mini-crisd-dead(去甲基化失活突变)质粒各50ng。
[0139]
3)48小时后去除培养基，pbs漂洗2遍后用4％多聚甲醛固定，15分钟后吸去4％多聚甲醛，pbs漂洗一遍，每孔加入30μl dapi染色液，5分钟后吸去染色液，pbs漂洗2遍，每孔加入100μl pbs。
[0140]
4)使用thermo scientific cell insight cx7-lzr高内涵分析系统采集图像。96孔板每孔选取25个视野，每个视野拍摄405nm和488nm激发波长下的图像；dapi染色后细胞核在405nm激发波长下呈蓝色，细胞中表达的gfp荧光蛋白在488nm激发波长下呈绿色；系统通过识别蓝色区域精确定位细胞核位置，以细胞核外扩固定值识别细胞范围。然后取25个视野中的5个随机视野，对三个复孔进行相同的方式选取，使用imagej软件计算平均荧光强度，即：平均荧光强度(mean)＝该区域荧光强度总和(intden)/该区域面积(area)。
[0141]
为了对mini-crisd的去甲基化效果进行定量，我们以75％甲基化的荧光报告质粒为例。结果如图7所示，75％甲基化的荧光报告质粒在细胞中的荧光强度较低；加入mini-crisd后，mini-crisd在靶向cmv启动子区域的sgrna引导下对该区域特性的去甲基化，显著提高了gfp荧光蛋白的表达和荧光强度。而mini-crisd-dead因为失活了去甲基化的活性位点，即使加入了靶向启动子的sgrna也没有提高荧光强度，进一步证实观测到的gfp表达量的增加(即荧光强度的增强)是因为靶向的dna去甲基化所致。
[0142]
实施例6
[0143]
通过mini-crisd方法靶向抑癌基因rassf1a启动子区域进行去甲基化，从而提高肺癌细胞中rassf1a的表达水平。包括以下步骤。
[0144]
1)构建靶向人因组中抑癌基因rassf1a启动子的mini-crisd质粒。选取rassf1a启动子上符合cjcas9 pam序列要求的识别序列6条(见下表)，dna靶点在基因组和rassf1a启动子上的相对位置如图8所示。其中p
rassf1a-sgrna-8使用的是5
’‑
nnnnaca-3’pam位点，其余sgrna使用的是5
’‑
nnnvryac-3’pam位点。
[0145]
按照和实施例3中相同的构建方法，用上述识别序列替换mini-crisd载体质粒上的空白序列，获得6个靶向人抑癌基因rassf1a启动子的mini-crisd表达质粒(携带靶向人抑癌基因rassf1a启动子的sgrna)。
[0146]
p
rassf1a-sgrna-3ttccttccctccttcgtcccct(seq id no.15)p
rassf1a-sgrna-4gcttgctagcgcccaaagccag(seq id no.16)p
rassf1a-sgrna-5ctgagctcattgagctgcggga(seq id no.17)p
rassf1a-sgrna-6ccccagatgaagtcgccacaga(seq id no.18)p
rassf1a-sgrna-7tgcgacaagggataaaccattt(seq id no.19)
p
rassf1a-sgrna-8ccagggaccagctgccgtgtgg(seq id no.20)
[0147]
2.人肺癌细胞a549和h1299的培养
[0148]
a549细胞以25000个/孔的密度均匀接种于6孔板，使用ham's f-12k培养基(含10％fbs)；h1299细胞以30000个/孔的密度均匀接种于6孔板，使用rpmi-1640培养基(含10％fbs)。在37℃、5％co2环境的恒温培养箱中培养。
[0149]
3.人肺癌细胞中rassf1a启动子的去甲基化和rassf1a表达的检测。
[0150]
24小时后更换为新鲜培养基并进行转染实验。使用lipofectamine 3000向a549或h1299细胞转染1ug的mini-crisd表达质粒(携带p
rassf1a-sgrna3、4、5、6、7、8中的一个)。6小时后更换为新的培养基。对照组使用mini-crisd-dead(去甲基化失活突变)质粒1ug。
[0151]
其中a549细胞实验中还使用了dna甲基化小分子抑制剂地西他滨作为一组阳性对照，将地西他滨(sigma，货号a3656)溶于dmso制成10mm母液，每2ml细胞培养基加入2ul地西他滨母液使得地西他滨终浓度10um、每24小时更换新的含地西他滨的培养基。
[0152]
48-72小时后使用steadypure通用型rna提取试剂盒(广州瑞真，货号ag21022)提取转染细胞的总rna，并用evo m-mlv反转录试剂盒(广州瑞真，货号ag11711)和sybr green pro taq hs预混型qpcr试剂盒(广州瑞真，货号ag11702)进行rt-qpcr实验，检测rassf1a基因的表达。qpcr检测rassf1a的引物为：gaagtcattgaggccctgct和atcatccaacagcttccgca。
[0153]
结果如图9所示，mini-crisd在a549和h1299细胞中靶向抑癌基因rassf1a启动子区域并去甲基化，使肺癌细胞中的rassf1a基因得到了明显的提升，促进了rassf1a基因的表达。mini-crisd靶向去甲基化的效果(基于rassf1a基因表达水平的提升)明显优于非靶向的小分子抑制剂(地西他滨)。
[0154]
实施例7：通过mini-crisd方法靶向提高抑癌基因rassf1a表达水平，促进肺癌细胞的死亡。
[0155]
1.按实施例6中相同的方法向a549肺癌细胞中转染1ug的mini-crisd表达质粒(携带p
rassf1a-sgrna7)。转染48-72小时后，对a549细胞进行calcein-am/pi活细胞/死细胞双染色检测。
[0156]
2.从低温冰箱内取出10
×
assay buffer，用去离子水做10倍稀释以得到1
×
assay buffer。取5μl calcein-am溶液(2mm)和15μl pi溶液(1.5mm)加入5ml 1
×
assay buffer，充分混匀获得染色液。
[0157]
3.去除培养基，用pbs清洗细胞2次，用1
×
assay buffer清洗细胞2次。取500μl染色工作液加入贴壁细胞的共聚焦皿中心，避光37℃孵育15min。
[0158]
4.激光共聚焦显微镜下使用488nm激发光检测活细胞(绿色荧光)、535nm激发光检测死细胞(红色荧光)。calcein-am本身不发荧光，进入细胞后被细胞内酯酶剪切形成膜非渗透性的calcein滞留在细胞内并发出强绿色荧光；而死细胞缺乏酯酶活性，因此calcein-am仅标记活细胞。碘化丙啶(propidium iodide，pi)不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜到达细胞核，并嵌入细胞dna双螺旋从而产生红色荧光，因此pi仅标记死细胞。
[0159]
结果如图10所示，mini-crisd在a549细胞中靶向抑癌基因rassf1a启动子区域并去甲基化，促进了rassf1a基因的表达，从而导致a549细胞产生了死亡，相比对照组mini-crisd-dead组和未转染组具有显著性差别。
[0160]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并
不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。