检测人血清外泌体中miR-671-5p试剂的应用及骨质疏松检测试剂盒

检测人血清外泌体中mir-671-5p试剂的应用及骨质疏松检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物、医学检测领域，特别涉及检测人血清外泌体中mir-671-5p试剂的应用及骨质疏松检测试剂盒。


背景技术：

2.我国60岁以上老年人患病率为36%，初期可无明显症状，被称为“寂静的疾病”， 难以早期发现和诊断，目前只能通过骨密度检测筛查，预防大于治疗，没有更好的检测方法。
3.外泌体（exosome）是一种脂质双分子层结构、由细胞内向外分泌的纳米级囊泡，直径在30-150nm，包含特定的蛋白质、脂质、核酸等物质，其包含的各种成分介导了细胞与细胞间的信息传递，具有广泛的生物学活性。mirna是一类长度为19-22碱基的非编码rna，在组织和血液循环中广泛存在，其中大部分mirna包涵在外泌体内，它可以稳定地在血液中运输，并且在个体中表达量稳定。骨组织来源的外泌体及其内含的mirna在骨骼重塑中起重要作用。目前研究表明，来源于骨组织的外泌体mirna可以影响成骨与骨质疏松。有学者提取骨量正常人和骨质疏松老年人血清中的外泌体培养人成骨细胞系hfob 1.19，结果发现骨质疏松患者血清外泌体抑制了成骨细胞分化。这些研究提示老年血清外泌体可能与骨形成、骨折疏松的发生密切相关。经前期研究表明老年性骨质疏松患者血清外泌体中mir-671-5p高表达，它通过抑制bmpr1a及成骨标记物alp和osx的表达，抑制hbmscs的成骨分化，因此血清外泌体中mir-671-5p可以作为骨质疏松的早期诊断指标进行应用推广。
4.从血清中提取外泌体，运用荧光pcr检测mir-671-5p，目前有染料法和探针法，染料法特异性不如探针法，目前这两种方法都是通过内参ct值进行相对定量的方法，无法准确定量出具体的分子拷贝数，检测下限和灵敏性都不可知。而且目前已有的方法都是单通道单色检测， microrna和内参各需要单独一管进行pcr，检测效率低下、成本高。
5.本发明的microrna双重荧光定量pcr在同一个反应管中同时加入mir-671-5p和内参的两套引物和两种不同荧光的探针，同时进行荧光定量pcr互不干扰，一管反应可以获得两个结果，比目前的单色荧光定量pcr提高了100%的效率、消除了单色荧光定量方法相同两个标本之间的误差、提高了精确度、降低了50%试剂成本、操作更简便。本发明提供的mir-671-5p定量参考品，能够绘制标准曲线并且定量标本中mir-671-5p的拷贝数浓度，比目前的相对定量方法更直接、客观。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的是提供一种检测人血清外泌体中mir-671-5p试剂在制备骨质疏松检测试剂盒中的应用。本发明首次发现人血清外泌体中mir-671-5p表达量在骨质疏松患者和正常人之间具有显著差异，可以将其作为骨质疏松的检测标记物，为老年人骨质疏松的预测评估提供新的途径，具有重要的临床意义。
7.mir-671-5p的序列为aggaagcccuggaggggcuggag。
8.检测人血清外泌体中mir-671-5p试剂包括pcr检测试剂。
9.进一步优选为双重荧光定量pcr检测试剂。
10.扩增mir-671-5p的pcr引物序列如下：上游引物：tcaaggaagccctggagg下游引物：aggtcacgaggctccataa。
11.内参ref2的pcr引物序列如下：上游引物：tccgctaagtctagaacgg下游引物：aggtcacgaggctccataa。
12.进一步地，mir-671-5p逆转录引物和探针序列如下：mir-671-5p逆转录引物：caggataggtcacgaggctccataagcgtgagctatgctgctccagccmir-671-5p荧光探针：tgagctatgctgctccagcccctcc。
13.用于作为内参检测的ref1逆转录引物和探针序列如下：ref2逆转录引物：caggataggtcacgaggctccataagcgtgagctatgctgtcgtgtttref2荧光探针：tgagctatgctgtcgtgtttccgtt。
14.进一步地，mir-671-5p荧光探针5’端连有荧光基团fam，3’端连有猝灭基团bhq1；内参ref2荧光探针5’端连有荧光基团hex，3’端连有猝灭基团bhq1。
15.进一步地，用于绝对定量的参考品和标准化内参ref1包括：mir-671-5p参考品序列：tcaaggaagccctggaggggctggagcagcatagctcacgcttatggagcctcgtgacct标准化内参ref2序列：cuaagucuagaacggaaacacga。
16.人mir-671-5p定量参考品为一段长为60碱基的人工合成dna序列，根据摩尔分子数计算分子拷贝数稀释而成。该人mir-671-5p定量参考品包括a、b、c、d四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为4.00e+07copies/ml(a)、4.00e+06 copies/ml(b)、4.00e+05 copies/ml(c)、 4.00e+04 copies/ml(d) 。
17.标准化内参ref2为一段长为23碱基的人工合成rna序列。
18.本发明的第二个目的是提供一种骨质疏松检测试剂盒，能够应用于骨质疏松的早期辅助诊断，解决了骨密度检测结果的滞后问题，尤其是本发明的双重荧光定量pcr检测试剂能够解决现有技术中单色荧光pcr效率低，特异性差，灵敏度低，内参不恒定，不能绝对定量分子拷贝浓度等技术问题。
19.该骨质疏松检测试剂盒，包括前述的检测人血清外泌体中mir-671-5p试剂。
20.优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括外泌体mirna提取试剂：peg6000（聚乙二醇6000）、trizol试剂（购自invitrogen公司）、小分子rna吸附柱（购自magen公司）、洗液1（75%乙醇）、洗液2（85%乙醇）。选择peg6000沉淀外泌体，再用trizol试剂溶解，强烈的变性蛋白和保护rna不被降解，然后氯仿萃取出rna,通过小分子吸附柱纯化出microrna，操作步
骤简单、高效。
21.优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括3
×
逆转录混合液，包括：120mmol/l tris-hcl（ph 8.3），120mmol/l kcl,9mmol/l mgcl2，21mmol/l dtt，15u/μl逆转录酶，1.5u/μl rna酶抑制剂，1.5mmol/l脱氧核糖核苷三磷酸（dntp）。
22.优选地，本发明提供的试剂盒进一步包括2
×
dna聚合酶(taq酶)混合液，包括：0.05u/μl dna聚合酶，100mmol/l tris-hcl（ph 8.5），100mmol/l kcl, 3mmol/l mgcl2，0.4 mmol/l 脱氧核糖核苷三磷酸（dntp）。
23.此外，本发明还提供了人mir-671-5p的逆转录和扩增引物、探针，包括：用于逆转录人mir-671-5p采用的茎环法逆转录引物：caggataggtcacgaggctccataagcgtgagctatgctgctccagcc用于检测人mir-671-5p的荧光探针：tgagctatgctgctccagcccctccmir-671-5p探针5’端连有荧光基团fam，3’端连有猝灭基团bhq1。
24.用于扩增人mir-671-5p的pcr上游引物：tcaaggaagccctggagg用于扩增人mir-671-5p的pcr下游引物：aggtcacgaggctccataa优选地，本发明进一步提供了用于作为内参检测的ref2引物和探针，包括：用于逆转录内参ref2采用的茎环法逆转录引物：caggataggtcacgaggctccataagcgtgagctatgctgtcgtgttt用于检测内参ref2的荧光探针：tgagctatgctgtcgtgtttccgtt内参ref2探针5’端连有荧光基团hex，3’端连有猝灭基团bhq1。
25.用于扩增内参ref2的pcr上游引物：tccgctaagtctagaacgg用于扩增内参ref2的pcr下游引物：aggtcacgaggctccataa本发明试剂盒用于检测血清、血浆外泌体等未知样本中的人mir-671-5p浓度的操作步骤，按照microrna提取、microrna逆转录、荧光定量pcr的流程，具体详细步骤如下：步骤1.在血清中加入peg(终浓度8%+0.5mnacl)， 4℃孵育过夜，3500g 离心30min，弃上清沥干液体。加入500ul的pbs(ph:7.4)重悬，用终浓度5%peg再次沉淀，4℃孵育最少1h, 3500g 离心30min，弃上清,沥干液体，加入100ul的pbs(ph:7.4)重悬，获得外泌体。
26.步骤2. 用5倍于外泌体体积的trizol试剂处理外泌体，并加入内参至25pmol/l，反复吹打混匀至充分溶解，室温静置10分钟。加入1倍于外泌体体积的氯仿，振荡15秒后静置3分钟。12000g以上高速离心15分钟，转移上层水相即萃取出的外泌体总rna至1.5ml无rna酶离心管,并加入等体积异丙醇混匀，室温静置10分钟。
27.步骤3.将异丙醇处理的rna加入小分子rna吸附柱离心过滤，用500μl洗液1离心洗涤一次，再用500μl洗液2离心洗涤两次，去除杂质，最后用15μl无rna酶水离心洗脱小分子rna吸附柱，获得了外泌体中microrna。
28.步骤4.对提取的microrna进行逆转录：取9.5μl提取的microrna、5μl的3
×
逆转录混合液和0.1μl的3μmol/l逆转录引物混合液，充分混匀，置于42℃进行逆转录30分钟，再于70℃孵育5分钟灭活逆转录酶，逆转录获得的cdna置冰盒中备用。
29.步骤5.双重荧光定量pcr：取15μl逆转录好的cdna，加入25μl的 2
×
dna聚合酶混合液、5μl的2μmol/l探针引物混合液、5μl去离子水，于pcr管内混匀，进行荧光定量pcr反
应，反应条件为：95℃3分钟，进入循环：95℃12秒，60℃30秒（检测荧光），运行45-50个循环结束。
30.步骤6.分析结果数据，通过标准品拷贝数和ct值绘制标准曲线，计算获得待测样本中人mir-671-5p浓度，通过内参ct值和扩增曲线来监控mirna提取和rt-pcr是否正常，如果内参结果异常，则表示本次结果不可靠，需查找原因进行复查。
31.本发明试剂盒因为采用检测人外泌体mir-671-5p和内参的探针都具有很好的特异性，应用本发明提供的试剂盒，首次对血清、血浆外泌体等未知样本中的人mir-671-5p的浓度进行快速、精准测定，进而用于骨质疏松的辅助检测。本发明特异性好，双重荧光pcr能够在同一管中同时检测出人外泌体mir-671-5p和内参，比现有的单色荧光pcr方法效率提高了100%。进一步地，因为本发明试剂盒通过外加标准化内参，解决了血清外泌体中常用microrna内参u6等因个体化差异不恒定的问题，既可以有效监控假阴性的存在，还可以通过内参ct值校正不同血清外泌体样本microrna提取过程和pcr过程中产生的实验操作误差，对实验结果的重复性和稳定性有明显改善。总之，本试剂盒在很大程度上简化了实验的步骤，降低了成本，提高了特异性和灵敏度，在4e+07 copies/ml至4.00e+04copies/ml浓度范围内有极好的线性关系(r2=0.99989)。
附图说明
32.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：图1为本发明提供的试剂盒人血清外泌体mir-671-5p定量参考品a(4.00e+07 copies/ml)、b(4.00e+06 copies/ml)、c(4.00e+05 copies/ml)、d(4.00e+04 copies/ml)的扩增曲线图；图2为本发明提供的试剂盒人血清外泌体mir-671-5p荧光定量pcr检测定量分析的标准曲线图；图3为应用本发明提供的试剂盒检测了10例老年人血清样本中外泌体mir-671-5p浓度，每个标本在同一管中同时扩增人mir-671-5p和内参的双重荧光定量pcr扩增曲线结果图；图4为10例老年人骨质疏松患者与正常老年人对照血清中外泌体mir-671-5p浓度均值柱状图。
具体实施方式
33.以下通过实施例对本发明作进一步阐述，而不会形成对本发明保护范围的限制。
34.实施例1.人血清/血浆中外泌体microrna提取（1）取200μl血清/血浆加入1.5ml离心管，加入peg(终浓度8%+0.5mnacl)， 4℃孵育过夜，3500g 离心30min，弃上清沥干液体。加入500ul的pbs(ph:7.4)重悬，用终浓度5%peg再次沉淀，4℃孵育最少1h, 3500g 离心30min，弃上清,沥干液体，加入100ul 的pbs(ph:7.4)重悬。
35.（2）每管加入0.5ml的trizol试剂，并加入1nmol/l的内参2.5μl，混匀，室温放置10分钟。每管加入100μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
36.（3）4℃，12000
×
g离心15分钟，吸取300μl上清至新的1.5ml离心管中，并加入300μ
l异丙醇，混匀，室温静置10分钟。
37.（4）把小分子rna吸附柱装在真空抽吸装置上，转移所有rna异丙醇混合液至小分子rna吸附柱中，打开真空泵抽吸1分钟。
38.（5）加入500μl洗涤液1至柱中，真空抽吸1分钟。加入500μl洗涤液2至柱中，真空抽吸1分钟，再加入500μl洗涤液2至柱中，真空抽吸1分钟。最后把小分子rna吸附柱装在2ml收集管中，12000
×
g离心3分钟，充分甩干。
39.（6）将柱子转移至无rna酶的1.5ml离心管中，加入15μl无rna酶水至柱中，静置2分钟，12000
×
g离心2分钟，丢弃柱子，microrna置冰盒中备用。
40.实施例2.microrna逆转录（1）取3
×
逆转录混合液5μl、1μmol/l的逆转录引物混合液0.5μl加入0.2ml无rna酶的pcr薄壁管中。
41.（2）取提取好的microrna 9.5μl加入上述混合液中，吹打混匀。
42.（3）放入pcr仪进行逆转录，条件为：42℃30分钟，70℃5分钟。获得的cdna置冰盒中备用。
43.实施例3.双重荧光定量pcr（1）取2
×
pcr混合液25μl、2μmol/l探针引物混合液5μl、去离子水5μl加入0.2ml的8联pcr管中。
44.（2）每管加入15μl逆转录好的cdna，混匀。
45.（3）将pcr反应管放入荧光定量pcr扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度（4）荧光检测通道的选择：通过软件选择fam通道检测mir-671-5p，选择 hex检测内参。
46.（5）荧光定量pcr反应条件为：95℃3分钟，进入循环：95℃12秒，60℃30秒（检测荧光），运行45个循环结束。
47.（6）结果分析：反应结束后，仪器自动保存结果。在相应的通道，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为ct(即cycle threshold，指pcr反应管内的荧光信号达到设定的阈值时，所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本人外泌体mir-671-5p的5个浓度梯度定量参考品扩增曲线（见图1），获得ct值绘制标准曲线（见图2），每个标本通过双重荧光pcr扩增可以在同一个反应管内同时获得人外泌体mir-671-5p和内参2条扩增曲线（见图3），软件可以自动求得各样本的定值结果。如果样本扩增曲线呈s型，有ct值且定值结果 ≥500copies/ml，报告具体拷贝数浓度；如果定值结果 ≤500copies/ml，报告结果为低于检测下限；如果样本扩增曲线平直，无ct值显示或无定值结果显示，可以判为阴性。凡内参无扩增曲线或异常的数据为无效，应复查获得有效数据才能报告结果。
48.实施例4. 人血清外泌体mir-671-5p双重荧光定量pcr检测试剂盒在老年人骨质疏松预测评估中的应用：检测20例老年人血清外泌体标本的mir-671-5p浓度。
49.收集20例老年人的血清标本，各取200μl，按照上述实施例1、2、3所描述的方法检测人外泌体mir-671-5p。
50.检测结果按是否发生骨质疏松分两组统计：正常老年人组（10例）和老年人骨质疏松组（10例）。人血清外泌体mir-671-5p浓度对比见图4。由图4可见，老年人骨质疏松患者血清外泌体mir-671-5p浓度均有显著升高。因而，本试剂盒检测的人血清外泌体mir-671-5p浓度能够应用于老年人骨质疏松的预测、诊断评估。