IFN-γ抑制剂及其用途的制作方法

ifn-γ
抑制剂及其用途
技术领域
1.本技术涉及生物医药领域，具体的涉及一种降低细胞因子释放综合症的car-t细胞。


背景技术：

2.嵌合抗原受体t(car-t)细胞疗法已成为治疗癌症的一种新颖的、潜在的革命性疗法。然而，car-t细胞疗法的广泛应用由于出现了潜在的致命毒副作用而受到限制。这包括在car-t治疗期间出现的细胞因子释放综合症(crs)和神经毒性。在接受cart19细胞治疗的患者中，有高达50％的患者会出现3级或更高的crs或神经毒性，并且已经有数起死亡报告。目前还没有预防crs的有效疗法。
3.在机制上，crs被认为是由激活的car t细胞最初释放的促炎症细胞因子如γ干扰素(ifn-γ)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)所介导。这些细胞因子导致旁观者免疫细胞和内皮细胞的激活，这些细胞因子反过来激活更多的免疫细胞，最终形成细胞因子风暴。ifn-γ在crs的病理生理学中起着重要作用。ifn-γ可刺激巨噬细胞产生过量的细胞因子，如白细胞介素6(il-6)、tnf-α和白细胞介素10(il-10)。


技术实现要素：

4.本技术目的在于提供一种降低ifn-γ在活化的car-t细胞中表达的可行方法，并有助于防止crs的发生，从而提高car-t疗法的治疗效果。
5.本技术目的还在于提供一种降低ifn-γ表达的car-t细胞的制备方法，有助于防止crs的发生，并且对car分子的表达没有影响，对car-t细胞的杀伤效果几乎没有影响。
6.一方面，本技术提供一种分离的核酸分子，其用于在细胞内抑制ifn-γ基因的表达，所述核酸分子包反义含寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含与seq id no:1-6中任一项所示核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
7.在某些实施方式中，其中所述反义寡核苷酸包含与编码ifn-γ的mrna的至少一部分基本上互补的互补区域。
8.在某些实施方式中，其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸。
9.在某些实施方式中，其中所述互补区域的长度为17-21个核苷酸。
10.在某些实施方式中，其中所述互补区域的长度为19个核苷酸。
11.在某些实施方式中，其中所述的核酸分子当与表达所述ifn-γ的细胞接触时抑制所述ifn-γ的表达至少20％。
12.在某些实施方式中，所述核酸分子为dsrna。
13.在某些实施方式中，所述核酸分子为sirna。
14.在某些实施方式中，所述sirna包含正义链和反义链，所述反义链包含与编码ifn-γ的mrna的至少一部分基本上互补的互补区域，且所述反义链包含与seq id no:1-6中任一项所示核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸；所述正义链和反义链
互补共同形成长度介于17到21个核苷酸的互补区域。
15.所述sirna包含正义链和反义链，所述正义链包含seq id no:7-12中任一项或与其相差不超过3个核苷酸的序列，且所述反义链包含seq id no:1-6中任一项或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
16.在某些实施方式中，其中每个链的长度均介于17和23个核苷酸之间。
17.在某些实施方式中，所述sirna选自以下一种或多种组合：
18.i)seq id no:7所示核苷酸序列的正义链，和seq id no:1所示核苷酸序列的反义链；
19.ii)seq id no:8所示核苷酸序列的正义链，和seq id no:2所示核苷酸序列的反义链；
20.iii)seq id no:9所示核苷酸序列的正义链，和seq id no:3所示核苷酸序列的反义链；
21.iv)seq id no:10所示核苷酸序列的正义链，和seq id no:4所示核苷酸序列的反义链；
22.v)seq id no:11所示核苷酸序列的正义链，和seq id no:5所示核苷酸序列的反义链；和
23.vi)seq id no:12所示核苷酸序列的正义链，和seq id no:6所示核苷酸序列的反义链。
24.在某些实施方式中，其中每条链中不超过3个核苷酸分别被其它核苷酸所替代，同时基本保持了抑制培养的细胞中ifn-γ表达的能力。
25.另一方面，本技术提供一种载体，其包含本技术所述的核酸分子。
26.细胞，其包括本技术所述的核酸分子或本技术所述的载体。
27.在某些实施方式中，其包括免疫效应细胞。
28.在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞的包括t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、肥大细胞或吞噬细胞。
29.在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞其包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸分子。
30.在某些实施方式中，其中所述编码car的核酸分子包括mrna。
31.在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞包括工程化的免疫效应细胞。
32.在某些实施方式中，其中所述工程化的免疫效应细胞包括car-t细胞。
33.另一方面，本技术提供本技术所述的核酸分子，本技术所述的载体或本技术所述的细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
34.在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。
35.在某些实施方式中，其中所述肿瘤表达肿瘤相关抗原。
36.在某些实施方式中，其中所述肿瘤相关抗原包括cd19。
37.在某些实施方式中，其中所述药物包括car-t细胞。
38.在某些实施方式中，所述药物包括anti-cd19 car-t细胞。
39.另一方面，本技术提供本技术所述的核酸分子，本技术所述的载体或本技术所述的细胞在制备治疗car-t细胞治疗过程中由ifn-γ释放引起的免疫疗法相关毒性的药物中
的应用。
40.在某些实施方式中，其中所述免疫疗法相关毒性选自细胞因子释放综合征、神经毒性、神经炎症或其组合。
41.另一方，本技术提供一种组合物，其包含：
42.a.本技术所述的核酸分子，本技术所述的载体或本技术所述的细胞；和
43.b.药物上可以接受的载体。
44.另一方面，本技术提供一种抑制细胞中ifn-γ表达的方法，该方法包括：将细胞与本技术所述的核酸分子接触。
45.在某些实施方式中，其中所述接触在体内或体外进行。
46.在某些实施方式中，所述方法包括：
47.a)向细胞引入根据本技术所述的核酸分子；并且
48.b)将步骤a)产生的细胞维持一段足以实现ifn-γ基因的mrna转录物降解的时间，由此抑制细胞中ifn-γ基因的表达。
49.在某些实施方式，其中所述ifn-γ表达被抑制至少约20％。
50.另一方面，本技术提供一种调节t细胞功能的方法，所述方法包括将本技术所述的核酸分子引入t细胞。
51.在某些实施方式，其中引入本技术所述的核酸分子的t细胞表达的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的水平低于或等于由野生型t细胞表达的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的水平。
52.在某些实施方式中，其中与野生型t细胞相比，引入本技术所述的核酸分子的t细胞表达的ifn-γ被抑制至少约20％。
53.在某些实施方式中，所述方法还包括通过给予所述t细胞编码car的核酸分子来修饰所述t细胞的特异性。
54.在某些实施方式中，其中所述编码car的核酸分子包括mrna。
55.在某些实施方式中，其中所述car包括anti-cd19 car。
56.在某些实施方式中，其中mrna编码anti-cd19 car，其包含seq id no:13所示的核苷酸序列。
57.在某些实施方式中，其中所述anti-cd19 car包含seq id no:14所示的氨基酸序列。
58.在某些实施方式中，其通过选自以下的任一方式将本技术所述的核酸分子和/或所述编码car的核酸分子引入t细胞：超声处理、电脉冲、电穿孔、渗透压冲击、磷酸钙沉淀、deae葡聚糖转染、脂质介导的递送和被动递送。
59.在某些实施方式中，其通过电穿孔方法同时将本技术所述的核酸分子和所述编码car的核酸分子引入t细胞。
60.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
61.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
62.图1显示的是采用本技术不同的ifn-γsirna和对照sirna(nc)电穿孔的t细胞中ifn-γ细胞因子的细胞内染色结果。
63.图2显示的是采用本技术不同的ifn-γsirna和对照sirna(nc)电穿孔的t细胞释放ifn-γ细胞因子的elisa测试结果。
64.图3显示的是用抗cd19 fmc63 car mrna和不同数量的ifn-γsirna-1或对照sirna(nc)电穿孔的t细胞在不同时间段内的ifn-γ细胞因子的细胞内染色结果。
65.图4显示的是用抗cd19 fmc63 car mrna和不同数量的ifn-γsirna-1或对照sirna(nc)电穿孔的t细胞的利用cd19-fc重组蛋白在不同时间段的facs染色结果。
66.图5显示的含有5ug抗cd19 fmc63 car mrna和不同数量的ifn-γsirna-1或对照sirna(nc)的car-t细胞的杀伤曲线，其中e/t比＝3:1。
67.图6显示的含有5ug抗cd19 fmc63 car mrna和不同数量的ifn-γsirna-1或对照sirna(nc)的car-t细胞的杀伤曲线，其中e/t比＝1:1。
具体实施方式
68.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。
69.术语定义
70.在本技术中，“干扰素-γ(interferon gamma、interferon-γ、ifn-γ)”通常是指是水溶性二聚体的细胞因子。是ii型干扰素的唯一成员。它主要由自然杀伤细胞(nk)和自然杀伤t细胞(nkt)细胞分泌，在固有免疫中发挥作用；在抗原特异性免疫过程中，由cd4 th1和cd8细胞毒性t细胞分泌。
71.在本技术中，术语“免疫疗法相关毒性”通常是指由高水平的免疫活化引起的一系列炎性症状。不同类型的毒性与不同的免疫疗法方法相关。在一些实施例中，免疫疗法相关毒性包括毛细血管渗漏综合征、心脏病、呼吸系统疾病、car-t细胞相关脑病综合征(cres)、神经毒性、结肠炎、惊厥、细胞因子释放综合征(crs)、细胞因子风暴、左心室射血分数降低、腹泻、弥散性血管内凝血、水肿、脑病、皮疹、胃肠道出血、胃肠道穿孔、吞噬性淋巴细胞组织细胞增生症(hlh)、肝病、高血压、垂体炎、免疫相关不良事件、免疫性肝炎、免疫缺陷、局部缺血、肝毒性、巨噬细胞活化综合征(mas)、胸腔积液、心包积液、肺炎、多发性关节炎、后部可逆性脑病综合征(pres)、肺动脉高压、血栓栓塞和转氨酶升高。
72.在本技术中，术语“分离的”或“纯化的”通常是指至少部分从在其天然状态中通常与其结合的其他分子中分离的分子(例如多肽、核酸等)。术语“分离的核酸分子”是指从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物(例如，本技术提供的ifn-γsirna核酸序列)或其类似物，其已与至少约50％的当从来源细胞分离总核酸时与核酸分子一起被天然发现的多肽、肽、脂质、糖类、多核苷酸或其他材料分离。在一些实施方式中，分离的核酸分子大体上不含任何其他污染性核酸分子或在核酸的天然环境中发现
的可干扰其在多肽产生中的用途或其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的其他分子。
73.在本技术中，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”可互换使用，通常指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸或者其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针、sirna、mirna、shrna、dsrna和引物。多核苷酸可以在一个或多个碱基、糖和/或磷酸酯处以本技术所述或本领域已知的任何各种修饰或取代进行修饰或取代。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分阻断。多聚核苷酸可以在聚合后修饰，例如通过与标记组分偶联。该术语可以是双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本技术作为多核苷酸的任何实施方式包括双链形式和已知或据预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
74.在本技术中，术语“寡核苷酸”通常是指由多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物)通过磷酸二酯键(或其相关的结构变体或合成类似物)连接组成的聚合物。因此，虽然术语“寡核苷酸”一般指其中核苷酸残基和它们之间的连接是天然产生的核苷酸聚合物，但应理解，该术语的范围也包括各种类似物，包括但不限于：肽核酸(pna)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核酸等。该分子的确切大小可取决于具体应用。寡核苷酸一般长度较短，通常约有10-30个核苷酸残基，但该术语也可指任何长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”一般用于较大的寡核苷酸。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个未修饰的核糖核苷(rna)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(dna)和/或一个或多个修饰核苷。术语“修饰寡核苷酸”通常意指包含至少一个修饰核苷和/或至少一个修饰的核苷间键联的寡核苷酸。
75.在本技术中，术语“反义寡核苷酸”是指单链寡核苷酸分子，其具有与靶核酸(例如，目标基因组序列，mrna前体，或mrna分子)的相应片段互补的核碱基序列。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为12至30个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸是具有与靶核酸(如ifn-γmrna)序列互补的核苷酸序列的未经修饰或经修饰的核酸。
76.在本技术中，术语“dsrna”指核糖核酸分子的复合物，其具有包含两个反向平行且基本上互补的核酸链的双链体结构，称为具有相对于靶rna(即ifn-γ基因)的“正义”和“反义”取向。在本技术的一些实施方式中，双链rna(dsrna)通过转录后基因沉默机制(本文中称为rna干扰或rnai)触发靶rna(例如，mrna)的降解。双链体结构可为容许所需的靶rna通过risc途径的特异性降解的任何长度，且可在约19至36碱基对的长度范围内，例如，约19-30碱基对的长度，例如，约19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36碱基对的长度。上述范围与长度中间的范围与长度也包括为本技术的部分。
77.在本技术中，术语“短干扰rna(sirna)”是指干扰基因表达的小的双链rnas。sirnas是rna干扰(双链rna沉默同源基因的过程)的传递者。sirnas通常包含两条长为约15-25个核苷酸的单链rna，其形成双链体，其可以包含单链突出。通过酶复合体例如，聚合酶对双链rna的加工，产生双链rna的切割，从而产生sirnas。rna干扰(rnai)沉默复合体使用sirna的反义链引导mrna切割，从而促进mrna降解。为了使用sirnas例如，在哺乳动物细
胞中沉默特定基因，选择碱基对区域以避免对不相关mrna的机会性互补。在本领域中已经比如，例如，由fire等人，nature391：806-81(1998)和mcmanus等人，nat.rev.genet.3(10)：737-747(2002)鉴定了rnai沉默复合体。
78.在本技术中，术语“反义链”通常是指sirna的包括与靶序列实质上互补的区域的链。在本文中使用时，术语“互补性区域”通常指反义链上与本技术定义的序列(例如靶序列)实质上互补的区域。当互补性区域与靶序列不完全互补时，错配可以在分子的内部或末端区域。通常，最被容许的错配在末端区域，例如，在5’末端和/或3’末端的5、4、3或2个核苷酸内。
79.在本技术中，术语“正义链”通常是指sirna的这样一条链，所述链包括与作为在此定义的术语反义链的区域基本互补的区域。“正义”链有时被称为“有义”链，“过客”链或“反引导”链。借助它们的序列，反义链靶向所希望的mrna，同时正义链靶向不同靶标。因此，如果反义链被掺入risc中，则正确的靶标被靶向。正义链的掺入可以导致脱靶效应。这些脱靶效应可以通过在正义链上使用修饰或使用5’端帽加以限制。
80.在本技术中，术语“互补”当用于描述就第二核苷酸序列(如反义链)而言的第一核苷酸序列(如正义链或靶mrna)时是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(形成碱基对氢键)并形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包括沃森-克里克碱基对(watson-crick base pairs)或非沃森-克里克碱基对，并且包括天然或经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物，只要以上关于它们的杂交能力而言的需求得以实现。“互补”不必需在每个核苷上均具有核碱基互补性。相反，可以容忍一些错配。
81.在本技术中，术语“靶核酸”或“靶序列”通常指在ifn-γ基因转录期间所形成mrna分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为主要转录产物的rna加工产物的mrna。序列的靶部分应至少足够长以作为在ifn-γ基因转录期间形成的mrna分子的核苷酸序列的该部分位置处或附近反义寡核苷酸或sirna指导的切割的底物。在一个实施方式中，该靶序列在ifn-γ的蛋白质编码区内。靶序列可为约19-36个核苷酸的长度，例如，优选约19-30个核苷酸的长度。上述范围和长度中间的范围和长度也包括为本技术的部分。
82.在本技术中，术语“减少”和“降低”可互换使用并且通常表示小于原来的任何变化。“减少”和“降低”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比较。“减少”和“降低”包括完全耗竭。
83.在某些实施方式中，术语“降低”可以通过本领域已知标准方法(诸如本技术中描述的那些)检测的，基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量与相应基因、基因产品例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量相比约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或100％的总体降低。在某些实施方式中，术语“降低”指第一样品中基因或生物标志物的表达水平/量的降低，其中该降低是第二样品中相应基因或生物标志物的表达水平/量的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、或0.01倍。在某些实施方式中，第一样品是自受试者获得的样品，而第二样品是参照样品。
84.在本技术中，术语“药学上可接受的”通常是指不干扰活性成分生物学活性的有效性的一种或多种无毒物质。这类制剂通常可含有盐、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和
任选的其它治疗剂。这类药学上可接受的制剂通常也可包含适合给予人的相容性固体或液体填料、稀释剂或包囊材料。
85.在本技术中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，还通常包括预防疾病的发作，减缓或逆转疾病的进展，预防或减缓与疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与疾病相关的一种或多种症状，降低疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和/或持续时间和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度的进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理损伤，以及通常对正在治疗的患者有益的任何药理学作用。本技术的car-t细胞或药物组合物形成可行的治疗剂不需要实现完全治愈或根除疾病的任何症状或表现。如在相关领域中所认识到的，用作治疗剂的药物可降低给定疾病状态的严重程度，但不需要消除疾病的每种表现才能被认为是有用治疗剂。类似地，预防性施用的治疗构成可行的预防剂不需要完全有效地预防病症的发作。简单地在受试者中减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重程度，或通过提高另一种治疗的有效性，或通过产生另一种有益效果)，或减少疾病发生或恶化的可能性就足够了。
86.在本技术中，术语“疾病”或“病症”可以互换使用，通常是指受试者与正常状态的任意偏离，例如身体或某些器官的状态的任何变化，妨碍或扰乱了功能的履行，和/或在患病或与其接触的人中引起症状例如不适、机能障碍、痛苦或甚至死亡。
87.在本技术中，术语“肿瘤”通常是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”,“癌性”,“细胞增殖性病症”,“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。在本技术中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或血液瘤。
88.本技术中，术语“施用”通常是指通过任意引入或递送途径将本技术药物制剂引入受试者的身体中。可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与所述药物接触的任何方法。所述施用可以包括而不限于静脉内、动脉内、鼻内、腹内、肌内、皮下透皮或口服。每日剂量可以划分成一个、两个或更多个合适形式的剂量以在某个时间段期间的一个、两个或更多个时间施用。
89.在本技术中，术语“接触”通常是指两种两个或更多个不同类型的物质以任何顺序、任何方式以及任何时长接触在一起。接触可以发生在体内(in vivo)、间接体内(ex vivo)或体外(in vitro)。
90.在本技术中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”通常是指当单独或与另一种治疗剂组合给有疾病发展或疾病复发的风险的受试者施用时抑制疾病的发展或复发的药物量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法对治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力进行评估，比如在处于临床试验期间的人类受试者中、在动物模型系统中预测对人类的功效、或者通过在体外测定中测定药剂的活性。
91.在本技术中，术语“受试者”通常是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病的人或非人动物(包括哺乳动物)，诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩
猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型。
92.在本技术中，术语“包括”、“包含”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体通常旨在是开放式过渡性短语、术语或词语，其不排除额外行为或结构的可能性。术语“由
……
组成”通常表示不能存在别的组分(或同样地，特征、整数、步骤、等)。除非上下文另有明确规定，单数形式如英文的“a”，“an”，“the”，中文的“一个”、“一种”和“所述/该”一般包括所指代事物的复数形式。
93.在本技术中，术语“约”通常意指大约(approximately)、在......的附近(in the region of)、粗略地(roughly)、或左右(around)。当术语“约”当用于指涉数值范围时，截值或特定数值用于指示所载明的数值可与该列举数值有多达10％的差异。因此，术语“约”可用于涵盖自特定值
±
10％或更少的变异、
±
5％或更少的变异、
±
1％或更少的变异、
±
0.5％或更少的变异、或
±
0.1％或更少的变异。
94.应理解，数字或一系列数字之前的术语“至少”包括与该术语“至少”相邻的数字，及逻辑上包括在内的所有后续数字或整数，如从上下文中明确的。例如，核酸分子中的核苷酸数目必需为整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少19个核苷酸”意指19、20或21个核苷酸具有所指示的性质。当“至少”出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可修饰该系列或范围中每一个数字。
95.应理解本文中采用的“不超过”或“低于”指与该短语相邻且逻辑上较低的值或整数，如从上下文逻辑而言，至零。例如，具有“不超过3个核苷酸”的突出端的双链体具有3、2、1或0个核苷酸的突出端。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时，应理解，“不超过”可修饰该系列或范围内每个数字。本文所采用范围同时包括上限与下限。
96.发明详述
97.分离的核酸分子
98.一方面，本技术提供一种分离的核酸分子，其用于在细胞内抑制ifn-γ基因的表达，所述核酸分子包反义含寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含选自以下序列中任意一个相差不超过3个、2个或1个核苷酸的至少15个连续核苷酸：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6。
99.在某些实施方式中，其中所述反义寡核苷酸包含与编码ifn-γ的mrna的至少一部分基本上互补或完全互补的互补区域。
100.在某些实施方式中，其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸。例如，所述互补区域产妇可以为15至25个核苷酸长度，又例如，所述互补区域的长度为17-21个核苷酸。
101.又例如，其中所述互补区域的长度为19个核苷酸。
102.在某些实施方式中，其中所述的核酸分子当与表达所述ifn-γ的细胞接触时抑制所述ifn-γ的表达至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
103.在某些实施方式中，所述核酸分子为反义寡核苷酸。
104.在某些实施方式中，所述核酸分子为dsrna。
105.在某些实施方式中，所述核酸分子为sirna。
106.本技术所述sirna可进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端，例如，1、2或3个核
苷酸。该突出端可在正义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可存在于sirna的反义或正义链的5
’‑
端、3
’‑
端或两端。该突出端可由一条链长于另一条链所造成，或由相同长度的两条链交错造成。该突出端可与靶mrna形成错配或其可与所靶向的基因序列互补或可为另一个序列。
107.在某些实施方式中，所述sirna包含正义链和反义链，所述反义链包含与编码ifn-γ的mrna的至少一部分基本上互补的互补区域，且所述反义链包含选自以下序列中任意一个相差不超过3个核苷酸的至少15、16、17、18或19个连续核苷酸：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6；所述正义链和反义链互补共同形成长度介于17到21个核苷酸的互补区域。例如，所述正义链和反义链互补共同形成长度为17、18、或19个核苷酸的互补区域。
108.例如，反义链包含选自以下序列中任意一个相差不超过3个核苷酸：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6；且所述正义链和反义链互补共同形成长度介于17、18或19个核苷酸的互补区域。
109.在某些实施方式中，所述sirna是19个核苷酸长的双端平端体。
110.例如，所述sirna包含正义链和反义链，所述正义链可以包含seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列，且所述反义链可以包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
111.在某些实施方式中，其中所述正义链和反义链可以选自下述任意一种或多种组合：
112.包含seq id no:7所示核苷酸序列的正义链，和包含seq id no:1所示核苷酸序列的反义链；
113.包含seq id no:8所示核苷酸序列的正义链，和包含seq id no:2所示核苷酸序列的反义链；
114.包含seq id no:9所示核苷酸序列的正义链，和包含seq id no:3所示核苷酸序列的反义链；
115.包含seq id no:10所示核苷酸序列的正义链，和包含seq id no:4所示核苷酸序列的反义链；
116.包含seq id no:11所示核苷酸序列的正义链，和包含seq id no:5所示核苷酸序列的反义链；和
117.包含seq id no:12所示核苷酸序列的正义链，和包含seq id no:6所示核苷酸序列的反义链。
118.在某些实施方式中，其中每个链的长度均介于17和23个核苷酸之间。
119.在某些实施方式中，其中每条链中不超过3个核苷酸分别被其它核苷酸所替代，同时基本保持了抑制培养的细胞中ifn-γ表达的能力。
120.在某些实施方式中，其中所述sirna包含至少一个修饰的核苷酸。
121.在某些实施方式中，其中所述正义链和/或反义链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成修饰的核苷酸。
122.在某些实施方式中，其中所述正义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸包含修饰。
123.载体和细胞
124.另一方面，本技术提供一种载体，其包含本技术所述的核酸分子。
125.在某些方式中，所述载体包括病毒载体，可以利用病毒载体将本技术的核酸分子引入细胞。此类病毒载体包括，例如重组逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒-1。通常将逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体理解为体内转移外源性基因，特别是进入人体而选用的重组基因递送系统。或者，它们可以用于将外源基因离体引入t细胞。这些载体将基因有效递送入t细胞，并且转移的核酸被稳定整合到宿主细胞的染色体dna中。
126.另一方面，本技术提供了一种细胞，其包括本技术所述的核酸分子或本技术所述的载体。
127.将核酸引入细胞(如t细胞)的方法是本领域熟知和常规实践的，包括转化、转染、电穿孔、核注射或与诸如脂质体、胶束、鬼影细胞(ghost cell)和原生质体等载体融合。宿主t细胞可以被分离和/或纯化。t细胞也可以是体内转化的细胞，以便引起多肽在体内瞬时或永久表达。该t细胞也可以是离体转化的分离的细胞，在转化后引入，例如以便在体内产生用于治疗目的的多肽。
128.可通过本领域熟知的转染方法将本发明的反义寡核苷酸或sirna引入t细胞。这些方法包括超声处理、电脉冲、电穿孔、渗透压冲击、磷酸钙沉淀和deae葡聚糖转染、脂质介导的递送、被动递送等。术语“转染”包括可用于将核酸引入哺乳动物细胞的多种技术，包括电穿孔、磷酸钙沉淀、deae-葡聚糖处理、脂质转染、显微注射和病毒感染。用于转染哺乳动物细胞的合适方法可以参见sambrook等.(《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual),第2版,冷泉港实验室出版社(1989))和其它实验室教科书。
129.在某些实施方式中，其包括免疫效应细胞，例如，t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、肥大细胞或吞噬细胞。
130.在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞包括工程化的免疫效应细胞，例如，所述工程化的免疫效应细胞包括car-t细胞。
131.另一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本技术的的核酸分子，和任选地包装插页、包装标签、说明书或其它标签。
132.嵌合抗原受体
133.在本技术中，术语“嵌合抗原受体”或“car”通常是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，car包含至少一个细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽在相同的多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，该组多肽彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些方面，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。一方面，car的刺激分子是与t细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域包含一级信号传导结构域(例如，cd3-ζ的一级信号传导结构域)。在一个方面，细胞质信号传导
结构域还包含一个或多个衍生自如下定义的至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，共刺激分子选自4-1bb(即cd137)，cd27，icos和/或cd28。一方面，car包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。一方面，car包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，car包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，car包括嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含至少两个衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，car包含car融合蛋白的氨基末端(n-ter)上任选的前导序列。在一个方面，car进一步包含在细胞外抗原识别结构域的n末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工过程中从抗原识别结构域(例如scfv)切除，并将car定位于细胞膜。
134.另一方面，本技术提供一种car-t细胞，所述的car-t细胞是由本技术所述的核酸分子修饰的car-t细胞。
135.术语“car-t”或“car-t细胞”通常是指能够表达car(又称“嵌合抗原受体”)的t细胞。所述car通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。car是嵌合抗原受体t细胞(car-t)的核心部件，其可包括靶向部分(例如，结合肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,taa)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。在一个实施方案中，car是anti-cd19 fmc63，其序列信息如表1所示：
136.表1 anti-cd19 fmc63 car序列
137.138.[0139][0140]
在一些实施方式中，car-t细胞是cd19 car-t细胞；在其它实施例中，car-t细胞是bmca car-t细胞；在其它实施例中，car-t细胞是双重cd19/cd22 car-t细胞。在其它实施例中，car-t细胞是双重cd19/cd20 car-t细胞。
[0141]
组合物
[0142]
另一方，本技术提供一种组合物，其包含：
[0143]
a.本技术所述的核酸分子，本技术所述的载体，本技术所述的细胞，或本技术所述
的car-t细胞；和
[0144]
b.药物上可以接受的载体。
[0145]
药学上可接受的载体通常是指适合给予对象的物质，其中该载体在生物学上无害，或不引起其它不良影响。此类载体通常是药物的惰性成分。通常，将载体与活性成分一起给予对象，而不会引起任何不希望的生物学效应或以有害的方式与其中所包含的药物组合物的任何其它组分相互作用。合适的药物载体描述于ma r t i n,《雷明顿药物科学》(remington's pharmaceutical sciences),第18版.,马克出版社.,伊斯顿,宾夕法尼亚州.,(1990)，其内容通过引用纳入本文。
[0146]
本技术的更具体形式提供了药物组合物，其包含治疗有效量的反义多核苷酸以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。此类组合物包括各种缓冲剂内含物(例如磷酸盐、tris-hcl、乙酸盐)、ph和离子强度剂以及添加剂，例如去污剂和增溶剂(例如吐温80、聚山梨酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。可以将这些物质掺入聚合化合物的颗粒制剂中，例如但不限于聚乳酸或聚乙醇酸，或掺入脂质体中。也可以使用透明质酸。此类组合物可影响所公开的组合物的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。所述组合物可以制备成液体形式，或者可以为干燥粉末，例如冻干形式。应当理解，本公开提供的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式给予。例如，用于给药的药物组合物可以通过注射、口服或通过肺或鼻途径给药。
[0147]
用途
[0148]
另一方面，本技术提供本技术所述的核酸分子，本技术所述的载体，本技术所述的细胞，或本技术所述的car-t细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0149]
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。
[0150]
在某些实施方式中，其中所述肿瘤表达肿瘤相关抗原。
[0151]
在某些实施方式中，其中所述肿瘤表达cd19，cd22，cd20和/或bcma。
[0152]
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括急性淋巴母细胞性白血病(all)、急性髓样白血病、b细胞幼淋巴细胞性白血病、b细胞急性淋巴样白血病(ball)、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、慢性髓样白血病、慢性或急性白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、毛细胞白血病、霍奇金病、恶性淋巴组织增生性病况、malt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、浆细胞增殖性病症、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞赘生物、浆细胞瘤(包括浆细胞恶液质；孤立性骨髓瘤；孤立性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤；和多发性浆细胞瘤)、poems综合征(也称为crow-fukase综合征；takatsuki病；和pep综合征)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbc)、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变、t细胞急性淋巴样白血病(tall)、t细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤或瓦氏巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤(mcl)、转化滤泡性淋巴瘤(tfl)、原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbcl)、多发性骨髓瘤、毛细胞淋巴瘤/白血病或其组合。
[0153]
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括急性淋巴细胞白血病(ball)、慢性b淋巴细胞白血病(bcll)，b细胞霍奇金氏淋巴瘤(bhl)和非霍奇金氏淋巴瘤(bnhl)。
[0154]
另一方面，本技术提供本技术所述的核酸分子，本技术所述的载体，本技术所述的细胞，或本技术所述的car-t细胞在制备car-t细胞治疗过程中由ifn-γ释放引起的免疫疗法相关毒性的药物中的应用。
[0155]
在另一方面，免疫疗法相关毒性包括脑疾病、损伤或功能障碍。在相关方面，脑疾病、损伤或功能障碍包括car-t细胞相关nt或car-t细胞相关脑病综合征(cres)。在相关方面，抑制或降低脑疾病、损伤或功能障碍的发生率包括减轻受试者的头痛、谵妄、焦虑、震颤、癫痫发作活动、困惑、觉醒度改变、幻觉、言语障碍、共济失调、失用症、面神经麻痹、运动无力、癫痫发作、非抽搐eeg癫痫发作、意识水平改变、昏迷、内皮活化、血管渗漏、血管内凝血或其任何组合。在另一方面，免疫疗法相关毒性包括car-t诱导的细胞因子释放综合征(crs)。在相关方面，抑制或降低crs的发生率包括减少或抑制但不限于高烧、肌痛、恶心、低血压、低氧或休克或其组合。在相关方面，免疫疗法相关毒性是危及生命的。
[0156]
在某些实施方式中，其中所述免疫疗法相关毒性是选自细胞因子释放综合征、神经毒性、神经炎症或其组合。
[0157]
调节t细胞的方法
[0158]
另一方面，本技术提供一种抑制细胞中ifn-γ表达的方法，该方法包括：将细胞与本技术所述的核酸分子接触。
[0159]
在某些实施方式中，其中所述接触在体内或体外进行。
[0160]
在某些实施方式中，所述方法包括：
[0161]
a)向细胞引入根据本技术所述的核酸分子；并且
[0162]
b)将步骤a)产生的细胞维持一段足以实现ifn-γ基因的mrna转录物降解的时间，由此抑制细胞中ifn-γ基因的表达。
[0163]
在某些实施方式，其中所述ifn-γ表达被抑制至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0164]
另一方面，本技术提供一种调节t细胞功能的方法，所述方法包括将本技术所述的核酸分子给予所述t细胞。
[0165]
在某些实施方式，其中引入本技术所述的核酸分子的t细胞表达的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的水平低于或等于由野生型t细胞表达的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的水平。
[0166]
在某些实施方式中，其中与野生型t细胞相比，引入本技术所述的核酸分子的t细胞表达的ifn-γ被抑制至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0167]
在某些实施方式中，所述方法还包括通过给予所述t细胞编码嵌合抗原受体(car)基因的核酸分子来修饰所述t细胞的特异性。
[0168]
在某些实施方式中，其中所述编码嵌合抗原受体(car)基因的核酸分子包括mrna。
[0169]
在某些实施方式中，其中所述car包括cd19 car。
[0170]
在某些实施方式中，其中所述cd19 car包含seq id no:14所示的氨基酸序列。
[0171]
在某些实施方式中，其中mrna编码cd19 car，其包含seq id no:13所示的核苷酸序列。
[0172]
在某些实施方式中，其通过选自以下的任一方式将本技术所述的核酸分子和/或所述编码car基因的核酸分子引入t细胞：超声处理、电脉冲、电穿孔、渗透压冲击、磷酸钙沉
淀、deae葡聚糖转染、脂质介导的递送和被动递送。
[0173]
在某些实施方式中，其通过电穿孔方法同时将本技术所述的核酸分子和所述编码car基因的核酸分子引入t细胞。
[0174]
治疗方法
[0175]
另一方面，本技术提供一种免疫疗法，包括向有此需要的受试者施用有效量的经本技术所述的核酸分子修饰的嵌合抗原受体表达性t细胞(car-t细胞)、t细胞受体修饰的t细胞(tcr-t)、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、嵌合抗原受体修饰的天然杀伤细胞(car-nk)或树突状细胞或其任何组合。
[0176]
细胞因子风暴包括由细胞因子与白细胞之间的正反馈回路组成的免疫反应，其中各种细胞因子的水平均很高。术语“细胞因子风暴”可以与具有所有相同性质和含义的术语“细胞因子级联”和“高细胞血症”互换使用。在一些实施例中，细胞因子风暴的特征在于il-2释放和淋巴增殖。细胞因子风暴导致潜在的危及生命的并发症，包含心脏功能障碍、成人呼吸窘迫综合征、神经系统毒性、肾脏和/或肝功能衰竭以及弥散性血管内凝血。升高的ifn-γ水平既可以作为crs的预测生物标志物，又可以是其严重程度的指标。
[0177]
如上所述，car-t细胞疗法目前受到危及生命的神经毒性和crs的风险的限制。尽管进行了积极的管理，但是所有car-t响应者都经历了某种程度的crs。高达50％的用anti-cd19 car-t治疗的患者具有至少3级crs或神经毒性。
[0178]
另一方面，本技术提供一种用于治疗和/或预防受试者的免疫疗法相关毒性的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用car-t细胞，所述car-t细胞通过本技术所述的核酸分子修饰使所述ifn-γ基因表达降低(如基因沉默)。
[0179]
在一些实施方式中，已经将反义寡核苷酸或sirna转染入t细胞(如car-t细胞)，该方法包括将转染的t细胞给予受试者。可以通过电穿孔方法将反义寡核苷酸转染或sirna引入t细胞。
[0180]
在某些实施方式中，其中所述免疫疗法相关毒性是选自细胞因子释放综合征、神经毒性、神经炎症或其组合。
[0181]
在某些实施方式中，其中所述ifn-γ包括人ifn-γ(hifn-γ)。
[0182]
在某些实施方式中，其中所述经本技术所述的核酸分子修饰的car-t细胞表达的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的水平低于或等于由野生型car-t细胞表达的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的水平。
[0183]
在某些实施方式中，其中所述car-t细胞是cd19 car-t细胞。
[0184]
在某些实施方式中，其中所述受试者患有急性淋巴细胞白血病(ball)、慢性b淋巴细胞白血病(bcll)，b细胞霍奇金氏淋巴瘤(bhl)和非霍奇金氏淋巴瘤(bnhl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)或原发性纵膈大b细胞淋巴瘤。
[0185]
在某些实施方式中，其还包括施用ifn-γ拮抗剂。
[0186]
在一些实施例中，ifn-γ沉默的或基因敲除的car-t细胞的施用与重组ifn-γ拮抗剂一起进行，这进一步改善扩增、持久性、耐受衰老和耐受无反应性。在某些实施方式中，其中所述ifn-γ拮抗剂是抗ifn-γ抗体。
[0187]
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术的核酸分子、细胞和用途等，而不用于限制本技术发明的范围。
[0188]
实施例
[0189]
实施例1 cd19 fmc63 car mrna的体外转录(ivt)
[0190]
1.用spe1酶消化pda-fmc63 car质粒，使其线性化；
[0191]
2.用pcr cleanup试剂盒(qiagen)纯化线性化的载体，用无rnase的水洗脱；
[0192]
3.用纳米滴管测量dna的浓度，并通过运行琼脂糖dna凝胶来检查；
[0193]
4.按照制造商的协议(thermofisher,cat no:amb13455)进行ivt；具体地，将1ug模板dna、ntp/arca缓冲液、t7缓冲液、gtp、t7酶和无rnase h2o以20ul的体积加入到0.2ml pcr管中，并在37℃下孵育4小时；
[0194]
5. 4小时后，在每个反应中加入2ul的dnase i，并在37℃下孵育15分钟；
[0195]
6.然后根据制造商的建议进行尾随程序；
[0196]
7.使用rnasy试剂盒(qiagen)纯化ivt mrna；
[0197]
8.用纳米滴管测量rna的浓度，并通过运行page凝胶检查。
[0198]
实施例2将mrna与sirna电穿孔至a549-gfp或t细胞
[0199]
1.收集a549-gfp肿瘤细胞和t细胞，用opti-mem培养基清洗3次；
[0200]
2.用opti-mem培养基重悬细胞颗粒，调整细胞浓度为1
×
10e7/ml；
[0201]
3.将5ug cd19 mrna,10ug anti-cd19 fmc63 car mrna,不加或加不同量的ifn-γsirna(1.5um,4.5um,7.5um)或对照sirna(4.5um,7.5um)等量到1.5ml ep管中，然后加入100ul t细胞或a549细胞，混合均匀；
[0202]
4.在btx ecm 830机器上设置参数：a)对于t细胞：500电压，0.7毫秒；b)对于a549肿瘤细胞：300电压，0.5毫秒；
[0203]
5.在btx电穿孔杯中加入100ul与rna混合的细胞，轻拍以避免产生气泡；
[0204]
6.进行电穿孔，然后将细胞转移到预热的培养基中，在37℃下培养，得到anti-cd19 car-t细胞或过表达cd19的549-gfp细胞。
[0205]
实施例3 car-t细胞中ifn-γ细胞因子的细胞内染色
[0206]
1.染色前，用50ng/ml pma、1ug/ml ionomycin和golgistop(bd biosciences，1500倍稀释)处理实施例2获得的car-t细胞(采用sirna-1电穿孔)6小时；
[0207]
2. 6小时后，将car-t细胞转移到96孔板，在4℃，1500rpm下旋转3分钟；
[0208]
3.将细胞颗粒重悬于100ul/孔的1
×
固定/透化缓冲液中，4℃30分钟(固定/透化缓冲液是由固定/透化浓缩液(thermofisher，cat.no.00-5123-43)和固定/透化稀释液(thermofisher，cat.no.00-5223-56)按1:3比例混合而成)；
[0209]
4.在每个固定/透化细胞孔中加入100ul的1x透化缓冲液(thermofisher，cat.no.00-8333-56)，在4℃，1800rpm下旋转3分钟；
[0210]
5.用200ul 1x通透性缓冲液再洗一次细胞，在4℃，1800rpm条件下旋转5分钟；
[0211]
6.在1x通透性缓冲液中稀释抗ifn-γ流动抗体，car-t细胞在4℃下染色30分钟；
[0212]
7.加入150ul/孔的1x通透缓冲液，在4℃，1800rpm下旋转5分钟；
[0213]
8.用200ul 1x通透性缓冲液再洗一次细胞；
[0214]
9.将细胞重悬于200ul facs中，进行流式分析。
[0215]
结果如图1所示，在采用本技术不同的ifn-γsirna电穿孔的t细胞中均能够下调ifn-γ的表达，其中ifn-γsirna-1的敲除效率是最好的。
[0216]
用抗cd19 fmc63 car mrna和不同数量的ifn-γsirna-1(1.5um,4.5um,7.5um)或对照sirna(nc)电穿孔的t细胞在不同时间段内的ifn-γ细胞因子的细胞内染色。数据通过流式细胞仪进行分析。
[0217]
结果如图3所示，ifn-γsirna-1的抑制作用至少可以持续3天。
[0218]
实施例4 car-t细胞的ifn-γ细胞因子释放的elisa测试
[0219]
1.在收集上清液之前，用50ng/ml pma和1ug/ml ionomycin在96孔板中处理car-t细胞6小时；
[0220]
2. 6小时后，在4℃，1500rpm下旋压3分钟；
[0221]
3.然后将上清液转移到新的96孔板中；
[0222]
4.根据制造商的建议，用elisa检测ifn-γ细胞因子水平(biolegend，cat:432004)。
[0223]
结果如图2所示，在采用本技术不同的ifn-γsirna电穿孔的t细胞中，其中ifn-γsirna-1的敲除效率是最好的。
[0224]
实施例5 car-t细胞中抗cd19 car的facs染色
[0225]
1.分别在t细胞电转后的第1天、第二天和第3天收集t细胞。
[0226]
2.用facs buffer稀释cd19-fc重组蛋白，终浓度为2.5μg/ml。将car-t细胞在4℃下染色30分钟。
[0227]
3. 30分钟后，用facs buffer洗涤car-t细胞3次。
[0228]
4.用facs buffer稀释pe anti-human igg fc二抗，稀释比例为1:200。将car-t细胞在4℃下染色30分钟。
[0229]
5.30分钟后，用facs buffer洗涤细胞2次，然后将细胞重悬于200ul facs中，进行流式分析。
[0230]
结果如图4所示，电穿孔的sirna-1对car分子的表达没有影响。
[0231]
实施例6抗cd19 car-t细胞的体外细胞毒性试验
[0232]
1.在共培养前12小时，将用5ug cd19 mrna电穿孔的a549-egfp细胞播种到平底96孔板上，3000个细胞/100ul/孔；
[0233]
2.稀释car-t细胞至适当的浓度，将100ul/孔的细胞播种到不同e/t比例的肿瘤细胞中，如3:1和1:1；
[0234]
3.将共培养板放入incucyte s3机器，并设置扫描参数；
[0235]
4.扫描4天后，分析绿色物体综合强度(total green object integrated intensity,tgoii,gcu xμm2/well)，计算杀伤效率。
[0236]
结果图5-6所示，采用不同含量sirna-1电穿孔的抗cd19 car-t细胞均能够对肿瘤细胞产生杀伤作用，并且与单纯的抗cd19 car-t细胞相比，其杀伤效应没有影响。