一种具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱、制备方法与应用

1.本发明属于中药利用技术领域，进一步属于中药活性成分分离提取技术领域，具体涉及一种具有镇痛作用的来源于乌头属植物雪上一枝蒿，具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱、制备方法与应用。


背景技术：

2.1986年国际疼痛研究学会定义疼痛为：与组织损伤或潜在的组织损伤相关的一种不愉快的感觉和情感经历。值得注意的是，大多数疾病都会引起疼痛，而急性疼痛随病程的延长有可能转变为慢性疼痛，因此病理性疼痛多为慢性疼痛。
3.慢性疼痛是一个已达到流行病程度的全球性问题。据国际疼痛研究学会统计全球每5个成年人中就有1人受疼痛困扰，每年还有10%的人被诊断为慢性疼痛，其中有17%的患者因不堪忍受而自杀。引起慢性疼痛的原因多样，且引发机制仍有待深入了解。临床常用的镇痛药物多有副作用，如阿片类成瘾性强，且易产生耐受，导致药物滥用；非甾体类具有多脏器损害、消化道溃疡、过敏等副作用。目前对于疼痛的产生机制研究发现疼痛的产生主要与神经系统中枢可塑性变化和外周初级感觉神经元的异位传入电活动有关。同时，与外周初级感觉神经元有密切联系的胶质细胞、血管内皮细胞、免疫细胞及细胞分泌的各类因子都会参与慢性疼痛的发生过程。来自损伤性外周致敏感受器和神经病变轴突的传入电活动（称为异位传入电活动）会导致以痛觉过敏和痛性感觉异常为特征的慢性疼痛，两者机制接近。
4.乌头属植物为传统中医包括民族民间习用的镇痛药，常用于癌痛、神经痛、关节炎性疼痛。但乌头属植物毒性较强，不当使用常引发心脏骤停、休克等严重副反应。乌头属植物主要的活性成分为二萜生物碱，随着研究深入，已经发现二萜生物碱的镇痛活性与毒性并非完全不能分割，例如isotalatizidine作为一种醇胺型二萜生物碱最近被报道有较好的镇痛活性，而醇胺型生物碱的毒性是比较小的。因此乌头属植物来源的二萜生物碱中，醇胺型生物碱应引起更多的关注，可用于开发具有良好镇痛作用且毒性较小的新型镇痛药物。
5.雪上一枝蒿为云南特色乌头属药用植物，在少数民族民间广泛应用于跌打损伤和风湿骨痛，在云南东川等地已有十多年的种植历史。经研究发现，雪上一枝蒿中除雪上一枝蒿甲素外，还有含量较高的其他二萜生物碱成分。其中尼奥灵（neoline）在多种疼痛模型中表现出的镇痛活性较好，且毒性远远低于目前上市的草乌甲素（文献报道草乌甲素小鼠灌胃给药的ld
50
为4.06mg/kg）。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱；进一步的目的在于提供一种具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱的制备方法；更进一步的目的在于提供具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱之尼奥灵（neoline）的应用。
7.本发明的第一目的是这样实现的，所述具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱，所述醇胺型二萜生物碱来源于毛莨科乌头属植物雪上一枝蒿的尼奥灵（neoline），其分子量为 437 ；结构式为：所述尼奥灵（neoline）作为生物碱药物之毒性远远低于已上市乌头生物碱类药物草乌甲素。小鼠肌肉注射给药急性毒性的半数致死量ld
50
=300.8600mg/kg，95%置信区间为257.5100-351.9000mg/kg；所述尼奥灵（neoline）具有镇痛作用，对醋酸及热板所致小鼠疼痛均有明显的镇痛作用，在大鼠福尔马林致痛模型急性疼痛期、慢性疼痛期均具有镇痛作用。
8.本发明进一步的目的是这样实现的，所述的具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱的提取方法，所述醇胺型二萜生物碱通过下列工艺步骤获得：（1）原料处理：以短柄乌头干燥块根为原料，粉碎后加入原料3-5质量倍的甲醇室温浸泡4-6次，每次24-48h，将提取液合并减压浓缩后得到浸膏；（2）提取：将总浸膏分散到其3质量倍的水中，用氯仿进行萃取7-8次后，所得萃取液减压回收溶剂，得到总生物碱浸膏；（3）分离：总生物碱浸膏经氧化铝柱层析分离，以石油醚：丙酮（20:1-1:1）为洗脱剂梯度洗脱，每500毫升收集流份，通过薄层层析检识（条件：环己烷-乙酸乙酯-甲醇7:5:0.7，氨蒸汽饱和15分钟，碘化铋钾显色），合并为fr.a-g。其中fr.g（比移值0.2-0.3之间的斑点）进一步经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇系统（90:1-60:1）为洗脱剂，每250毫升收集流份，通过薄层层析（条件：环己烷-乙酸乙酯-甲醇7:5:0.7，氨蒸汽饱和15分钟，碘化铋钾显色）检识，分为fr.g1-8。
9.（4）纯化：流份fr.g5（比移值在0.3附近的一个主要斑点）经硅胶柱层析进一步纯化，以氯仿-甲醇系统（90:1-60:1）为洗脱剂，得到化合物尼奥灵（neoline）。
10.本发明更进一步的目的是这样实现的，所述醇胺型二萜生物碱之尼奥灵（neoline）在制备治疗外周和中枢性疼痛、炎性疼痛药物中的应用；所述醇胺型二萜生物碱之尼奥灵（neoline）作为化学镇痛药物中的应用。
11.本发明从毛莨科乌头属植物雪上一枝蒿中获取了一种醇胺型二萜生物碱之尼奥灵（neoline），研究证明尼奥灵（neoline）毒性远小于已上市的乌头类生物碱草乌甲素，对于外周及中枢疼痛和急、慢性疼痛均有明显的镇痛药效，可用于外周及中枢疼痛、急慢性炎性疼痛，其毒性显著低于已上市乌头生物碱类药物，可作为一种新型生物碱类药物，具有巨大的临床应用价值，潜在的社会效益、经济效益显著。
附图说明
12.图1为尼奥灵在小鼠醋酸致痛模型中的镇痛效果，尼奥灵低、中、高剂量组剂量分别为3.0086mg/kg、5.0143mg/kg、10.0287mg/kg。其中图1a为腹腔注射0.6%冰醋酸后20min内小鼠的扭体次数，图1b为各组小鼠的镇痛抑制百分率，计算公式为：（给药组小鼠扭体次数－空白对照组小鼠扭体次数）/空白对照组小鼠扭体次数
×
100%。
13.图2为尼奥灵在小鼠热板致痛模型中的镇痛效果，尼奥灵低、中、高剂量组剂量分别为3.0086mg/kg、5.0143mg/kg、10.0287mg/kg。其中图2a为各组小鼠给药后15min的痛阈值，图2b为各组小鼠给药后15、30、60、90、120、150min的痛阈值提高百分率，计算公式为：（给药后痛阈值－基础痛阈值）/基础痛阈值
×
100%。
14.图3为尼奥灵在大鼠福尔马林致痛模型中腹腔注射后的镇痛效果，注射剂量为5mg/kg。其中图3a为注射福尔马林液后0-90min的镇痛效果，图3b为注射福尔马林后0-10min急性疼痛期的镇痛效果曲线下面积，图3c为注射福尔马林后10-90min慢性疼痛期的镇痛效果曲线下面积。根据曲线下面积计算得出尼奥灵的急、慢性镇痛率，计算公式为：（空白对照组曲线下面积－给药组曲线下面积）/空白对照组曲线下面积
×
100%。
具体实施方式
15.下面结合与实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明的技术教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
16.本发明所述具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱，所述醇胺型二萜生物碱来源于毛莨科乌头属植物雪上一枝蒿的尼奥灵（neoline），其特性通过下列获得或实现。
17.实施例1，所述醇胺型二萜生物碱之尼奥灵的ld
50
按如下方式获得：（1）动物分组：取昆明种小鼠72只，雌雄各半，分为6组，空白对照组、尼奥灵（neoline）89.2531mg/kg、137.3125mg/kg、211.2500mg/kg、325.0000mg/kg、500.0000mg/kg组，每组12只；（2）实验方法：不同浓度剂量组等体积分别肌肉注射给药1次，空白对照组给予空白溶剂体系。观察给药后各组动物的急性毒性反应和死亡情况，连续14天。对观察期死亡的动物和观察期结束后处死的动物进行解剖，肉眼检查各组织脏器的体积、颜色、质地等有无异常。根据各组动物死亡率，用bliss法计算尼奥灵ld
50
；（3）ld
50
计算：尼奥灵（neoline）的主要中毒表现为自发活动减少、呼吸急促、俯卧、叫声异常、呃逆、痉挛、抽搐。解剖未见明显的内脏异常现象，应主要为神经或心脏毒性；尼奥灵（neoline）给药后小鼠的死亡时间在5min-4h内，部分延迟至24h。计算得到尼奥灵ld
50
为300.8600mg/kg，95%置信区间为257.5100-351.9000mg/kg。
18.实施例2，所述醇胺型二萜生物碱之尼奥灵（neoline）对醋酸所致小鼠疼痛的镇痛作用，具体通过下述工艺验证：（1）动物分组：昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，空白对照组、阿司匹林组、尼奥灵（neoline）低、中、高剂量组，每组12只；（2）实验方法：各组小鼠均以0.1ml/10g体积给药，空白对照组肌肉注射空白溶剂体系；阿司匹林组小鼠按600mg/kg体重腹腔注射阿司匹林；尼奥灵低、中、高剂量组分别按3.0086mg/kg、5.0143mg/kg、10.0287mg/kg肌肉注射给药。各组小鼠给药后30min，经腹腔注
射0.6%冰醋酸0.2ml/只，记录20min内小鼠的扭体次数，计算各组的镇痛抑制百分率；（3）作用效果：空白对照组小鼠在腹腔注射冰醋酸后表现出明显的疼痛反应；与空白对照组比较，阿司匹林组和尼奥灵（neoline）低、中、高剂量组小鼠的扭体次数均有一定程度的降低，且尼奥灵（neoline）低、中、高剂量组的镇痛抑制百分率分别为18.82%、46.12%、50.59%，其中尼奥灵中、高剂量组对冰醋酸所致的小鼠疼痛均具有抑制作用，差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。
19.实施例3，所述醇胺型二萜生物碱之尼奥灵（neoline）对热板所致小鼠疼痛的镇痛作用，具体通过下述工艺验证：（1）动物筛选：取昆明种雌性小鼠，18-22g，放入(55
±
0.5)℃的热板中，以热刺激小鼠足部产生疼痛反应（舔后足），测定小鼠痛阈（出现疼痛反应即舔后足时间），凡在5s内添后足者及30s内不舔后足或逃避者弃置不用，从中筛选出合格的雌性小鼠60只。
20.（2）动物分组：合格雌性小鼠60只，随机分为5组，空白对照组、吗啡组、尼奥灵（neoline）低、中、高剂量组，每组12只；（3）实验方法：各组小鼠给药前测两次痛阈值，取其平均值作为给药前痛阈值。以0.1ml/10g体积肌肉注射给药，空白对照组给予空白溶剂体系，吗啡对照组按10mg/kg体重给予吗啡，尼奥灵低、中、高剂量组分别按3.0086mg/kg、5.0143mg/kg、10.0287mg/kg肌肉注射给药。给药后15、30、60、90、120、150min各测定1次痛阈值。若放入测痛仪内60s仍无反应，便将小鼠取出，痛阈值以60s计，计算各组痛阈值提高百分率；（4）作用效果：与空白对照组比较，吗啡组和尼奥灵（neoline）低、中、高剂量组小鼠在给药15min后痛阈值均有一定程度的升高，且尼奥灵（neoline）低、中、高剂量组的痛阈值提高百分率分别为13.23%、32.11%、47.70%，其中尼奥灵中、高剂量组均能显著延长热板所致小鼠疼痛的痛阈值(p＜0.05或p＜0.01)，在给药60min后，各剂量组小鼠的痛阈值均随时间的延长呈降低趋势。
21.实施例4，所述醇胺型二萜生物碱之尼奥灵（neoline）对大鼠福尔马林致痛模型的镇痛作用，具体通过下述工艺验证：（1）动物分组：wistar雄性大鼠18只，随机分为3组，空白对照组、草乌甲素组（baa）、尼奥灵（neoline）组，每组6只；（2）模型构建：以腹腔注射的方式给药，baa组剂量为59μg/kg，尼奥灵组剂量为5mg/kg，空白对照组给予空白溶剂体系，给药后在大鼠右侧足部皮下注射5%的福尔马林溶液50μl；注射后立刻将大鼠放入有机玻璃盒内，记录大鼠在注射福尔马林后0、10、20、30、40、50、60、70、80和90min时的疼痛行为次数；将注射5%福尔马林后可产生二相疼痛，分为急性期（0~10minⅰ相）与慢性期（10~90minⅱ相），用于考察尼奥灵的初步镇痛作用；（3）作用效果：图3a为尼奥灵在大鼠福尔马林致痛模型中的镇痛效果。空白对照组大鼠在注射福尔马林溶液后表现出明显的急性疼痛反应（0~10min）和慢性疼痛反应（10~90min）；而baa组和尼奥灵组大鼠的疼痛行为次数有一定降低；图3b为0-10min急性疼痛期的镇痛效果曲线下面积，计算出尼奥灵（neoline）急性镇痛率为49.66%；图3c为10-90min慢性疼痛期的镇痛效果曲线下面积，计算出其尼奥灵（neoline）慢性镇痛率为76.16%。
22.实施例5，所述的具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱的提取方法，所述醇胺型二萜生物碱通过下列工艺步骤获得：
（1）原料处理：以短柄乌头干燥块根为原料，粉碎后加入原料3-5质量倍的甲醇室温浸泡4-6次，每次24-48h，将提取液合并减压浓缩后得到浸膏；（2）提取：将总浸膏分散到其3质量倍的水中，用氯仿进行萃取7-8次后，所得萃取液减压回收溶剂，得到总生物碱浸膏；（3）分离：总生物碱浸膏经氧化铝柱层析分离，以石油醚：丙酮为洗脱剂洗脱，收集流份，通过薄层层析检识，合并为fr.a-g。其中fr.g进一步经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇系统为洗脱剂，通过薄层层析检识，分为fr.g1-8。
23.（4）纯化：流份fr.g5经硅胶柱层析进一步纯化，以氯仿-甲醇系统为洗脱剂洗脱，得到化合物尼奥灵（neoline）。
24.其中，所述的具有镇痛作用的醇胺型二萜生物碱的提取方法，其特征在于：
①
总生物碱浸膏经氧化铝柱层析分离过程中的石油醚-丙酮系统为（20:1-1:1），收集流份体积为500毫升，薄层层析检识条件为环己烷-乙酸乙酯-甲醇（7:5:0.7），氨蒸汽饱和15分钟，碘化铋钾显色，其中fr.g包含比移值0.2-0.3之间的斑点。
25.②
fr.g经硅胶柱层析的氯仿-甲醇系统为（90:1-60:1），收集流份体积为250毫升，薄层层析检识条件为环己烷-乙酸乙酯-甲醇（7:5:0.7），氨蒸汽饱和15分钟，碘化铋钾显色，其中fr.g5为比移值在0.3附近的一个主要斑点。
26.③
fr.g5合并浓缩后经过硅胶柱层析进一步纯化，以体积比为90:1-60:1的氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到化合物尼奥灵（neoline）。
27.所述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.所述实施例中小鼠为昆明种小鼠（体重在18-22g范围内），为昆明医科大学实验动物学部的产品；大鼠为wistar雄性大鼠（体重在130-250g范围内），为成都达硕实验动物有限公司的产品。
29.所述实施例中的阿司匹林（北京索拉博科技有限公司）、吗啡（成都埃法生物科技有限公司）使用时按每1mg加入2.5μl浓盐酸和150μl的无水乙醇溶解，后用0.9%氯化钠注射液稀释并调节至ph4-5后使用。新开封的冰醋酸取适量，加0.9%氯化钠注射液配制成0.6%的冰醋酸溶液，现配现用。福尔马林（solarbio）用0.9%氯化钠注射液稀释至5%皮下注射使用。尼奥灵自雪上一枝蒿中分离获得后按每1mg加入2.5μl浓盐酸和150μl的无水乙醇溶解，后用0.9%氯化钠注射液稀释并调节至ph4-5后使用。
30.所述实施例通过记录冰醋酸注射后小鼠的疼痛行为次数（腹部收缩成“s”形、身体扭曲、后肢伸展及蠕行等）；采用智能热板仪检测受试小鼠对热板所致疼痛的痛阈值；采用足底机械测痛仪、足底热辐射测痛仪测量大鼠对伤害性机械刺激和伤害性热刺激的反应，作为衡量痛觉水平的主要指标。在进行行为学实验前，首先使受试大鼠适应测试环境和测试方法，每次适应30min。
31.热板所致痛阈值检测：使用rb-200智能热板仪（成都泰盟科技有限公司）测试受试实验小鼠对热刺激反应的潜伏期。将小鼠放入事先预热至(55
±
0.5)℃的热板中，以热刺激小鼠足部产生疼痛反应（舔后足），测定小鼠痛阈值（出现疼痛反应即舔后足时间），以60s为最大测量痛阈值，防止局部因热辐射受伤。
32.足底热辐射痛阈值检测：使用足底热辐射测痛仪（itclifescience公司）测试受试大鼠对伤害性热辐射刺激反应的潜伏期。实验中需保持周围环境安静，室温25℃。将大鼠置
于透明、透气的有机玻璃盒内，玻璃隔板下方放置热辐射测痛仪，辐射强度为45℃，光源照射患侧和正常侧足底部位，记录大鼠足部出现收缩时测痛仪显示的时间（s）。以30s为最大测量值，防止局部因热辐射受伤。每足需测定3次，每次测量间隔3min，3次测量的平均值即为大鼠该足的回避潜伏时间(pwl，pawwithdrawllatency)。
33.足底机械痛阈值检测：使用vonfrey电子测痛仪（itclifescience公司）测试受试大鼠对伤害性机械刺激反应的回避力度（g）。将大鼠放入透明、透气的有机玻璃盒内，底部为钢丝网。将测痛仪的纤维丝垂直触到大鼠足底部，记录大鼠足部出现收缩时测痛仪显示的力值。每足测量3次，每次测量间隔3min，3次结果的平均值即为大鼠的回避力度阈值（pwt,pawwithdrawthreshold)。
34.所述实施例中的实验结果均采用平均值
±
标准差的方式表示；行为学实验的统计方法采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，检验结果以p＜0.05为差异有统计学意义。