一种水稻粒型相关基因及其应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及一种水稻粒型相关基因及其应用。

背景技术：

1、水稻是世界上最重要的粮食作物之一，提高水稻产量对支持和应对全球人口的快速增长至关重要。调控种子大小是提高农作物产量的关键策略，也是一个基本的生物学问题。目前，研究报道关于参与调控水稻粒型或粒重的基因和qtl已有近60个基因。近年来，随着越来越多的粒型相关基因和qtl被定位与克隆，我们对粒型的调控机制也有了一定的了解。根据已有的文献报道，发现参与调控水稻粒型的基因主要涉及泛素-蛋白酶体途径、g蛋白信号、mapk信号途径、植物激素和转录调控因子途径等。

2、泛素-蛋白酶体途径需要一系列的特殊酶，主要由泛素活化酶(e1),泛素结合酶(e2)，泛素蛋白连接酶(e3)和26s蛋白酶体组成。泛素或泛素链能够被去泛素化酶所降解。最近的研究报道发现泛素-蛋白酶体途径在水稻籽粒的调控中起重要的作用。gw2编码一个环型的e3泛素连接酶，位于细胞质中，调控籽粒的宽度。gw2通过将其底物锚定到蛋白酶体进行降解，从而负调控细胞的分裂。该基因的功能缺失突变使得本应降解的底物不能被特异识别，从而激活颖壳的细胞分裂，使得颖壳细胞数目增加，导致其颖壳宽度增加。此外，其籽粒的灌浆速率和胚乳提高，最终粒宽、粒重以及产量都得到了提高。最新的研究发现gw2能够泛素化wg1并促进其降解，且wg1通过募集转录共抑制子asp1以抑制osbzip47的转录激活活性。遗传分析表明gw2，wg1和osbzip47是处于同一条通路调控水稻籽粒大小和重量。

3、wtg1编码一个与人类otub1同源的去泛素化酶，其属于otu家族成员。过表达wtg1/osotub1产生细长的籽粒，从而导致其粒重有所降低。wtg1/osotub1通过影响细胞扩张而控制籽粒的大小和粒型。wtg1/osotub1能够与osspl14相互作用，促进水稻osspl14/wfp的降解而调控株型。wtg1/osotub1会抑制osspl14的k63位多聚泛素化，而促进k48位多聚泛素化而调节osspl14的稳定性。因此，wtg1/osotub1可能是通过调节下游细胞扩张调节因子参与调控籽粒的大小。

4、异源三聚体g蛋白复合体由gα、gβ和gγ三个亚基组成，参与植物生长和发育的各个过程。在拟南芥中，gα亚基gpa1和gβ亚基agb1的功能缺失都会导致植物生长和发育缺陷，gγ亚基agg3的功能缺失突变体的籽粒变小，过表达agg3的籽粒变大，表明agg3能够调控籽粒的大小。d1/rga1属于水稻的g蛋白α亚基，其功能缺失突变体表现出植株矮秆且籽粒变小的表型，对br的敏感性降低，表明d1介导的异源三聚体g蛋白与br信号转导途径共同调控水稻粒型。gs3编码一个由232个氨基酸组成的跨膜蛋白，其属于g蛋白γ亚基，是拟南芥agg3的同源蛋白。gs3通过控制颖壳的细胞数目来负调控籽粒长度。该蛋白包含4个结构域：一个调控器官大小的结构域osr、一个跨膜结构域m、一个肿瘤坏死因子受体家族中富含半胱氨酸同源区域t和一个c型血管性血友病因子vwfc。其中osr结构域是gs3实现其功能的一个关键结构域，osr结构域缺失会产生长粒表型。qpe9编码一个类似磷脂酰乙醇胺结合蛋白的蛋白，调控水稻的穗型。其n端与控制水稻粒长的基因gs3有一定的同源性。其功能缺失的植株能促进顶端生长点的细胞分裂，使得穗枝梗数增加、稻穗变密、每穗籽粒数增多，从而促进水稻增产。最新研究报道过表达dep1能产生大粒，而下调dep1的表达造成小粒和直立穗，表明dep1/qpe9-1突变体是一个显性的功能缺失突变体。dep1不仅与穗部直立性状和穗粒数有关，突变类型的dep1/qpe9-1还能增加氮的吸收和利用率。最新的研究显示gs3与dep1和ggc2相反，通过竞争性结合rgb1调控籽粒大小。dep1和ggc2与rgb1互作正调控粒长，但gs3与dep1和ggc2竞争结合rgb1,因此抑制dep1和ggc2的作用。dep1和gs3还能与转录因子mads1互作促进下游基因的转录而抑制籽粒的大小。

5、丝裂原活化蛋白激酶(mapk)是一系列细胞内级联反应的成分，mapk级联主要由三个蛋白激酶组成：mkkk(mapk kinase kinase),mkk(mapk kinase)。近年来，研究发现mapk级联信号也参与调控水稻籽粒大小。smg1编码一个丝裂原活化蛋白激酶激酶osmkk4，osmkk4的功能缺失突变导致植株变矮，籽粒变小，穗形直立、密穗，说明smg/osmkk4作为mapk级联信号中的重要组成部分参与了水稻粒型调控。dsg1编码一个与拟南芥atmapk6同源的丝裂原活化蛋白激酶osmapk6，具有磷酸化活性，并且能与osmkk4互作，可能位于osmkk4的下游。该基因突变体表现为植株矮化，籽粒变小，千粒重降低，节间缩短，叶片直立。smg2编码一个丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激osmkkk10，该基因突变产生小粒，而过表达osmkkk10产生大粒。osmkkk10具有磷酸化活性，其能与osmkk4互作并磷酸化osmkk4。进一步地遗传分析表明osmkkk10,osmkk4和osmapk6通过mapk级联信号共同调控水稻籽粒大小。gsn1编码一个丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶osmkp1，gsn1功能缺失突变体的籽粒变大，且籽粒变少，过表达gns1基因的籽粒变少且变多。gsn1能直接与丝裂原活化蛋白激酶osmpk6互作，去磷酸化osmpk6使其失活。gsn1作为osmmmk10-osmkk4-osmpk6级联的一个负调控子，协同调控每穗粒数与籽粒大小的平衡。

6、在拟南芥和水稻中，br缺失突变体和br不敏感突变体都产生小粒，表明br促进籽粒的生长。slg编码一个类bahd酰基转移酶，抑制细胞伸长，其突变导致籽粒变长、内源br含量增加，参与介导br稳态的调控。控制器官体积的基因xiao，其编码一个与osbri1具有33％同源性的lrr激酶结构域蛋白，该基因的功能缺失突变体产生典型的br缺失表型，表现为植株矮小，叶片深绿，节间较短和小粒。在水稻中，br缺失突变体的小粒表型是由于降低颖壳的细胞大小导致，表明br是通过促进颖壳的细胞扩张来调控籽粒大小。gs5编码一个色氨酸羧肽酶，该基因的高表达促进细胞分裂，增加细胞数目，并且细胞周期相关基因的表达上调，是水稻籽粒大小的正调控因子。最新研究报道gs5对osbak1-7和osmsbp1之间的互作具有竞争抑制作用，且还增强了br的信号转导，表明gs5可能影响br信号。gl3.1/qgl3编码一个具有kelch重复结构域的蛋白磷酸酶(osppkl1)，通过去磷酸化细胞周期蛋白cyclin-t1；3抑制颖壳的细胞分裂，从而负调控籽粒的长度。gl3包含有两个kelch结构域，其第二个kelch结构域上保守的avldt区域的第364位天冬氨酸替换成谷氨酸的稀有等位变异会导致籽粒变长。水稻基因组中具有两个osppkl1的等位基因，osppkl2和osppkl3。转基因研究发现osppkl1和osppkl3是调控水稻粒长的负调控因子，而osppkl2是细胞伸长、分裂的正调控因子。最新的研究表明，qgl3是拟南芥bsu1基因的同源蛋白。在拟南芥中bsu1正调控br信号，而水稻中qgl3的过表达产生br功能缺失突变的表型。qgl3能够与水稻osgsk3激酶(拟南芥bin2基因的同源蛋白)互作，且去磷酸化osgsk3并稳定其状态，表明qgl3通过调控osgsk3的磷酸化和稳定性而抑制br信号。gs2编码一个定位在核内的转录激活因子osgrf4，过表达该基因能够促进细胞分裂和扩张，从而显著提高水稻的粒重和产量。gl2/gs2能与br信号转导通路中的负调控因子gsk2互作，其转录激活活性受gsk2抑制，其表达受osmir396调节。gs2还能与转录共激活因子osgif1/2/3互作，osgif1的过表达增加籽粒的大小和产量。gs9是一个转录激活子，gsk2能够调节gs9的转录活性。gs9与osofp8和osofp14形成一个转录复合体通过调控细胞分化控制籽粒的大小。osofp8能抑制gs9的转录活性，这种抑制作用能被gsk2减弱。gw5/qsw5编码一个核定位蛋白，其能与多聚泛素互作。gw5可能通过泛素蛋白酶体途径来调控水稻粒宽和粒重。gw5蛋白位于细胞质膜上，能与水稻gsk2(拟南芥bin2激酶的同源蛋白)互作，并抑制水稻gsk2激酶的活性，导致在下游bzr1和dlt转录因子的非磷酸化蛋白积累增加，从而调控油菜素内脂的下游基因表达，引起籽型的改变。tgw6编码iaa-葡萄糖水解酶，能将iaa-葡萄糖水解成游离的iaa和葡萄糖，通过调控iaa的平衡来影响胚乳早期发育。tgw6的突变体能增加水稻粒重产量，是水稻粒型的负调控因子。tgw6调控籽粒的方式主要通过控制iaa供应，影响合体到细胞化阶段的转变，从而限制细胞数目和籽粒长度。bg1是一个生长素响应基因，是生长素响应和转运的正调控因子。过表达bg1能够促进颖壳细胞分裂和扩张，从而提高水稻粒长、粒宽和粒重。目前，推测bg1可能是通过生长素信号转导途径调控籽粒大小，但还有待进一步证明。最新的研究报道了ossk41/osgs5与osarf4互作参与调控籽粒的大小。ossk41/osgs5编码一个粒重基因qtgw3/gl3.3，ossk41/osgsk5通过影响细胞扩张而负调控籽粒的大小。ossk41能磷酸化osarf4,ossk41和osarf4的突变体都产生大粒，并增加水稻的粒重。ossk41和osarf4调控一些生长素响应基因的表达，表明其可能是通过生长素信号途径调控籽粒的大小。

7、glw7编码一个在植物中特有的转录因子osspl13。glw7的高表达通过促进细胞伸长，进而增加籽粒的长度和产量，而其功能缺失突变体产生短粒。此外，glw7可以结合srs5和dep1的启动子，促进其表达。srs5的半显性突变体的籽粒较小，而过表达srs5能增加籽粒的长度。因此，osspl13也许是通过促进srs5的表达调控籽粒的大小。gw8编码一个包含sbp结构域的转录因子osspl16，调控水稻粒宽。研究表明gw8能够调节细胞周期，正向调控细胞分裂相关基因的表达，增加细胞增殖。该基因的高表达能促进细胞分裂和籽粒灌浆，从而增加水稻粒宽和产量。osspl16能直接与gw7的启动子结合而抑制gw7的表达，从而调控水稻籽粒大小。gw7编码一个tonneau招募蛋白质，与c端人类中心体蛋白质同源。过表达gw7基因能够产生细长的籽粒，其可能是由于促进了籽粒纵向细胞分裂而抑制横向细胞分裂所造成的结果。

8、尽管已经有许多调控种子粒型的基因被克隆，但它们的遗传调控通路网络还不太清楚，仍然需要进一步深入研究粒型相关基因，并解析其作用机制。因此，克隆水稻的粒型基因，对解析水稻粒型相关基因的遗传调控机制具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是如何提高植物的籽粒长度和籽粒重。

2、为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：

3、d1)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物籽粒长度和/或籽粒重中的应用；

4、d2)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物籽粒长度和/或籽粒重的产品中的应用；

5、d3)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育植物籽粒长度和/或籽粒重的产品中的应用；

6、d4)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；

7、所述蛋白质为如下a1)、a2)或a3)：

8、a1)氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；

9、a2)a1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物籽粒长度和/或籽粒重相关的蛋白质；

10、a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质。

11、其中，seq id no.1由839个氨基酸残基组成。

12、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

13、所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或sumo蛋白标签等。

14、进一步地，上述的应用中，所述蛋白质来源于水稻。

15、进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述b1)至b7)中的任一种：

16、b1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

17、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

18、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

19、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

20、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

21、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；

22、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官。

23、进一步地，上述的应用中，b1)所述核酸分子为如下g1)至g3)任一项所示的dna分子：

24、g1)编码链的编码序列是seq id no.2所示的dna分子；

25、g2)编码链的核苷酸序列是seq id no.2所示的dna分子；

26、g3)与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上述蛋白质的dna分子。

27、进一步地，上述的应用中，所述调控植物籽粒长度和/或籽粒重可为提高所述植物的籽粒长度和/或籽粒重。

28、进一步地，上述的应用中，所述植物可为下述任一种：

29、p1)单子叶植物，

30、p2)禾本目植物，

31、p3)禾本科植物，

32、p4)稻属植物，

33、p5)水稻。

34、上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

35、上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

36、上述相关生物材料中，b2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。

37、上述相关生物材料中，b3)所述重组载体可含有seq id no.2所示的用于编码上述蛋白质的dna分子。

38、可用植物表达载体构建含有上述编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1300、pcambia1300-35s、pcambia1302、pcambia2300、pcambia2301、pcambia1301、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用编码基因构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

39、为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

40、上述相关生物材料中，b4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。

41、上述相关生物材料中，b6)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

42、上述相关生物材料中，b7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

43、上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

44、上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

45、上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

46、所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

47、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活,包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

48、上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

49、为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供提高植物籽粒长度和/或籽粒重的方法，所述方法包括向受体植物中导入上述蛋白质的编码基因，得到籽粒长度和/或籽粒重高于所述受体植物的目的植物。

50、所述目的植物中，所述编码基因的表达量高于所述受体植物。

51、所述编码基因可通过携带有所述编码基因的植物表达载体导入受体植物中。如所述编码基因可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化受体植物的细胞或组织。

52、进一步地，上述的方法中，所述编码基因为下述g1)或g2)：

53、g1)编码链的编码序列是如seq id no.2所示的cdna分子或dna分子；

54、g2)编码链的核苷酸序列是如seq id no.2所示的cdna分子或dna分子。

55、进一步地，上述方法中，所述植物可为下述任一种：

56、p1)单子叶植物，

57、p2)禾本目植物，

58、p3)禾本科植物，

59、p4)稻属植物，

60、p5)水稻。

61、为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供上述的蛋白质或上述的生物材料。

62、本发明的实验证明，利用重组载体将ossik1基因导入野生型水稻中，得到转基因水稻，其与野生型水稻相比，ossik1基因过量表达，水稻的粒长粒长显著增加，粒重显著增加。因此通过提高ossik1基因的表达为培育高产新品种作物提供了新的思路。

63、本发明的水稻籽粒粒长和粒重ossik1基因影响水稻籽粒的形状、大小和重量，可以为培育优质、高产的水稻等禾本科作物及其他作物的研究提供理论基础，具有重要的经济意义和实用价值。