一种用于检测Fe

一种用于检测fe
3+
的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于荧光探针领域，特别涉及一种用于检测fe
3+
的荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.铁是一种常见的过渡金属，它在生物和病理过程中发挥着重要作用，生命系统中铁离子浓度异常会损害机体正常的生理功能。人体缺铁时，红细胞中血红蛋白的含量会减少，红细胞输送氧的能力也会下降，从而产生易疲劳、工作性能差和免疫力下降等不良影响，甚至患上缺铁性贫血；而铁过量则会对肝、肾等造成损害。因此灵敏、可靠的fe
3+
检测在环境监测和生物医学诊断中尤为重要。到目前为止，fe
3+
的检测方法有很多，如原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法和电化学方法等。然而，这些技术要么耗时，要么需要复杂和昂贵的设备。所以，开发高灵敏度、高选择性、快速定量检测fe
3+
的新方法具有重要的科学意义和应用价值。
3.吡啶类化合物具有六元杂环结构，广泛存在于天然产物中，基于n原子独特的配位性和氢键作用，吡啶在配位化学、药物化学和材料科学中具有广泛的应用。近年来，吡啶衍生物由于其与金属离子和质子的结合亲和力，被用作荧光传感器的受体。杯芳烃作为一种超分子大环结构，其上、下边缘具有功能化修饰和可调节的多样性，且空腔与金属离子之间存在阳离子
···
π超分子作用，也被广泛应用于金属离子的识别领域。本发明将吡啶嫁接到杯[4]芳烃的上沿，制备出一种用于检测fe
3+
的荧光探针，其结构和性能目前尚未见报道。


技术实现要素：

[0004]
本发明在于克服现有检测fe
3+
的分析方法上的不足，提供一种合成简单、选择性好、能快速检测fe
3+
的荧光探针，并提供荧光探针的制备方法。
[0005]
本发明荧光探针分子结构式如下所示：
[0006][0007]
本发明用于检测fe
3+
荧光探针的制备方法，其合成路线如下：
[0008][0009]
上述荧光探针的具体制备方法包括以下步骤:
[0010]
(1)将25,26,27,28-四羟基杯[4]芳烃溶于乙腈中，装入圆底烧瓶中，加入6当量质量分数60％氢化钠，室温下搅拌至无气泡，然后加入2当量的溴化苄，在室温下搅拌30min。反应结束后加入1n盐酸溶液淬灭反应，用二氯甲烷进行萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，旋转蒸除去有机溶剂，残留物进行柱层析分离，得到双苄基醚化产物；
[0011]
(2)将步骤(1)得到的双苄基醚化产物和nbs按摩尔比1:2加入丙酮中，室温条件下搅拌24h。反应结束后，旋转蒸发掉大部分溶剂，加入甲醇进行重结晶，即可得到双苄基醚化溴代产物；
[0012]
(3)将步骤(2)得到的双苄基醚化溴代产物溶于乙腈中，装入圆底烧瓶中，加入3当量质量分数60％氢化钠，室温下搅拌至无气泡，然后加入2当量的溴化苄，在室温下搅拌30min。反应结束后加入1n盐酸溶液淬灭反应，用二氯甲烷进行萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，旋转蒸发除去有机溶剂，甲醇重结晶，得到四苄基醚化溴代产物；
[0013]
(4)将步骤(3)得到四苄基醚化溴代产物与吡啶-3-硼酸按摩尔比1:2加入1,4-二氧六环和水的混合溶剂中，再加入碳酸钾和四(三苯基膦)钯，在无氧条件下100℃反应4个小时。反应结束后冷却至室温，过滤，滤液用二氯甲烷萃取，合并有机相，旋转蒸发除去有机溶剂，残留物经过柱层析纯化即可得到荧光探针产物l。
[0014]
步骤(4)所述的1,4-二氧六环和水的体积比例为3:1～10:1，最佳体积比例为4:1。
[0015]
步骤(4)所述的碳酸钾质量为醚化产物质量的50～70％，最佳用量为60％；四(三苯基膦)钯质量为醚化产物质量的10～25％，最佳用量为18％。
[0016]
上述制得的杯[4]吡啶荧光探针可采用荧光淬灭法检测fe
3+
，具体的检测方法为：
[0017]
用dmso配制浓度为1
×
10-3
mol/l的荧光探针分子母液，取2ml加入10ml容量瓶中，然后依次在各个容量瓶中加入0～3
×
10-5
mol/l fe
3+
水溶液后用乙醇定容到10ml，摇匀，室温下放置30min后，用荧光分光光度计，以295nm为激发波长，狭缝5/5nm，371nm为发射波长测试荧光强度，测试得到相对应的荧光强度。
[0018]
本发明的有益效果如下：
[0019]
本发明提供了一种可用于分析以及定量检测fe
3+
的荧光探针。该探针在对fe
3+
识别过程中，荧光发生显著的淬灭现象，有利于对fe
3+
进行定量检测，本发明采用的荧光淬灭检测方法具有灵敏度高、选择性好、检测方法简单、成本低等特点。
[0020]
(1)该荧光探针对fe
3+
有较好的选择性和抗干扰性，ba
2+
，al
3+
，ce
2+
，na
+
，mg
2+
，mn
2+
，
ag
+
，ca
2+
，cr
3+
，cu
2+
，cd
2+
，zr
4+
，k
+
，fe
2+
，li
+
，ni
2+
，nh
4+
，fe
3+
，zn
2+
，sr
2+
和co
2+
等离子对fe
3+
的检测影响不大；在ph为8环境下，溶液的荧光强度与fe
3+
的浓度在0～3.0
×
10-5
mol/l范围内呈线性关系，表现出较高的灵敏度，探针l与fe
3+
的结合常数和lod分别为3.26
×
107m-1
和7.9
×
10-7
m。
[0021]
(2)本发明的荧光探针制备过程较为简单，制备条件容易控制，通过简单的后处理就能够得到该吡啶探针。
附图说明
[0022]
图1为本发明实施例6中荧光探针分子对fe
3+
的选择性识别；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
[0023]
图2为本发明实施例7中荧光探针分子对不同金属离子的抗干扰性；横坐标为不同离子添加情况，纵坐标为荧光强度。
[0024]
图3为本发明实施例8中荧光探针分子荧光强度与ph变化关系；横坐标为ph值，纵坐标为荧光强度。
[0025]
图4为本发明实施例9中荧光探针分子荧光强度与时间变化关系；横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
[0026]
图5为本发明实施例10中荧光探针分子荧光强度与fe
3+
浓度的线性关系；横坐标为fe
3+
浓度，纵坐标为荧光强度。
[0027]
图6为本发明实施例11中荧光探针分子与fe
3+
的荧光滴定图，其中，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
[0028]
以下结合实施例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
[0029]
实施例1
[0030]
荧光探针的合成：
[0031]
(1)向500ml圆底烧瓶中加入3.49g 25,26,27,28-四羟基杯[4]芳烃和1.98g质量分数60％的氢化钠，然后加入100ml乙腈，室温下搅拌至没有气泡产生，再一次性加入1.96ml溴化苄，室温下搅拌30min。加入30ml 1n的盐酸水溶液淬灭反应，用二氯甲烷(80ml)萃取产物。将合并的有机层用饱和食盐水(100ml)进行洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥并浓缩。经柱层析纯化得到双苄基醚化产物2，收率为60.7％，纯度99.7％(lc)；
[0032]
(2)称取2.42g化合物2加入50ml丙酮中，再加入1.42g n-溴代琥珀酰亚胺，室温条件下反应24h，反应结束后，旋转蒸发掉大部分溶剂，加入甲醇进行重结晶，得到双苄基醚化溴代产物3，收率为90.2％，纯度为99.1％(lc)；
[0033]
(3)称取1.52g化合物3，0.24g质量分数60％氢化钠，加入20ml乙腈中，搅拌至无气泡产生后，加入0.5ml溴化苄，室温下搅拌1h。反应结束加入10ml 1n的盐酸水溶液淬灭反应，用二氯甲烷(40ml)进行萃取，合并有机相用饱和食盐水(50ml)进行洗涤，旋转蒸发掉大部分有机溶剂，加入甲醇进行重结晶，得到四苄基醚化溴代产物4，收率为87.0％，纯度99.9％(lc)；
[0034]
(4)称取452mg四苄基醚化溴代产物4和123mg吡啶-3-硼酸加入5ml1,4-二氧六环
和水的混合溶剂(v/v＝4/1)中，并加入271mg碳酸钾，81mg四(三苯基膦)钯，搅拌混合后升温至100℃，保持4h，反应结束后过滤，滤液用二氯甲烷萃取，合并有机相，旋转蒸发除去有机溶剂，残留物经经柱层析纯化即可得到杯[4]吡啶化合物，收率为37.7％，纯度99.8％(lc)。
[0035]1h nmr(300mhz,cdcl3):δ＝8.49(t,2h),8.40(d,j＝5.0hz 2h),7.56(d,j＝8.1hz,2h),7.25～7.14(m,22h),6.70(s,4h),6.47(t,j＝7.2hz,4h),6.30(t,j＝7.5hz,2h),4.97～4.83(m,8h),4.19(d,j＝14.0hz,4h),2.94(d,j＝9.7hz,4h).
13
c nmr(75mhz,cdcl3):δ＝155.99,155.52,147.95,147.41,137.70,137.49,136.71,136.47,136.03,135.54,135.10,134.28,131.49,129.79,129.74,128.55,128.28,128.24,128.18,128.08,127.25,126.81,76.72,76.64,31.61.hrms calcd for c
66h55
n2o4[m+h]
+
939.4162,found 939.4156.
[0036]
实施例2
[0037]
参照实施例1的方法，步骤(4)1,4-二氧六环和水体积比为3:1参与反应，目标产物的收率为28.7％，纯度98.8％(lc)；
[0038]
实施例3
[0039]
参照实施例1的方法，步骤(4)1,4-二氧六环和水体积比为10:1参与反应，目标产物的收率为26.1％，纯度98.8％(lc)；
[0040]
实施例4
[0041]
参照实施例1的方法，步骤(4)改为226mg碳酸钾参与反应，目标产物的收率为32.2％，纯度97.8％(lc)；
[0042]
实施例5
[0043]
参照实施例1的方法，步骤(4)改为45mg四(三苯基膦)钯参与反应，目标产物的收率为27.2％，纯度97.8％(lc)；
[0044]
实施例6
[0045]
实施例1获得的荧光探针对fe
3+
荧光检测的选择性。
[0046]
用dmso配制浓度为1
×
10-3
mol/l的荧光探针分子母液，取2ml加入10ml容量瓶中，用乙醇定容至10ml，配制成浓度为2
×
10-4
mol/l的荧光探针溶液，待用。金属离子(ba
2+
，al
3+
，ce
2+
，fe
3+
，na
+
，mg
2+
，mn
2+
，ag
+
，ca
2+
，cr
3+
，cu
2+
，cd
2+
，zr
4+
，k
+
，fe
2+
，li
+
，ni
2+
，nh
4+
，zn
2+
，sr
2+
，co
2+
)用水作为溶剂，移至10ml容量瓶中并定容，得到浓度为0.2mol/l的金属离子溶液。将30当量的各种离子溶液加入到2
×
10-4
mol/l的荧光探针溶液中，以波长为295nm的激发光检测探针子对不同阳离子的响应，其测定结果如图1所示。
[0047]
从图1的结果中可以发现，只有fe
3+
可使荧光探针的荧光发生淬灭，加入其它金属离子诸如:ba
2+
，al
3+
，ce
2+
，na
+
，mg
2+
，mn
2+
，ag
+
，ca
2+
，cr
3+
，cu
2+
，cd
2+
，zr
4+
，k
+
，fe
2+
，li
+
，ni
2+
，nh
4+
，zn
2+
，sr
2+
，co
2+
的时候，荧光探针的荧光有一定程度的降低，但并没有发生淬灭现象，而加入fe
3+
的荧光探针溶液明显荧光消失。该结果表明：该荧光探针对fe
3+
有较高的灵敏度。
[0048]
实施例7
[0049]
其他离子对实施例1所获得的荧光探针检测fe
3+
的干扰实验。
[0050]
离子抗干扰实验是对离子能够作为荧光探针的重要的性能指标，通过离子干扰实验可以研究探针对金属离子的选择性和灵敏度。
[0051]
取21个10ml容量瓶分别标记1-21(1号为浓度为2.0
×
10-4
mol/l主体分子溶液)。分别加入8ml的主体和2ml tris-hcl缓冲液，然后再分别加入配制好的金属离子(ba
2+
，al
3+
，ce
2+
，na
+
，mg
2+
，mn
2+
，ag
+
，ca
2+
，cr
3+
，cu
2+
，cd
2+
，zr
4+
，k
+
，fe
2+
，li
+
，ni
2+
，nh
4+
，zn
2+
，sr
2+
，co
2+
)溶液50ul，混合均匀10min后，在ex＝420nm，扫描电压630v的条件下，进行荧光光谱测试。测试结束后，再分别加入30ul fe
3+
溶液，混合10min后，再次在同等测试条件下进行荧光光谱测试。
[0052]
从图2可以看出，当有不同的金属离子共存时，对杯[4]吡啶探针识别fe
3+
的影响很小，说明该荧光探针对fe
3+
具有很好的选择性识别能力和较高的抗干扰能力。
[0053]
实施例8
[0054]
ph对实施例1获得的荧光探针检测fe
3+
的影响。
[0055]
使用微量进样器移取1m hcl溶液或1m naoh溶液加入探针溶液中，以此来调节探针溶液中的ph，控制其加入量小于待测总体积的3％，通过ph计来确定其ph值，加入过量的fe
3+
后，测定ph从2～13下的体系的荧光光谱。图3结果可以看出，当体系成酸性的时候，随着ph的升高，荧光强度也随着升高。ph为8时，荧光强度达到最大，从而可以判断在中性及弱碱性环境下，该探针均可很好地识别fe
3+
。
[0056]
实施例9
[0057]
反应时间对实施例1获得的荧光探针检测fe
3+
的影响。
[0058]
将fe
3+
加入到2
×
10-4
mol/l荧光探针乙醇溶液中，分别于0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15min后进行荧光测试。图4结果发现探针与fe
3+
的反应在1min内就能完成，识别体系达到平衡。
[0059]
实施例10
[0060]
实施例1中获得的荧光探针分子的荧光强度与fe
3+
浓度的线性关系。
[0061]
在ph＝8条件下，取不同低浓度的fe
3+
，用荧光光谱仪得到一条工作曲线，图5结果显示溶液的荧光强度与fe
3+
浓度在0～3.0
×
10-5
mol/l范围内呈线性关系(r2＝0.9912)，检测的lod为7.9
×
10-7
m。
[0062]
实施例11
[0063]
探针分子与fe
3+
的荧光滴定。
[0064]
为了进一步研究主客体之间的络合性质，如图6所示，在乙醇中进行荧光滴定实验，当激发波长为295nm时，探针分子自身具有较强的荧光，通过在探针分子的乙醇中加入不同浓度的fe
3+
，随着fe
3+
的浓度不断增加，371nm处的荧光发射强度逐渐下降。探针l与fe
3+
的结合常数为3.26
×
107m-1
。