一种用于鉴定金耳ZJJE001菌种的SSR分子标记及方法与流程

一种用于鉴定金耳zjje001菌种的ssr分子标记及方法
技术领域
1.本发明属于食用菌分子生物学领域，具体涉及一种用于鉴定金耳zjje001菌种的ssr分子标记及方法。


背景技术：

2.ssr(simple sequence repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna(microsatellite dna),是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。ssr 分子标记具有数量丰富、分布广泛、位点特异、多态性高、重复性好等优点，可对同一物种的不同品种品系之间的变异进行高精度识别。ssr标记技术已广泛用于遗传图谱的构建、指纹图谱的绘制、品种鉴定、谱系分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性等研究。
3.金耳(tremella aurantialba=naemate 1iaaurantialba)是珍稀的食（药）用菌之一，主要分布于我国云南、西藏等高海拔地区，野生资源非常稀有。近些年由于受消费者的青睐，野生金耳资源遭到过度采集。为了保护珍贵的金耳资源，20 世纪80 年代，研究学者开始探索金耳的人工栽培，但由于金耳自身生物学性状的特殊性和菌种制作的独特性导致了金耳菌种的不稳定，人工栽培金耳产量较低，产量也参差不齐。
4.现有关金耳菌种研究的报道都是涉及菌种扩繁方法、有效菌种制备等方面，针对金耳菌种鉴定的ssr分子标记开发，尚未见报道。因此，利用分子生物学技术开发精准有效的金耳菌种鉴定体系是极其重要的。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种用于鉴定金耳zjje001菌种的ssr分子标记，本发明的第二目的在于提供一种采用所述ssr分子标记鉴定金耳zjje001菌种的方法。
6.本发明中金耳zjje001菌种已于2020年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）；保藏编号为cgmcc no.20232。
7.本发明的第一目的是这样实现的，用于鉴定金耳zjje001菌种的ssr分子标记，其包括以下5对ssr分子标记组合：jessr003、jessr010、jessr075、jessr098及jessr100，相应带型编号组合为：2/(2+4)/3/(1+3)/(1+3)。
8.本发明的第二目的是这样实现的，一种采用所述ssr分子标记鉴定金耳zjje001菌种的方法，按以下步骤实现：s1、菌丝培养：将金耳菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，24-26℃培养13-17d后收集菌丝；s2、基因组dna的提取：提取所述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和质量；s3、ssr分子标记扩增：采用权利要求1的ssr分子标记对步骤2提取的dna进行ssr标记的pcr扩增；
s4、比对分析：将s3得到的扩增产物进行毛细管电泳检测以及聚类分析，对比荧光检测峰值图。
9.本发明的有益效果是：1、本发明提供的金耳zjje001菌种的ssr分子标记在供试的7个金耳栽培菌种(包括j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7、zjje001）中具有金耳zjje001菌种的专一性。用本发明提供的引物组合，可方便快速地将金耳zjje001和其他6个品种区分开，实现了节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势，可用于zjje001菌种的快速鉴定，具有良好的应用前景。
10.2、本发明提供的金耳zjje001菌种的精准鉴定方法，可以避免己选育出的金耳优良菌种在生产经营和市场流通过程中与其它同品种混杂，从而有效保护其知识产权，对金耳生产过程中品种的真实性鉴定有着重要意义。
附图说明
11.图1为引物jessr003分别在所选金耳zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图2为引物jessr010分别在所选金耳zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图3为引物jessr075分别在所选金耳zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图4为引物jessr098分别在所选金耳zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图5为引物jessr100分别在所选金耳zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；图6为基于ssr分子标记构建的7株金耳菌种遗传距离upgma聚类树。
具体实施方式
12.下面结合附图与实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
13.本发明用于鉴定金耳zjje001菌种的ssr分子标记，由以下5对ssr分子标记组合组成：jessr003、jessr010、jessr075、jessr098及jessr100；所述ssr分子标记的引物序列信息如表1所示。
14.表1 5对ssr标记引物信息本发明所述ssr分子标记鉴定金耳zjje001菌种的方法，按以下步骤实现：s1、将金耳菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，24-26℃培养13-17d后收
集菌丝；s2、提取所述菌丝的基因组dna，紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和质量；s3、采用权利要求1的ssr分子标记对步骤2提取的dna进行ssr标记的pcr扩增；s4、将s3得到的扩增产物进行毛细管电泳检测，分析ssr引物扩增出的等位片段的数量及分子量大小编号，毛细管电泳中通过分子量内标gs-500liz可确定各ssr引物扩增的等位位点的相对分子量，获得不同ssr等位片段的编号组合，符合ssr等位片段编号组合的菌种即为金耳zjje001菌种。
15.5对 ssr引物的等位片段数量及分子量大小信息如表2所示。
16.表2 ssr标记引物扩增的等位片段信息鉴定金耳zjje001菌种的ssr等位片段编号组合为2/(2+4)/3/(1+3)/(1+3)。
17.实施例1 采用本发明提供的ssr分子标记鉴定金耳zjje001菌种一、试验方法 1、dna提取将7个供试金耳菌种（zjje001、j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7）的菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，24-26℃培养13-17d后收集菌丝，提取菌丝的基因组dna：1）将spin colu2置于collection tube中，加入250 μl buffer bl，12000 rpm/
min离心1 min活化硅胶膜；2）取菌丝样本，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5 ml离心管中，加入400 μl buffer gp1，涡旋振荡1 min，65℃水浴10 ~ 30 min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；3）加入150 μl buffer gp2，涡旋振荡1 min，冰浴5 min；4）12000 rpm/min离心5 min，将上清转移至新的离心管中；5）加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入spin colu2中，12000 rpm/min离心30 s，弃废液；6）向spin colu2中加入500 μl buffer pw（使用前已加入无水乙醇） ，12000 rpm/min离心30 s，弃废液；7）向spin colu2中加入500 μl wasn006# buffer（使用前已加入无水乙醇），12000 rpm/min离心30 s，弃废液；8）重复步骤5；9）将spin colu2放回collection tube中，12,000 rpm/min离心2 min，开盖晾干1 min；10）取出spin colu2，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50 ~100 μl te buffer（65℃预热te buffer），20 ~ 25℃放置2 min，12,000 rpm/min 离心2 min；11）取2ul的dna原液用于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，取2ul的dna原液用于nanodrop分光光度计检测浓度和质量，剩余dna保存于-20℃。
18.2、pcr扩增采用5对ssr分子标记对提取的dna进行ssr标记的pcr扩增；pcr扩增体系为：总体积20ul，包括：擎科tse101-金牌mix(green) 16.45ul，10 μm tag dna酶 1.2ul，10umol/l ssr标记正向引物和反向引物各1.2ul，模板dna 1ul。
19.pcr 反应条件：98℃ 2 min; 98℃ 10 second，60℃ 10 second，72℃ 10 second，35个循环；72℃ 5 min。为保证鉴定的准确性，进行三次重复实验。
20.3、将扩增产物进行毛细管电泳检测：s1、将abi hidi formamide缓存液与genescan 500liz size standard内标试剂按130：1混合，配成mix；s2、用96孔反应板分装mix，每个孔中加入10ul mix；s3、对应着在96孔板中加入0.5ul样品模板，离心到4000 rpm即停；s4、用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃；s5、冷却后拿出，4000 rpm离心，解冻、混匀；s6、使用3730测序仪进行毛线管电泳，加样量为2ul样品和6ul溴酚蓝，电压为300v，时间12分钟。
21.二、结果分析：毛细管电泳的荧光检测峰值图对比分析将其他6个金耳菌种的电泳检测峰值图与zjje001的电泳检测峰值图进行对比（图1-5），金耳zjje001与其他6个菌种的每个荧光标记出现的峰均不重叠，清晰可辨。图1为引物jessr003扩增的结果，zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为175、173、183、183、183、183、183；图2为引物jessr010扩增的结果，zjje001和6种
金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为（173,184）、167、178、167、167、（167,178）、167；图3为引物jessr075扩增的结果，zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为180、159、161、159、161、161、161；图4为引物jessr098扩增的结果，zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为（129,135）、129、129、132、129、132、132；图5为引物jessr100扩增的结果，zjje001和6种金耳菌种j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7对应的片段大小依次为（137,143）、139、137、139、137、137、137。
22.从图1-5的结果说明本发明提供的5对ssr分子标记引物能够精准地将金耳zjje001菌种与其他6个供试金耳菌种区分。
23.对ssr引物扩增出的条带组合分析将5对ssr引物在7个供试金耳菌种中扩增出的等位片段根据分子量大小进行编码，并进行编号组合（如表2所示）。j-1、j-2、j-3、j-5、j-6、j-7对应的编号组合为1/1/1/1/2、3/3/2/1/1、3/1/1/2/2、3/1/2/1/1、3/(1+3)/2/2/1、3/1/2/2/1。而符合编号组合2/(2+4)/3/(1+3)/(1+3)的菌种即为金耳zjje001菌种。
24.聚类分析基于5对ssr扩增出的多态性片段对7个金耳菌种菌种进行遗传多样性分析，基于nei的遗传距离，构建了7个金耳菌种的upgma聚类树（图6）。
25.从图6可知，本发明提供的5对引物将金耳zjje001与其他6个供试金耳菌种区分在不同的聚类枝上，且金耳zjje001菌种为单独的一枝，完全与其他菌种区分开。
26.由此可见，本发明提供的ssr引物组合可以应用于金耳zjje001菌种的鉴定。