一种HHORSCs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法与流程

一种hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法
技术领域
1.本发明涉及毛发再生技术领域，尤其涉及一种hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法。


背景技术：

2.脱发问题备受关注，但目前治疗脱发的方法既昂贵又无效，从侵入性手术到化学治疗都不能产生预期的结果，很难从根本上解决脱发问题。目前治疗脱发的药物主要两种，分别是米诺地尔和非那雄胺，但是二者在治疗过程中有很大的局限性，患者必须不断服用，才能保持毛发生长，对药物的依赖性很强，还有一定的副作用。
3.脱发的常见治疗方法包括草本提取物、富血小板血浆、脂肪来源的干细胞和头发移植等，然而，这些方法都不能产生令人满意的结果。
4.因此，有必要提供一种hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法以解决上述技术问题。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供一种可以改善脱发，实现毛发再生的 hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法。
6.本发明提供的hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法包括以下步骤：
7.s1、从人的头皮样本中培养和分离出人真皮乳头细胞(hdpcs)和人毛囊外根鞘细胞(hhorscs)；
8.s2、使用流式细胞术和免疫细胞化学技术评估hdpcs(versican，α-sma) 和hhorscs(k15)的特定标记物；
9.s3、使用超速离心技术从hhorscs和人脐带血中分离血小板(pl)中进一步分离外泌体；
10.s4、使用蛋白质印迹法检测hhorscs和pl外泌体的特异性标志物；
11.s5、通过nanosight(纳米颗粒跟踪分析技术)分析外泌体的粒径和分布；
12.s6、使用增殖试验(mts试验)、迁移试验(transwell试验)等不同方法来评估不同浓度的hhorscs和pl外泌体(2，550，100μg/ml)对hdpcs 的诱导再生能力影响；还使用实时pcr评估了毛囊诱导性中特定基因的表达，包括alp、versican和α-sma。
13.为了达到方便对hdpcs的形态和细胞标记的效果，所述步骤s1中对 hdpcs的形态和细胞标记，(如图2)其中a：hdpcs呈典型的成纤维细胞形态，呈纺锤形；b：皮肤乳头菌落检测甲苯胺蓝染色强烈阳性(红色)；c： hdpcs第二次传代到常规培养基中碱性磷酸酶活性(红色)；d：免疫荧光成像数据为培养后的a-sma表达(绿色)；e：核分别用dapi(蓝色)和f伪彩色合并图像染色；g：免疫荧光成像数据为培养后波形蛋白表达(绿色)； h：核用dapi(蓝色)和i伪彩色合并图像染色。
14.为了达到方便得到检测结果显示hdpc为j-sma和k-versican阳性的效果，所述步骤s1中对hdpcs的形态和细胞标记，其中流量数据以点图和直方图的形式呈现，分别来自hdpc的特定标记(蓝色)和对照(红色)；点图流式细胞术检测结果显示hdpc为j-sma和k-versican阳性。
15.为了达到方便对hhorscs的形态和细胞标记的效果，所述步骤s2中对 hhorscs的形态和细胞标记，其中(如图3)a：hhorscs呈典型的多角形； b：免疫荧光成像数据显示培养后k15表达(绿色)；c：核dapi(蓝色) 染色；d伪彩色合并图像；e：flow数据以来自hhorscs的特定标记(蓝色) 与对照(红色)的点图表示；点图流式细胞术分析显示hhorscs阳性表达k15。
16.为了达到方便得到来自pl和hhorsc的外泌体的表征的效果，所述步骤s4中来自pl和hhorsc的外泌体的表征中，(如图4)a，d外泌体的 sem分析，比例尺为2lm；b、e纳米粒分析hhorsc-exo和pl-exo； hhorsc-exo和pl-exo的平均直径分别为167和147nm；c，f外泌体中cd63， cd81，cd9，tsg101和calnexin的免疫印迹。
17.为了达到方便对人真皮乳头细胞(hdpcs)来源的外泌体的验证的效果，所述步骤s6中包括对人真皮乳头细胞(hdpcs)来源的外泌体的验证，(如图5)，其中，a：hdpcs中外泌体摄取的验证；hhorsc-exo或pl-exo (20lg/ml)用pkh26(红色)染色，与hdpcs孵育24小时，标尺为200lm； pbs作为阴性对照(nc)，细胞核dapi(蓝色)反染色；b：通过imagej 软件对外泌体定量分析显示，hhorscs-exo被细胞摄取(47.73％
±
3.21)，而pl-exo被hdpcs摄取(59.93
±
％1.12)。
18.为了达到方便对细胞体外迁移能力进行测定的效果，所述步骤s6中包括对细胞体外迁移能力测定，(如图6)其中，a：在迁移试验中通过迁移细胞的显微镜图像(水晶紫染色，放大率9200倍)；b：hhorsc-exo剂量为100lg/ml 时，细胞迁移率明显高于其他实验组。
19.为了达到方便进行mts检测细胞增殖及活力的效果，所述步骤s6中还包括mts检测细胞增殖及活力，(如图7)其中，hhorsc外泌体a和pl 外泌体b的浓度分别为25、50、100mg/ml，hhorsc外泌体a和pl外泌体 b的浓度为100lg/ml时，与其他实验组相比，hdpcs的增殖和生存能力均显著提高，与对照组相比，pl外泌体降低了hdpcs的增殖和生存能力，外泌体内化定量分析显示hhorscs-exo被细胞摄取(47.73％
±
3.21)，而pl-exo 被hdpcs摄取(59.93
±
％1.12)。
20.为了达到方便得到hdpcs和hhorscs的特异性细胞质标志物的效果，所述hdpcs和hhorscs的特异性细胞质标志物的流式细胞术显示versican (77％)、α-sma(55.2％)和k15(73.2％)的表达，通过nanosight动态光nanosightdynamiclightscattering分析外泌体的粒径和分布结果，发现大部分hhorscs和pl外泌体为30-150nm，对于100μg/ml的hhorscs外泌体 (hhorscs-exo)，alp、versican和α-sma蛋白的表达与对照组相比分别增加了2.1、1.7和1.3倍。
21.为了达到方便得到hhorscs-exo培养的人真皮乳头细胞迁移、增殖和毛发诱导能力显著增加的效果，所述hhorscs-exo培养的人真皮乳头细胞迁移、增殖和毛发诱导能力显著增加；与pl-exo相比，浓度为100lg/ml的 hhorscs-exo促进hdpcs的增殖、迁移和alp、versican和a-sma的表达。
22.与相关技术相比较，本发明提供的hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再
生的方法具有如下有益效果：
23.1、本发明通过试验得出hdpcs和hhorscs的特异性细胞质标志物的流式细胞术显示versican(77％)、α-sma(55.2％)和k15(73.2％)的表达，通过nanosight动态光nanosightdynamiclightscattering分析外泌体的粒径和分布结果，发现大部分hhorscs和pl外泌体为30-150nm，对于100μg/ml 的hhorscs外泌体(hhorscs-exo)，alp、versican和α-sma蛋白的表达与对照组相比分别增加了2.1、1.7和1.3倍，因此人类脱发的主要原因是毛发真皮乳头细胞的再生能力丧失以及缺乏合适的生长因子，导致脱发人群的毛发数量不足，保持毛乳头细胞对毛发的潜在诱导性是毛囊体外形态形成的最重要因素，为了达到在细胞培养过程中保持人真皮乳头细胞(hdpcs)潜在的头发诱导能力的目的，从人毛囊外根鞘细胞(hhorscs)和血小板(pl)两个来源分离并鉴定了外泌体，并测试了不同浓度的外泌体，以支持维持hdpcs 潜在的头发诱导再生能力，确认毛发再生的明确效果，解决了脱发的常见治疗方法包括草本提取物、富血小板血浆、脂肪来源的干细胞和头发移植等，然而，这些方法都不能产生令人满意结果的问题；
24.2、本发明通过对hdpcs的形态和细胞进行标记，可得到细胞术检测结果显示hdpc为j-sma和k-versican阳性，再通过对hhorscs的形态和细胞进行标记，细胞术分析显示hhorscs阳性表达为k15，通过分析pl和hhorsc 的外泌体的表征中，可检测hhorscs和pl外泌体的特异性标志物，再通过对人真皮乳头细胞(hdpcs)来源的外泌体的验证、对细胞体外迁移能力测定，以及mts检测细胞增殖及活力等试验，与其他实验组相比，hdpcs的增殖和生存能力均显著提高，与对照组相比，pl外泌体降低了hdpcs的增殖和生存能力，外泌体内化定量分析显示hhorscs-exo被细胞摄取(47.73％
±
3.21)，而pl-exo被hdpcs摄取(59.93
±
％1.12)，使用增殖试验(mts试验)、迁移试验(transwell试验)等不同方法来评估不同浓度的hhorscs和pl外泌体(2，550，100μg/ml)对hdpcs的诱导再生能力影响，结果显示，hhorscs-exo 培养的人真皮乳头细胞迁移、增殖和毛发诱导能力显著增加；与pl-exo相比，浓度为100lg/ml的hhorscs-exo促进hdpcs的增殖、迁移和alp、versican 和a-sma的表达，因此，hhorscs-exo为脱发治疗提供了一种新的有效方法。
附图说明
25.图1为本发明提供的hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法的一种较佳实施例的方法流程图；
26.图2为本发明提供的hdpcs的形态和细胞标记示意图；
27.图3为本发明提供的hhorscs的形态和细胞标记示意图；
28.图4为本发明提供的pl和hhorsc的外泌体的表征示意图；
29.图5为本发明提供的人真皮乳头细胞(hdpcs)来源外泌体的验证示意图；
30.图6为本发明提供的细胞体外迁移能力测定示意图；
31.图7为本发明提供的mts检测细胞增殖及活力示意图；
32.图8为本发明提供的不同浓度hhorscs和pl外泌体处理后多能蛋白聚糖比较图。
具体实施方式
33.下面结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。
34.请结合参阅图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7和图8，其中，图1 为本发明提供的hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法的一种较佳实施例的方法流程图；图2为本发明提供的hdpcs的形态和细胞标记示意图；图3为本发明提供的hhorscs的形态和细胞标记示意图；图4为本发明提供的pl和hhorsc的外泌体的表征示意图；图5为本发明提供的人真皮乳头细胞(hdpcs)来源外泌体的验证示意图；图6为本发明提供的细胞体外迁移能力测定示意图；图7为本发明提供的mts检测细胞增殖及活力示意图；图8为本发明提供的不同浓度hhorscs和pl外泌体处理后多能蛋白聚糖比较图。hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法包括以下步骤：
35.s1、从人的头皮样本中培养和分离出人真皮乳头细胞(hdpcs)和人毛囊外根鞘细胞(hhorscs)；
36.s2、使用流式细胞术和免疫细胞化学技术评估hdpcs(versican，α-sma) 和hhorscs(k15)的特定标记物；
37.s3、使用超速离心技术从hhorscs和人脐带血中分离血小板(pl)中进一步分离外泌体；
38.s4、使用蛋白质印迹法检测hhorscs和pl外泌体的特异性标志物；
39.s5、通过nanosight(纳米颗粒跟踪分析技术)分析外泌体的粒径和分布；
40.s6、使用增殖试验(mts试验)、迁移试验(transwell试验)等不同方法来评估不同浓度的hhorscs和pl外泌体(2，550，100μg/ml)对hdpcs 的诱导再生能力影响；还使用实时pcr评估了毛囊诱导性中特定基因的表达，包括alp、versican和α-sma。
41.在具体实施过程中，如图1、图2、图3和图4所示，步骤s1中对hdpcs 的形态和细胞标记，其中a：hdpcs呈典型的成纤维细胞形态，呈纺锤形；b：皮肤乳头菌落检测甲苯胺蓝染色强烈阳性(红色)；c：hdpcs第二次传代到常规培养基中碱性磷酸酶活性(红色)；d：免疫荧光成像数据为培养后的 a-sma表达(绿色)；e：核分别用dapi(蓝色)和f伪彩色合并图像染色； g：免疫荧光成像数据为培养后波形蛋白表达(绿色)；h：核用dapi(蓝色) 和i伪彩色合并图像染色。
42.步骤s1中对hdpcs的形态和细胞标记，其中流量数据以点图和直方图的形式呈现，分别来自hdpc的特定标记(蓝色)和对照(红色)；点图流式细胞术检测结果显示hdpc为j-sma和k-versican阳性。
43.步骤s2中对hhorscs的形态和细胞标记，其中a：hhorscs呈典型的多角形；b：免疫荧光成像数据显示培养后k15表达(绿色)；c：核dapi (蓝色)染色；d伪彩色合并图像；e：flow数据以来自hhorscs的特定标记(蓝色)与对照(红色)的点图表示；点图流式细胞术分析显示hhorscs 阳性表达k15。
44.步骤s4中来自pl和hhorsc的外泌体的表征中，a，d外泌体的sem 分析，比例尺为2lm；b、e纳米粒分析hhorsc-exo和pl-exo；hhorsc-exo 和pl-exo的平均直径分别为167和147nm；c，f外泌体中cd63，cd81， cd9，tsg101和calnexin的免疫印迹。
45.参考图1、图5、图6和图7所示，步骤s6中包括对人真皮乳头细胞(hdpcs) 来源的外泌体的验证，其中，a：hdpcs中外泌体摄取的验证；hhorsc-exo 或pl-exo(20lg/ml)用pkh26(红色)染色，与hdpcs孵育24小时，标尺为200lm；pbs作为阴性对照(nc)，细胞核dapi(蓝色)反染色；b：通过imagej软件对外泌体定量分析显示，hhorscs-exo被细胞摄取(47.73％
±
3.21)，而pl-exo被hdpcs摄取(59.93
±
％1.12)。
46.步骤s6中包括对细胞体外迁移能力测定，其中，a：在迁移试验中通过迁移细胞的显微镜图像(水晶紫染色，放大率9200倍)；b：hhorsc-exo 剂量为100lg/ml时，细胞迁移率明显高于其他实验组。
47.步骤s6中还包括mts检测细胞增殖及活力，其中，hhorsc外泌体a 和pl外泌体b的浓度分别为25、50、100mg/ml，hhorsc外泌体a和pl 外泌体b的浓度为100lg/ml时，与其他实验组相比，hdpcs的增殖和生存能力均显著提高，与对照组相比，pl外泌体降低了hdpcs的增殖和生存能力，外泌体内化定量分析显示hhorscs-exo被细胞摄取(47.73％
±
3.21)，而 pl-exo被hdpcs摄取(59.93
±
％1.12)。
48.需要说明的是：通过对hdpcs的形态和细胞进行标记，可得到细胞术检测结果显示hdpc为j-sma和k-versican阳性，再通过对hhorscs的形态和细胞进行标记，细胞术分析显示hhorscs阳性表达为k15，通过分析pl和 hhorsc的外泌体的表征中，可检测hhorscs和pl外泌体的特异性标志物，再通过对人真皮乳头细胞(hdpcs)来源的外泌体的验证、对细胞体外迁移能力测定，以及mts检测细胞增殖及活力等试验，与其他实验组相比，hdpcs 的增殖和生存能力均显著提高，与对照组相比，pl外泌体降低了hdpcs的增殖和生存能力，外泌体内化定量分析显示hhorscs-exo被细胞摄取(47.73％
±
3.21)，而pl-exo被hdpcs摄取(59.93
±
％1.12)，使用增殖试验(mts 试验)、迁移试验(transwell试验)等不同方法来评估不同浓度的hhorscs 和pl外泌体(2，550，100μg/ml)对hdpcs的诱导再生能力影响，结果显示， hhorscs-exo培养的人真皮乳头细胞迁移、增殖和毛发诱导能力显著增加；与pl-exo相比，浓度为100lg/ml的hhorscs-exo促进hdpcs的增殖、迁移和alp、versican和a-sma的表达，因此，hhorscs-exo为脱发治疗提供了一种新的有效方法。
49.参考图1和图8所示hdpcs和hhorscs的特异性细胞质标志物的流式细胞术显示versican(77％)、α-sma(55.2％)和k15(73.2％)的表达，通过nanosight动态光nanosightdynamiclightscattering分析外泌体的粒径和分布结果，发现大部分hhorscs和pl外泌体为30-150nm，对于100μg/ml的 hhorscs外泌体(hhorscs-exo)，alp、versican和α-sma蛋白的表达与对照组相比分别增加了2.1、1.7和1.3倍。
50.hhorscs-exo培养的人真皮乳头细胞迁移、增殖和毛发诱导能力显著增加；与pl-exo相比，浓度为100lg/ml的hhorscs-exo促进hdpcs的增殖、迁移和alp、versican和a-sma的表达。
51.需要说明的是：图8中a-f比较不同浓度hhorscs和pl外泌体处理后多能蛋白聚糖(a，b)、alp(c，d)和a-sma(e，f)mrna相对表达量； 100、50、25lg/mlhhorscs-exo或pl-exo分别与hdpc孵育48h；将外泌体处理的hdpc进行qrt-pcr分析，各基因的表达与血清(10％)培养的细胞 (对照组)的表达进行标准化，结果显示，hhorscs-exo培养的人真皮乳头细胞迁移、增殖和毛发诱导能力显著增加；与pl-exo相比，浓度为100lg/ml 的hhorscs-exo促进hdpcs的增殖、迁移和alp、versican和a-sma的表达，因此，hhorscs-exo为脱发治疗提供了一种新的有效方法。
52.本发明提供的hhorscs外泌体促进真皮乳头细胞诱导毛发再生的方法的工作原理如下：
53.首先从人的头皮样本中培养和分离出人真皮乳头细胞(hdpcs)和人毛囊外根鞘细
胞(hhorscs)；再使用流式细胞术和免疫细胞化学技术评估hdpcs (versican，α-sma)和hhorscs(k15)的特定标记物；通过使用超速离心技术从hhorscs和人脐带血中分离血小板(pl)中进一步分离外泌体；使用蛋白质印迹法检测hhorscs和pl外泌体的特异性标志物；再通过 nanosight(纳米颗粒跟踪分析技术)分析外泌体的粒径和分布；最后使用增殖试验(mts试验)、迁移试验(transwell试验)等不同方法来评估不同浓度的hhorscs和pl外泌体(2，550，100μg/ml)对hdpcs的诱导再生能力影响；使用实时pcr评估了毛囊诱导性中特定基因的表达，包括alp、versican 和α-sma通过对hdpcs的形态和细胞进行标记，可得到细胞术检测结果显示 hdpc为j-sma和k-versican阳性，再通过对hhorscs的形态和细胞进行标记，细胞术分析显示hhorscs阳性表达为k15，通过分析pl和hhorsc 的外泌体的表征中，可检测hhorscs和pl外泌体的特异性标志物，再通过对人真皮乳头细胞(hdpcs)来源的外泌体的验证、对细胞体外迁移能力测定，以及mts检测细胞增殖及活力等试验，与其他实验组相比，hdpcs的增殖和生存能力均显著提高，与对照组相比，pl外泌体降低了hdpcs的增殖和生存能力，外泌体内化定量分析显示hhorscs-exo被细胞摄取(47.73％
±
3.21)，而pl-exo被hdpcs摄取(59.93
±
％1.12)，使用增殖试验(mts试验)、迁移试验(transwell试验)等不同方法来评估不同浓度的hhorscs和pl外泌体(2，550，100μg/ml)对hdpcs的诱导再生能力影响，结果显示，hhorscs-exo 培养的人真皮乳头细胞迁移、增殖和毛发诱导能力显著增加；与pl-exo相比，浓度为100lg/ml的hhorscs-exo促进hdpcs的增殖、迁移和alp、versican 和a-sma的表达，因此，hhorscs-exo为脱发治疗提供了一种新的有效方法。
54.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
55.以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。