一个玉米纹枯病抗病相关基因Zmbzip45及其应用

97:11655-11660；zhou等，2002，science in china 45:449-467)。与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。
7.碱性亮氨酸拉链(basic region/leucine zipper，bzip)转录因子家族是真核生物中最大且成员种类最多的转录因子家族之一。有研究表明，bzip转录因子参与植物多种生长发育过程，包括种子发芽与成熟，花的发育，植物衰老，生殖力和光信号等，且参与植物各种抗逆响应。但迄今对该家族的大部分成员的功能还所知甚少，特别是玉米bzip多基因家族成员的功能，更是很少见有报道。


技术实现要素：

8.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一个玉米纹枯病抗病相关基因zmbzip45及其应用。本发明研究发现，利用crispr-cas9基因编辑技术敲除zmbzip45基因可显著提高玉米对纹枯病菌的抗性。因此，zmbzip45基因是作为负调控基因在提高玉米对纹枯病菌的抗性中进行应用。以zmbzip45基因作为靶标基因进行基因改造后，可以赋予玉米对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
9.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.本发明的第一方面，提供zmbzip45基因作为负调控基因在如下(1)或(2)中的应用：
11.(1)提高作物对纹枯病菌的抗性中的应用；
12.(2)培育抗纹枯病的作物品种；
13.所述zmbzip45基因为以下a)-d)中任一项所述的核酸：
14.a)核酸，其由seq id no.1所示的核苷酸序列组成；
15.b)核酸，其由seq id no.2所示的核苷酸序列组成；
16.c)核酸，其由编码seq id no.3所示蛋白质的核苷酸序列组成；
17.d)与a)或b)的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性且表达相同功能蛋白质的核酸分子。
18.所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
19.作为优选的方案，zmbzip45基因的序列如seq id no.1所示，编码区序列如seq id no.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
20.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用计算机软件进行评价，例如可采用blast算法测定(altschul et al.1990.journal of molecular biology 215:403-410；karlin and altschul.1993.proceedings of the national academy of sciences 90:5873-5877)。
21.上述核酸分子中，所述90％或90％以上同一性可以为至少90％、91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性。
22.本发明的第二方面，提供zmbzip45基因编码的蛋白作为负调控因子在如下(1)或(2)中的应用：
23.(1)提高作物对纹枯病菌的抗性中的应用；
24.(2)培育抗纹枯病的作物品种；
25.所述zmbzip45基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
26.本发明的第三方面，提供如下(1)或(2)在提高作物对纹枯病菌抗性或培育抗纹枯病的作物品种中的应用：
27.(1)用于特异性敲除zmbzip45基因的grna序列、重组敲除载体或者转化体；
28.(2)用于特异性沉默zmbzip45基因的沉默片段、重组沉默载体或者转化体。
29.上述应用中，作为优选，用于特异性敲除zmbzip45基因的grna序列如seq id no.4和seq id no.5所示。
30.上述应用中，所述作物优选为玉米。
31.本发明的第四方面，提供一种提高玉米纹枯病抗性的方法，包括：
32.将玉米中的zmbzip45基因敲除或沉默的步骤；
33.或者，使玉米中zmbzip45基因编码蛋白的功能缺失的步骤。
34.上述方法中，可以采用vigs技术、t-dna插入、crispr-cas9基因编辑技术或rna干涉技术等将玉米中的zmbzip45基因敲除或沉默。
35.作为优选的方案，将玉米中的zmbzip45基因敲除的方法包括以下步骤：
36.s1、根据玉米纹枯病抗病相关基因zmbzip45编码序列合成grna；
37.s2、将s1步骤合成的grna构建到基因编辑载体crispr-cas9；
38.s3、利用农杆菌转基因方法将s2步骤构建的载体转化到玉米，得到纹枯病抗性提高的玉米。
39.本发明的第五方面，提供一种培育抗纹枯病的玉米品种的方法，包括以下步骤：
40.将玉米出发植株中的zmbzip45基因敲除或沉默，得到玉米转基因植株。
41.上述方法中，所述玉米转基因植株与玉米出发植株相比，具有如下1)-3)至少一项特点：
42.1)所述玉米转基因植株感染纹枯病后的病斑长度短于所述玉米出发植株；
43.2)所述玉米转基因植株感染纹枯病后pr4基因的表达量高于所述玉米出发植株；
44.3)所述玉米转基因植株感染纹枯病后pr10基因的表达量高于所述玉米出发植株。
45.本发明的有益效果：
46.本发明首次发现玉米zmbzip45基因被敲除之后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。因此，玉米zmbzip45基因可以作为纹枯病抗病相关基因，对于玉米纹枯病的防治具有重要的价值。
附图说明
47.图1：使用qrt-pcr检测zmbzip45基因的表达量结果示意图。图中，zmbzip45基因的表达量随着接种纹枯病菌ywk196的延长在易感玉米纹枯病自交系群体(sh)中大幅提高，而在抗纹枯病菌玉米自交系群体(rh)中zmbzip45的表达无显著差异。
48.图2：crispr-cas9敲除zmbzip45基因t1代阳性纯合突变体植株测序结果示意图。图中，cas9-1突变体植株在始密码子atg下游938碱基处缺失了atac碱基，cas9-2突变体植株在始密码子atg下游939碱基处插入了a碱基。
49.图3：crispr-cas9敲除zmbzip45基因t1代阳性纯合突变体植株接种纹枯病菌(ywk196)7天后结果示意图；图中，t1代zmbzip45敲除突变体植株(cas9-1和2)接种纹枯病
菌(ywk196)7天后形成的病斑明显比玉米品种b104(对照，wt)的短；
50.玉米自交系b104为受体材料。
51.图4：zmbzip45敲除突变体植株接种纹枯病菌后pr基因表达结果示意图；图中，zmbzip45敲除突变体植株接种纹枯病菌后pr4和pr10基因的表达量显著高于b104(对照，wt)。
52.图5：zmbzip45超量表达t1代遗传转化植株接种纹枯病菌(ywk196)7天后结果示意图；图中，超量表达t1代遗传转化植株(pcxun::zmbzip45-1、2和3)接种纹枯病菌(ywk196)7天后形成的病斑明显比水稻品种中花11(对照，wt)的长；
53.中花11为遗传转化受体材料。
具体实施方式
54.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
55.如前所述，bzip转录因子参与植物多种生长发育过程和各种抗逆响应。但迄今对玉米bzip家族大部分成员的功能还所知甚少。玉米共有10对染色体，约3.2万个基因，23亿个碱基，是目前已测序的植物中基因数量最多的品种。如何从庞大的玉米基因组中挖掘抗病相关基因，并探究这些基因在植物抗病和感病过程中的作用仍然是一个难题。
56.本专利发明人在玉米纹枯病抗病相关基因领域深耕多年，在长期的试验研究中发现：玉米bzip家族中的zmbzip45基因的表达量随着接种纹枯病菌ywk196时间的延长在易感玉米纹枯病自交系群体中大幅提高，而在抗纹枯病菌玉米自交系群体中zmbzip45的表达无显著差异。由此推测，zmbzip45基因可能是作为负调控基因在玉米对纹枯病菌抗性中发挥作用。
57.为了对zmbzip45基因的功能做进一步的验证，发明人利用crispr-cas9基因编辑技术对zmbzip45基因进行定点突变，分别设计了特异性靶向该基因起始密码子atg下游，第650-672位碱基和932-954位碱基的两个导向rna(grna-1和grna-2)，其中，grna-1的序列为：5
′‑
gacgtcgcgtttatatcgga-3
′
(seq id no.4)，grna-2的序列为：5
′‑
accatacttttggcgaaact-3
′
(seq id no.5)，构建两个靶位点的sgrna表达盒；将构建的sgrna表达盒连入pbue411载体并转化e.coli dh5α大肠杆菌感受态细胞，完成zmbzip45敲除载体的构建。利用转基因技术，将crispr/cas9-zmbzip45载体导入玉米品种b104中。结果表明：zmbzip45敲除突变体玉米对纹枯病菌的抗性明显增强。
58.进一步的，利用强启动子驱动原理的转基因技术，将zmbzip45基因的超量表达载体转入水稻品种中花11。结果表明：zmbzip45基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显减弱。
59.综上，通过上述试验可以证实：zmbzip45基因负向调控作物对纹枯病的抗性。
60.由此，本发明从玉米中分离克隆出一个玉米纹枯病抗病相关基因zmbzip45。zmbzip45基因的序列如seq id no.1所示，编码区序列如seq id no.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。并在国际上首次验证了zmbzip45基因的功能；利用其功能最终发现抑制该基因的表达之后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获
得高抗病植株。
61.crispr-cas9基因编辑技术可以通过靶向病害相关基因培育出广谱抗性的农作物。因此，在实际应用时，可以利用crispr-cas9基因编辑技术对zmbzip45基因进行突变产生的抗病表型能够稳定遗传，通过敲除感病基因zmbzip45显著提高了感病品种的抗性。
62.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
63.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：本发明中所使用的纹枯病菌ywk196记载在文献“两个玉米纹枯病病原诱导启动子的克隆与功能鉴定”中(山东农业大学硕士学位论文，2014年)；公众自申请之日起20年内可从申请人处获得纹枯病菌ywk196，以用于重复本试验。
64.实施例1：玉米基因zmbzip45的鉴定
65.根据318份玉米自交系接种纹枯病菌后的表型数据全基因组关联分析，将基因zmbzip45定位到的玉米第1染色体上。通过对54份玉米自交系zmbzip45基因重测序，进一步分析感病自交系群体和抗病自交系群体基因序列间的差异，发现在感病自交系群体和抗病自交系群体之间，zmbzip45的5’utr处有7个突变(插入和缺失)，因此将zmbzip45作为候选基因，zmbzip45属于bzip家族转录因子，目前未见其抗病功能报道。
66.zmbzip45基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；编码区cdna序列如seq id no.2所示；zmbzip45基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
67.实施例2：玉米基因zmbzip45的表达趋势分析
68.(1)将抗玉米纹枯病自交系和易感玉米纹枯病自交系共同种植在28℃，10h光照，75％湿度的温室里，生长到45天时，对玉米叶鞘接种纹枯病菌ywk196，在接种后第0、8、12、24小时分别对抗玉米纹枯病自交系群体和易感玉米纹枯病自交系群体混合取样。
69.(2)分别提取叶鞘样品中的总rna，并反转录合成cdna第一链。
70.(3)根据zmbzip45基因的cdna序列，合成引物，使用rea1-time pcr检测zmbzip45在各处理时期的表达。
71.结果参见图1：zmbzip45的表达量随着接种纹枯病菌ywk196时间的延长在易感玉米纹枯病自交系群体中大幅提高，而在抗纹枯病菌玉米自交系群体中zmbzip45的表达无显著差异；说明纹枯病抗性基因zmbzip45受纹枯病菌诱导表达从而降低玉米纹枯病的抗性。据此推测，通过敲除感病自交系中zmbzip45可以增强其对纹枯病抗性。
72.实施例3：玉米基因zmbzip45的功能验证
73.1、zmbzip45基因编辑玉米植株的构建：
74.(1)zmbzip45敲除载体的构建
75.根据crispr-cas9基因敲除系统的要求，在目的基因的外显子区域中选择末端带有ngg的20bp碱基序列作为基因敲除的靶标序列。利用crispor在线工具(http://crispor.tefor.net/)在zmbzip45上设计两个靶位点，分别设计了特异性靶向该基因起始密码子atg下游，第650-672位碱基和932-954位碱基的两个导向rna(grna-1和grna-2)，其中，grna-1的序列为：5
′‑
gacgtcgcgtttatatcgga-3
′
(seq id no.4)，grna-2的序列为：5
′‑
accatacttttggcgaaact-3
′
(seq id no.5)。通过引物5
′‑
aataatggtctcaggcggacgtcgcgtt
tatatcgga-3
′
(seq id no.6)和5
′‑
ggacgtcgcgtttatatcggagttttagagctagaaatagc-3
′
(seq id no.7)以及引物5
′‑
agtttcgccaaaagtatggtcgcttcttggtgcc-3
′
(seq id no.8)和5
′‑
attattggtctctaaacagtttcgccaaaagtatggt-3
′
(seq id no.9)构建两个靶位点的sgrna表达盒。
76.将表达盒连入pbue411载体并转化大肠杆菌感受态细胞后，对重组子进行菌落pcr，琼脂糖凝胶电泳检测，重组子中包含有与目的片段大小相同的条带。将鉴定好的重组子扩大培养后提取质粒，质粒测序后与原序列比对，连入的片段没有碱基突变和缺失，证明zmbzip45敲除载体(crispr/cas9-zmbzip45载体)构建成功。
77.(2)zmbzip45基因编辑玉米植株的获得
78.2.1将步骤(1)中构建的crispr/cas9-zmbzip45载体导入农杆菌eha105菌株中，侵染b104玉米的成熟胚愈伤组织，通过共培养、恢复培养和筛选培养，得到抗性愈伤组织。
79.2.2将抗性抗性愈伤组织经过分化、生根等培养，得到再生植株。
80.2.3将再生植株移栽于营养钵中，种植于温室。取成活的再生植株的叶片，提取dna，根据基因组dna的序列在敲除靶点的上下游约100～200bp的位置设计检验引物，用引物经过高保真酶pcr扩增获得dna片段，然后产物凝胶电泳后切胶回收，用设计好的引物送公司测序。测序结果通过软件mega6.0分析敲除效果(图2)。
81.2、zmbzip45基因编辑玉米植株对纹枯病菌的抗性研究
82.通过crispr-cas9基因编辑技术，本发明共获得两种类型的纯合突变体植株，分别被命名为cas9-1和cas9-2。对t1代两种突变类型的阳性纯和突变体植株进行玉米纹枯病菌的接种鉴定。
83.结果表明，接种纹枯病菌ywk196 7天后，crispr-cas9敲除zmbzip45突变植株与野生型相比平均病斑缩短了3.27cm和3.38cm(图3)。
84.同时检测了野生型和crispr-cas9敲除zmbzip45突变植株接种纹枯病菌24小时后pr基因的表达(pr基因是植物中的病程相关基因，在受到病原菌侵染时都会上调表达，现在在抗病领域作为一种标记基因来指示植物的抗病性)，结果表明，接种纹枯病菌后，pr4和pr10在敲除突变体中的表达量显著高于野生型(图4)。
85.另外，根据数据库zmbzip45基因序列设计引物(引物1，5
′‑
gaccctgtccggtgggg-3
′
，如序列表seq id no.10所示；引物2，5
′‑
ctagaagcactggtgcaacaagtg-3
′
，如序列表seq id no.11所示)用来获得zmbzip45基因。提取玉米b73rna并通过反转录获得cdna，以cdna作为模板，进行pcr扩增；反应程序如下：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃25s，反应32个循环，后延伸72℃7min；
86.结束后，用康为公司的dna回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的dna片段连接至超量表达载体pcxun，热激转化e.coli dh5α感受态细胞后对重组子进行菌落pcr，琼脂糖凝胶电泳检测，重组子中包含有与目的片段大小相同的条带。将鉴定好的重组子扩大培养后提取质粒，质粒测序后与原序列比对，连入的片段为全长cdna并且没有碱基突变和缺失，证明zmbzip45超量表达载体pcxun：：zmbzip45构建成功。
87.采用农杆菌介导的遗传转化方法(lin and zhang，optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice，2005，plant cell rep.23：540-547)将超量表达载体导入水稻品种中花11。获得的遗传转化植株
被命名为pcxun：：zmbzip45。本发明共获得独立转化植株29株，其中阳性植株为24株。分别对t1代3个转基因株系pcxun：：zmbzip45-1、2、3进行玉米纹枯病菌的接种鉴定。
88.结果表明，接种纹枯病菌ywk196 7天后，超量表达zmbzip45的转基因植株与野生型相比平均病斑增加了1.65cm、1.86cm和1.9cm(图5)，这些结果说明zmbzip45负向调控作物对纹枯病的抗性反应。
89.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。