五种食源性致病菌的多重PCR检测引物组、试剂盒和方法与流程

五种食源性致病菌的多重pcr检测引物组、试剂盒和方法
技术领域
1.本发明属于微生物检测领域，具体涉及五种食源性致病菌的多重pcr检测引物组、试剂盒和方法。


背景技术：

2.沙门氏菌(salmonella)是一种常见的食源性致病菌，主要是通过污染的食物和水源摄入。本菌广泛分布于自然界，引起人类和动物的许多临床和亚临床感染症状，因此具有重要的公共卫生意义，是目前世界各国分离率最高的菌型之一。
3.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病微生物，其繁殖过程中产生的肠毒素是引发食物中毒的致病因子。近几年，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。
4.副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌。该菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。常存在于近海岸海水、海产品及盐渍食品中。它是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。人们食用被副溶血性弧菌污染的食物后极可能会引起以腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热等为主要症状的急性肠胃炎。
5.单核细胞增生李斯特氏菌(listeria monocytogenes)是一种人畜共患病的病原菌。它生命力顽强，在0℃～45℃都能生存，在冰箱的冷藏温度下仍可生长，这也是它不同于其他食源性致病菌的重要特征。该菌主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一，造成二至三成的感染者死亡，其致死率甚至高过沙门氏菌及肉毒杆菌。
6.大肠埃希氏菌o157:h7是肠出血性大肠杆菌(ehec)的一个血清型，是引起食源性疾病主要血清型，主要临床症状为突发性腹痛、腹泻、血便，严重时并发肾衰竭，病死率高。大肠杆菌o157:h7主要污染肉类食品，蔬菜中也时有检出，是食品中潜在危害巨大的食源性致病菌。
7.因此，快速、特性、高效的检出食品中的上述致病菌，对于其引起的食源性疾病防控以及暴露病例的治疗具有重要的意义。目前食品中食源性致病菌的检测主要依靠传统的细菌分离鉴定和细菌16s rrna的单一pcr扩增及产物测序比对，存在操作繁琐、检测周期长、灵敏度低等问题。因此，建立一种能同时鉴别食品中多种食源性致病菌的多重pcr(multiplex polymerase chain reaction，mpcr)方法是目前的重点研究方向，其不仅具有普通pcr的高特异性和敏感性等优点，还能同时扩增多个基因片段，快速准确，可用于多种病原的鉴定或同种病原多个基因的检测。目前对这五种致病菌中的一种、数种的单重、多重pcr方法均有报导，但同时检测这五种病原的检测方法还未见报导。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶
血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157:h7的引物组及其应用，能够通过一次pcr诊断五种病原菌，大大减少常规检测的时间，对于食品中致病菌的快速检测具有重要意义。具体采用以下的技术方案：
9.一种多重pcr检测食源性致病菌的引物组，由检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157：h7的引物对组成；
10.所述检测沙门氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由seq id no：1和seq id no：2所示；所述检测金黄色葡萄球菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由seq id no：3和seq id no：4所示；所述检测副溶血性弧菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由seq id no：5和seq id no：6所示；所述检测单核细胞增生李斯特氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由seq id no：7和seq id no：8所示；所述检测大肠埃希氏菌o157：h7引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由seq id no：9和seq id no：10所示。
11.本发明还提供了一种检测食源性致病菌的试剂盒和方法，该试剂盒包括上述的引物组。该方法以上述的引物组作为引物，以待测样本的基因组dna为模板dna进行五重pcr扩增，当pcr扩增条带中同时出现335bp、274bp、261bp、291bp和302bp五个特异性片段，则判定待测样本中同时含有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157:h7。
12.优选地，所述五重pcr扩增体系以25μl计，包括：10种引物的终浓度均为0.2μmol，pcrmix 12.5μl，模板dna 1μl，蒸馏水补足至25μl。
13.优选地，所述五重pcr扩增的程序包括：94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
14.本发明的有益效果为：本发明提供的引物组能够同时对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157:h7进行检测，基于本发明的引物组建立的多重pcr检测方法具有良好的特异性和敏感性，检出限达到了5
×
10-3
ng/μl。
附图说明
15.图1所示为实施例1不同产物片段在不同退火温度下的产物浓度结果图；
16.图2所示为实施例1中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157:h7多重pcr检测特异性验证结果图；
17.图3所示为实施例2不同产物片段在不同退火温度下的产物浓度结果图；
18.图4所示为实施例2中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157:h7多重pcr检测敏感性验证结果。
具体实施方式
19.以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
20.本发明提供了一种同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157:h7的引物组，所述引物组的信息如表1所示：
21.表1引物组信息
[0022][0023]
在本发明中，所述引物组中的各引物分别根据genbank公布的沙门氏菌inva基因序列、金黄色葡萄球菌alt基因序列、副溶血性弧菌tdh基因序列、单核细胞增生李斯特氏菌prfa基因序列和大肠埃希氏菌o157:h7 rfbe基因序列，利用primerplex 2多重pcr引物设计软件设计4对引物。本发明中所述引物组由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0024]
实施例1：
[0025]
以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157:h7混合dna为模板，利用表1所述的引物组，构建25μl体系，各组体系分别为：10种引物的终浓度均为0.2μmol，pcrmix 12.5μl，模板1μl，蒸馏水补足至25μl，进行pcr扩增pcr扩增反应条件分别为：
[0026]
a：94℃变性30s，60.0℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0027]
b:94℃变性30s；59.4℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0028]
c:94℃变性30s；58.3℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0029]
d:94℃变性30s；56.3℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0030]
e:94℃变性30s；53.9℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0031]
f：94℃变性30s；52.0℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0032]
g：94℃变性30s；50.7℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0033]
h：94℃变性30s；50.0℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0034]
经上述条件经过pcr后得到的扩增产物用毛细管电泳检测，结果如图1和表2所示：pcr能够同时扩增出约335bp、274bp、261bp、291bp和302bp五个特异性片段，表明本实验建立的五重pcr方法具有良好的重现性。
[0035]
表2不同退火温度条件下多重pcr产物浓度结果
[0036][0037]
其特异性验证结果如图2所示(在图2a和图2b中，m：size marker(见表1)；1：大肠杆菌o157；2：金黄色葡萄球；3：沙门氏菌；4：副溶血性弧菌；5：单核细胞增生李斯特氏菌；6：五种致病菌混合dna；7：变形杆菌；8：表皮葡萄球菌；9：溶藻弧菌；10：英诺克李斯特氏菌；11：大肠埃希氏菌；12：蒸馏水)。
[0038]
实施例2：
[0039]
以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌o157:h7混合dna为模板，利用表1所述的引物组，构建25μl体系，进行pcr扩增：94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。各组体系分别为：
[0040]
a：10种引物的终浓度均为0.8μmol，pcrmix 12.5μl，模板1μl，蒸馏水补足至25μl；
[0041]
b：10种引物的终浓度均为0.6μmol，pcrmix 12.5μl，模板1μl，蒸馏水补足至25μl；
[0042]
c：10种引物的终浓度均为0.5μmol，pcrmix 12.5μl，模板1μl，蒸馏水补足至25μl；
[0043]
d：10种引物的终浓度均为0.4μmol，pcrmix 12.5μl，模板1μl，蒸馏水补足至25μl；
[0044]
e：10种引物的终浓度均为0.3μmol，pcrmix 12.5μl，模板1μl，蒸馏水补足至25μl；
[0045]
f：10种引物的终浓度均为0.2μmol，pcrmix 12.5μl，模板1μl，蒸馏水补足至25μl；
[0046]
经上述条件经过pcr后得到的扩增产物用毛细管电泳检测，结果如图3和表3所示：pcr能够同时扩增出约335bp、274bp、261bp、291bp和302bp五个特异性片段，表明本实验建立的五重pcr方法具有良好的重现性。其敏感性验证结果如图4所示。
[0047]
表3不同引物浓度条件下多重pcr产物浓度结果
[0048][0049]
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。