一种脐带血造血干细胞分离设备、干细胞培养选型方法及其过敏性鼻炎上的应用

1.本发明涉及造血干细胞领域，更具体地说，涉及一种脐带血造血干细胞分离设备、干细胞培养选型方法及其过敏性鼻炎上的应用。


背景技术：

2.造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。
3.申请号为cn201110219408.4的已授权的中国专利《一种脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法》中公开了用于脐带血干细胞分离的二联袋，在两次离心后，通过取样口进行取样测定干细胞的数量和浓度，在该公开方案中，取样口未明确说明进行密封或者取样时临时密封等特殊设置，取样时存在引入外界细菌的风险，不利于干细胞的后续保存或应用。


技术实现要素：

4.1.要解决的技术问题
5.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种脐带血造血干细胞分离设备，通过内封取样管的设置，分离时，在取样之前，先挤压主袋，使血液浸满内封取样管下端部，可手动按压内封取样管顶部，使自吸液球内负压的状态被破坏，从而直接吸收内封取样管内血液，之后再次按压内封取样管顶部，使自吸液球与主袋之间再次密封隔离，此时，在通过注射器扎入自吸液球内取样，相较于现有技术，取样时，完全与主袋内血液隔离，进而有效避免内部血液被污染的情况发生，有效降低对干细胞后续保存或应用的影响。
6.2.技术方案
7.为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
8.一种脐带血造血干细胞分离设备，包括主袋，所述主袋上端连接有进料管、转移主管以及细胞排出管，所述转移主管中部连接有内封取样管，所述转移主管上端连接有进血管和转移副管，所述转移副管远离转移主管的端部连接有转移袋，所述内封取样管包括下取血层、固定连接在下取血层上端的限位层以及连接在限位层上端的橡胶取血层，所述下取血层与转移主管连接并相通，所述橡胶取血层内部设置有自吸液球，所述自吸液球下端部固定贯穿限位层并延伸至下取血层内，所述自吸液球内顶端固定连接有内封杆，所述内封杆下端部位于限位层内。
9.进一步的，所述下取血层和橡胶取血层均为空心结构，且橡胶取血层为柔性密封结构。
10.进一步的，所述自吸液球包括位于橡胶取血层内的自胀取液层、固定连接在自胀取液层上端以及橡胶取血层内顶端之间的顶环、固定连接在自胀取液层下端的吸液管，所述吸液管固定贯穿限位层并延伸至下取血层内。
11.进一步的，所述吸液管为上下两端内径小中部内径大的结构，所述内封杆下端部与内径小的吸液管过盈配合，且吸液管下方内径小的部分长度大于橡胶取血层伸直后的长度。
12.进一步的，所述自胀取液层原状为类球形的结构，在未取样时，自胀取液层内进行抽真空处理，使自胀取液层处于中部相互靠近的类椭圆的结构。
13.进一步的，所述吸液管下方变径处固定连接有抵压盘，所述抵压盘包括多个支撑杆以及连接在多个支撑杆上端部的磁封球，所述磁封球内填充有磁流变液，所述内封杆下端部中心向下的内部固定镶嵌有内磁片，所述内磁片与磁封球相互匹配。
14.进一步的，所述磁封球包括与支撑杆上端连接的下撑球以及固定连接在下撑球上端部的磁变球，所述磁变球为弹性密封结构。
15.进一步的，所述橡胶取血层上端固定连接有取样板，所述取样板上开凿有取样槽，所述取样槽内底端刻画有顶环以及内封杆上端部的投影轮廓，且两轮廓之间的部分刻画有取样环。
16.另外本发明还公开了一种干细胞培养选型方法，方法如下：
17.干细胞的分离纯化：采用上述分离设备进行使用进行干细胞的分离，选定靶标基因，然后以靶标基因分选阳性细胞亚群；
18.干细胞培养：接种分离纯化后的干细胞，进行干细胞培养，对干细胞进行扩增。
19.另外本发明还公开了一种干细胞培养选型方法在过敏性鼻炎上的应用，采用上述干细胞培养选型方法，以adcyap1基因序列为靶标基因，分选adcyap1阳性细胞亚群，提取细胞多肽用于治疗过敏性鼻炎。
20.3.有益效果
21.相比于现有技术，本发明的优点在于：
22.(1)本方案通过内封取样管的设置，分离时，在取样之前，先挤压主袋，使血液浸满内封取样管下端部，可手动按压内封取样管顶部，使自吸液球内负压的状态被破坏，从而直接吸收内封取样管内血液，之后再次按压内封取样管顶部，使自吸液球与主袋之间再次密封隔离，此时，在通过注射器扎入自吸液球内取样，相较于现有技术，取样时，完全与主袋内血液隔离，进而有效避免内部血液被污染的情况发生，有效降低对干细胞后续保存或应用的影响。
23.(2)本发明还公开了一种干细胞培养选型方法在过敏性鼻炎上的应用，以adcyap1为靶标基因，结合流式分选adcyap1阳性细胞亚群(cluster15)，通过提取细胞多肽的方法，将提取的多肽应用于过敏性鼻炎的治疗应用。
附图说明
24.图1为本发明的主要的结构示意图。
25.图2为本发明的内封取样管截面的结构示意图。
26.图3为本发明的内封取样管上端部部分的截面结构示意图。
27.图4为本发明取样时内封取样管上端部部分截面的结构示意图。
28.图5为本发明的内封杆与抵压盘接触时接触处部分的结构示意图。
29.图6为本发明的取样板截面的结构示意图。
30.图7为本发明实施例4中单细胞分选所检测得到数据图。
31.图8为本发明实施例4中各亚群中adcyap1基因表达检测数据图。
32.图中标号说明：
33.1主袋、2转移袋、3进料管、4进血管、5转移副管、6转移主管、7内封取样管、71下取血层、72限位层、73橡胶取血层、8抵压盘、81支撑杆、821下撑球、822磁变球、9自吸液球、91自胀取液层、92顶环、93吸液管、10内封杆、11取样板、12内磁片。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图；对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然；所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例；而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例；本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例；都属于本发明保护的范围。
35.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
36.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
37.实施例1：
38.请参阅图1，一种脐带血造血干细胞分离设备，包括主袋1，主袋1上端连接有进料管2、转移主管6以及细胞排出管，转移主管6中部连接有内封取样管7，转移主管6上端连接有进血管4和转移副管5，转移副管5远离转移主管6的端部连接有转移袋2。
39.请参阅图2，内封取样管7包括下取血层71、固定连接在下取血层71上端的限位层72以及连接在限位层72上端的橡胶取血层73，下取血层71和橡胶取血层73均为空心结构，且橡胶取血层73为柔性密封结构，使橡胶取血层73能够在纵向形变，便于控制取样前后内部自吸液球9的密封，下取血层71与转移主管6连接并相通，橡胶取血层73内部设置有自吸液球9，自吸液球9下端部固定贯穿限位层72并延伸至下取血层71内，自吸液球9内顶端固定连接有内封杆10，内封杆10下端部位于限位层72内。
40.请参阅图3，自吸液球9包括位于橡胶取血层73内的自胀取液层91、固定连接在自胀取液层91上端以及橡胶取血层73内顶端之间的顶环92、固定连接在自胀取液层91下端的吸液管93，吸液管93固定贯穿限位层72并延伸至下取血层71内，吸液管93为上下两端内径小中部内径大的结构，当内封杆10下端部位于内径大的部分后，可使自吸液球9内外相通，
从而进行内封取血，内封杆10下端部与内径小的吸液管93过盈配合，使内封杆10能够有效密封自吸液球9与主袋1，且吸液管93下方内径小的部分长度大于橡胶取血层73伸直后的长度，有效保证在按压橡胶取血层73后，使其完全被压扁后，内封杆10仍然位于吸液管93内，仍然可以保证自吸液球9内外的密封性。
41.自胀取液层91原状为类球形的结构，在未取样时，自胀取液层91内进行抽真空处理，使自胀取液层91处于中部相互靠近的类椭圆的结构，在抽真空后，使自胀取液层91内呈现负压状态，当移动内封杆10的位置，使其位于内径大的部分时，自胀取液层91与下取血层71相通，在其恢复形变的过程中，实现自动吸取内部血液的效果，实现自胀取样。
42.请参阅图6，橡胶取血层73上端固定连接有取样板11，取样板11上开凿有取样槽，取样槽内底端刻画有顶环92以及内封杆10上端部的投影轮廓，且两轮廓之间的部分刻画有取样环，取样环为图中加粗黑色环部分，该部分为取样最佳部分，使针扎入进入到自吸液球9内时，不易受到顶环92以及内封杆10的阻挡，有效保证取样的正常进行。
43.另外在通过注射器取样之前，先对取样槽消毒；并且在注射器取样后，对其抽吸可实现其再次皱缩变小，呈现负压，便于再次自胀取样。
44.在本实施例中，取样时，可自由控制内封杆10的移动方向，向上或者向下将其下端部移动至吸液管93内径较大处即可。
45.实施例2：
46.吸液管93下方变径处固定连接有抵压盘8，请参阅图5，抵压盘8包括多个支撑杆81以及连接在多个支撑杆81上端部的磁封球，磁封球内填充有磁流变液，内封杆10下端部中心向下的内部固定镶嵌有内磁片12，内磁片12与磁封球相互匹配，磁封球包括与支撑杆81上端连接的下撑球821以及固定连接在下撑球821上端部的磁变球822，磁变球822为弹性密封结构，内封杆10挤压抵压盘8时，磁变球822形变，同时内部的磁流变液在内磁片12作用下贴附在内封杆10表面并相互吸附，从而实现对内封杆10的定位，使自胀取液的顺利进行。
47.在本实施例里，由于抵压盘8的限制，内封杆10位于吸液管93上侧内径小的部分中，在取样时，仅仅只能向下按压内封杆10，使其进入到内径大的部分中，从而实现内外通透，虽然实施例1中，可向上拉动或者向下按压橡胶取血层73上端部，有两种操作方式，但是本实施例中抵压盘8的设置，有效保证内封杆10下端部不易堵塞变径处，有效保证在内封取液时吸液管93的通透性，有效取样的正常进行。
48.通过内封取样管7的设置，分离时，在取样之前，先挤压主袋1，使血液浸满内封取样管7下端部，如图4，可手动按压内封取样管7顶部，使自吸液球9内负压的状态被破坏，从而直接吸收内封取样管7内血液，之后再次按压内封取样管7顶部，使自吸液球9与主袋1之间再次密封隔离，此时，在通过注射器扎入自吸液球9内取样，相较于现有技术，取样时，完全与主袋1内血液隔离，进而有效避免内部血液被污染的情况发生，有效降低对干细胞后续保存或应用的影响。
49.实施例3
50.本实施例在上述实施例中所提出的分离设备基础上，提出一种干细胞培养选型方法，方法如下：
51.干细胞的分离纯化：采用上述分离设备进行使用进行干细胞的分离，选定靶标基因，然后以靶标基因分选阳性细胞亚群；
52.干细胞培养：接种分离纯化后的干细胞，进行干细胞培养，对干细胞进行扩增。
53.脐血干细胞由于取材方便、来源广泛而备受关注。研究表明，来源于脐带血的单个核细胞培养后出现的贴壁细胞有两种表型，破骨样细胞和间充质样细胞。破骨样细胞多核，表达trap、cd45、cd51/cd61等；间充质样细胞呈成纤维样，表达sh2、sh3、sh4、asma、mab1470、cd13、cd29、cd49e等，与骨髓间充质干细胞完全一致。以下就将脐带血间充质干细胞的体外分离、纯化、扩增方法做一介绍，为脐带血间充质干细胞的临床应用提供更充足的理论依据和技术方法。
54.1)材料与试剂
55.肝素、脐血、dmem-lg、ficoll-hypaque分离液、甲基纤维素、1
×
prs.mesencult
tm
培养液。
56.2)操作步骤
57.(1)无菌条件下采集肝素抗凝的正常人脐血50-100ml，
58.(2)与0.01mol/lph7.4的pbs按1：1混匀，
59.(3)再按4：1的比例与0.5％的甲基纤维素混匀，室温静置30min以沉降红细胞，
60.(4)小心吸取上清，离心。
61.(5)弃上清，用pbs重悬细胞。
62.(6)叠加到密度为1.077g/ml的ficoll-hypaque溶液上，900g离心20min。
63.(7)取界面层，加入pbs混匀,离心洗涤。
64.(8)用mesencult
tm
培养液(stemcellco.)重悬细胞，以1.0
×
106个/cm2的密度接种于培养瓶中，置于37℃、co25％、饱和湿度的孵箱内培养。
65.(9)1周后，更换培养基，弃掉未贴壁细胞。
66.(10)以后每3天换液1次。
67.(11)细胞长到80％融合时用0.25％的胰蛋白酶和0.02％edta混合液消化传代，在显微镜下控制消化时间。
68.(12)以8.0
×
103个/cm2的细胞密度接种于传代培养瓶中以扩增培养。
69.脐血源性间充质干细胞的优势在于：脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单；对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受；脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低；由于脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应；脐血中含有的丰富干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的分化能力；不涉及社会、伦理及法律方向的更多争论；收集的脐血不仅可作为异基因移植的供体，而且还可将其低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。
70.实施例4
71.本实施例在实施例3的基础上，提出了细胞培养选型方法在过敏性鼻炎上的应用，采用上述干细胞培养选型方法，在获得脐带血间充质干细胞p0代后，通过对单细胞进行亚群分类和鉴定，发现在21个亚群里面，其中亚群14/16/18/19含量为0，如图7所示，即说明了脐带血间充质干细胞p0中只有17个亚群，并且通过对剩余17个亚群中adcyap1基因表达进行检测得到，在亚群15中存在adcyap1基因显著表达和富集，如图8所示。
72.通过以adcyap1基因序列为靶标基因，分选adcyap1阳性细胞亚群，即亚群15，提取细胞多肽用于治疗过敏性鼻炎，其中所提取的多肽可以采用冻干等其他物理或化学方法分
离，或者相应的多肽剂用于后续的过敏性鼻炎治疗。
73.以上所述；仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此；任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内；根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变；都应涵盖在本发明的保护范围内。