一种GLP-1R/GCGR/GIPR三重受体激动剂及其应用的制作方法

一种glp-1r/gcgr/gipr三重受体激动剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种具有胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor，glp-1r)、葡萄糖依赖性促胰岛素肽受体(glucose-dependent insulinotropic peptide receptor，gipr)、胰高血糖素受体(glucagon receptor，gcgr)三重受体激动剂类似物的设计筛选，具体涉及一种glp-1r/gcgr/gipr三重受体激动剂及其应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。目前，全球糖尿病患者已经超过4.65亿，预计到2025年将超过5亿，中国已经成为仅次于印度的糖尿病第二大国，其中2型糖尿病约占糖尿病患者总人数的90％。2型糖尿病(t2dm)是一种慢性代谢失调疾病，其主要特征为肝糖输出增加，胰腺β细胞功能缺陷，胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗，最终发展为持续的高血糖症状(green等人，current pharmaceutical design,2004,10)。t2dm也是导致肾衰竭、失明和截肢的主要原因，同时也与由心血管所导致的高死亡风险密切相关。而且，随着肥胖症的快速增加，将使t2dm更加流行，这一现象在发展中国家尤为突出。虽然有很多治疗糖尿病的药物已经通过了fda(美国食品和药品管理局)的审批，仍然需要新的治疗手段来更好达到对血糖和体重的控制。现在治疗2型糖尿病最有效的方法是注射胰岛素，但其副作用是会出现低血糖的危险。而其他糖尿病常用小分子治疗药物如磺酰脲类、格列奈类也容易引起低血糖，二甲双胍影响维生素吸收，dpp-4抑制剂可能产生血压升高、促发免疫反应等一些缺点。
3.1929年la barre提出了肠促胰素的概念(肠分泌胰岛素)。胰高血糖素样肽-1(glp-1) 和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)是迄今在人体内发现的两种活性最强的肠促胰素。
4.glp-1是一种由小肠l细胞分泌的内源性肠促胰岛素激素。前胰高血糖素原是多种胃肠激素的前体，其在翻译后进行剪切可得到胰高血糖(glucagon)和glp-1等活性多肽。glp-1 受体是g蛋白偶联受体(g protein-coupled receptors，gpcrs)b类家族的一员。b类家族 gpcrs包含gipr、gcgr等。glp-1在胰岛、肠神经元和中枢神经系统中大量表达，在肺、肾、心脏和周围神经系统中中度表达。glp-1在胰岛中发挥保护胰岛β细胞的作用，以葡萄糖依赖的方式刺激胰岛β细胞释放胰岛素，有效控制餐后血糖的作用。因其独特的作用机制，低血糖风险大大降低。glp-1在其他生理系统中的表达则有抑制食欲、延缓胃排空以及心血管获益等好处。然而glp-1酰胺在血浆中会被二肽基肽酶-4(dpp-4)等酶切割而代谢失活，并被肾小球快速滤过清除，导致体内半衰期较短，只有1～2min。
5.胃泌酸调节肽(oxm)是一种含有37个氨基酸的多肽，它的序列包括胰高血糖素的全部 29个氨基酸以及在c-端被称为ip-1(intervening peptide-1)的8个氨基酸延长 (bataille,tal.peptides,1981,2,supplement2,41-44)。oxm的序列为： his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-v al-gln-trp-leu-met-asn-thr-lys-arg-asn-arg-asn-asn-ile-ala-nh2。
6.oxm被证实可以同时激活glp-1受体和胰高血糖素受体(gcgr)。它的抑制食物摄取的作用很可能是通过与glp-1受体的结合来实现的。oxm在glp-1受体敲除的小鼠上不能引起食欲抑制作用，但是在胰高血糖素受体敲除的小鼠上则不受影响。相同摩尔量的oxm 和glp-1可以产生相似的食物摄取抑制作用(darkin,et al.endocrinology,2001,142,10, 4244-4250)。在超重和肥胖病人身上的临床实验表明，餐前30分钟皮下注射oxm可以降低 25％的能量摄取。更重要的是，连续4周给药，所有施用oxm病人都有2.3公斤左右的体重下降而对照组则只有0.5公斤的下降(wynne,et al.diabetes,54,82390-2395)。
7.胰高血糖素的主要药理活性是在低血糖的状态下促进肝糖分解和糖质新生 (exton.advances in enzyme regulation,1968，6,391-407)，因此它的临床应用仅限于紧急治疗胰岛素注射所引起的低血糖现象或是用做食道肌肉松弛剂。胰高血糖素还具有增加脂类分解，增加饱足感，增加产热以及能量消耗等作用(habegger,t.nature reviews endocrinology,2010,6, 689-697)。胰高血糖素增加饱足感和促进能量消耗等特点使其成为一个潜在的肥胖治疗靶点，但是它的升血糖以及加速胰岛素抵抗等作用限制了它的应用。
8.day等人在dio动物模型中施用glp-1/胰高血糖素双重激动剂以及等摩尔浓度的单一 glp-1受体激动剂，结果发现，双重激动剂和单一选择性的glp-1受体激动剂相比都能够显著性地降低食物摄取，体重以及脂肪组织含量。同时，它们也可以减低血糖以及增加葡萄糖耐受。
9.各类glp-1/gcg和glp-1/gip双重受体激动剂的成功研发，引发了对同时激动3种靶受体的单个分子的研究。glp-1的食欲抑制作用、gip的脂肪分解作用及胰高血糖素的热量消耗作用结合起来可以提供协同的减轻体质量作用，因此三重受体激动剂可有效控制血糖，改善葡萄糖耐量，提高胰岛素敏感性。glp-1和胰高血糖素都来源于胰高血糖素原前体，gip 分子与glp-1和胰高血糖素的n末端具有极高的同源性，而3个分子的n末端均为受体与配体亲和结合的部位，这为glp-1/gcg/gip三重受体激动剂的猜想与设计提供了基础。


技术实现要素：

10.为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种glp-1r/gcgr/gipr三重受体激动剂及其应用。
11.glp-1和胰高血糖素都来源于胰高血糖素原前体，glp-1和胰高血糖素的双重受体激动剂结合了胰高血糖素的热量消耗和脂解作用与glp-1的延缓胃排空和促胰岛素分泌作用，因此可产生显著的体重减轻作用并且可以缓冲胰高血糖素的升血糖作用，从而有效控制血糖。 gip(葡萄糖依赖性促胰岛素肽)是由小肠的神经内分泌k细胞分泌的多肽，由gipr介导其生理作用，主要为非葡萄糖依赖的促胰岛素分泌、增强胰高血糖素分泌、增强脂质代谢等作用，且与glp-1和胰高血糖素的n末端具有极高的同源性。而胃泌酸调节素(oxm， oxyntomodulin)可通过激活gcgr，具有增加能量消耗和改善肝脏脂肪代谢等效应，除胰高血糖素序列外，oxm在c末端延伸出8个氨基酸残基。本发明主要利用oxm的c末端肽序、gip与glp-1关键活性序列并结合长效修饰，设计一系列多肽类似物，进行降糖作用、促胰岛素分泌作用比较。
12.本发明的多肽化合物从具有glp-1/胰高血糖素双重受体激动活性的序列开始，逐
步引入 gip残基以引入gip的激动活性，同时不破坏glp-1/胰高血糖素的激动活性，保留3个天然肽的高效能。本发明肽序在n端酶解位置用不同的特殊氨基酸取代以防止dpp-4酶切；在n 端20位氨基酸位置用lys或者cys连接不同的脂肪酸链或者类似脂肪酸链以延长体内作用时间。采用非常规氨基酸取代、磷酸化氨基酸、糖基化氨基酸等方式进行氨基酸取代改造，采用不同的侧链修饰进行侧链修饰改造、采用环化封闭结构改造，设计得到本发明31个多肽化合物analog1-analog31。最后对这些类似物进行了降糖生物活性筛选，通过转染技术构建高度表达胰高血糖素样肽-1受体的hek293细胞，glp-1r/gcgr/gipr激动剂可作用于该细胞，测定化合物刺激细胞产生camp的含量，评价化合物的glp-1r/gcgr/gipr受体激动活性。设计的类似物analog4、analog13、analog18、analog23、analog29的ec50值均在纳摩尔以下，表现非常好的降糖活性，对细胞实验较好的五种类似物多肽同时进行了降血糖和促胰岛分泌的小鼠实验，在小鼠实验中表现出非常好的降糖和促进胰岛分泌的效果，其中analog18的生物活性最强，高于glp-1受体激动剂的对照品。
13.本发明的具体技术方案如下：
14.本发明第一方面提供一种多肽化合物，其具有以下氨基酸序列表示的母体肽，
15.h-xaa
1-xaa
2-glu
3-gly
4-xaa
5-phe
6-xaa
7-xaa
8-asp
9-val
10-xaa
11-ser
12-xaa
13-leu
14-glu
15-gly
16
ꢀ‑
gln
17-xaa
18-ala
19-xaa
20-glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-trp
25-leu
26-val
27-xaa
28-gly
29-arg
30-gly
31-lys
32
‑ꢀ
arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-asn
37-ile
38-ala
39-nh2(seq id no.1)；
16.其中，xaa1选自his，d-his或ac-his；
17.xaa2选自ala，aib，d-ala或nmeala；
18.xaa5选自thr，d-thr，thr(o-phospho)或thr(o-β-d-glucose)；
19.xaa7选自thr，d-thr，thr(o-phospho)或thr(o-β-d-glucose)；
20.xaa8选自ser，d-ser，ser(o-phospho)或ser(o-β-d-glucose)；
21.xaa
11
选自ser，d-ser，ser(o-phospho)或ser(o-β-d-glucose)；
22.xaa
13
选自tyr，d-tyr，tyr(o-phospho)或tyr(o-β-d-glucose)；
23.xaa
18
选自ala，aib，d-ala或nmeala；
24.xaa
20
选自lys(oct-γglu-aeea-aeea)，lys(pal-γglu-aeea-aeea)， lys(c16-γglu-aeea-aeea)，
25.lys(c20-γglu-aeea-aeea)，lys(c22-γglu-aeea-aeea)，lys(peg-γglu-aeea-aeea)， orn(oct-γglu-aeea-aeea)，dap(oct-γglu-aeea-aeea)，dab(oct-γglu-aeea-aeea)， lys(biotin)，
26.cys(maleimide)，cys(maleimide-oct-γglu-aeea-aeea)， cys(maleimide-pal-oct-γglu-aeea-aeea)或cys(maleimide-c20-oct-γglu-aeea-aeea)；
27.xaa
28
选自lys，arg或d-arg。
28.进一步地，所述多肽化合物为asp
9-lys
32
侧链酰胺键环肽，glu
3-lys
32
侧链酰胺键环肽或 glu
15-lys
32
侧链酰胺键环肽。
29.进一步地，本发明经过模拟设计筛选出的多肽化合物具有如下之一氨基酸序列表示的母体肽：
30.(1)analog1-analog13侧链修饰类似物序列：
leu
14-glu
15-gly
16
‑ꢀ
gln
17-ala
18-ala
19-lys(oct-γglu-aeea-aeea)
20-glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-trp
25-leu
26-val
27-arg
28-g ly
29-arg
30-gly
31-lys
32-arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-asn
37-ile
38-ala
39-nh264.analog17(seq id no.18)：
65.h-his
1-nmeala
2-glu
3-gly
4-thr
5-phe
6-thr
7-ser
8-asp
9-val
10-ser
11-ser
12-tyr
13-leu
14-glu
15-gly
16-gln
17-ala
18-ala
19-lys(oct-γglu-aeea-aeea)
20-glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-trp
25-leu
26-val
27-arg
28
‑ꢀ
gly
29-arg
30-gly
31-lys
32-arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-asn
37-ile
38-ala
39-nh266.analog18(seq id no.19)：
67.h-his
1-aib
2-glu
3-gly
4-thr
5-phe
6-thr
7-ser
8-asp
9-val
10-ser
11-ser
12-tyr
13-leu
14-glu
15-gly
16-gl n
17-aib
18-ala
19-lys(oct-γglu-aeea-aeea)
20-glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-trp
25-leu
26-val
27-arg
28-gly 29-d-arg
30-gly
31-lys
32-arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-asn
37-ile
38-ala
39-nh268.analog19(seq id no.20)：
69.h-his
1-d-ala
2-glu
3-gly
4-thr
5-phe
6-thr
7-ser
8-asp
9-val
10-ser
11-ser
12-tyr
13-leu
14-glu
15-gly
16
‑ꢀ
gln
17-d-ala
18-ala
19-lys(oct-γglu-aeea-aeea)
20-glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-trp
25-leu
26-val
27-arg
28
ꢀ‑
gly
29-d-arg
30-gly
31-lys
32-arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-asn
37-ile
38-ala
39-nh270.analog20(seq id no.21)：
71.h-his
1-aib
2-glu
3-gly
4-d-thr
5-phe
6-thr
7-d-ser
8-asp
9-val
10-ser
11-ser
12-d-tyr
13-leu
14-glu
15
‑ꢀ
gly
16-gln
17-ala
18-ala
19-lys(oct-γglu-aeea-aeea)
20-glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-trp
25-leu
26-val
27-a rg
28-gly
29-d-arg
30-gly
31-lys
32-arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-asn
37-ile
38-ala
39-nh272.analog21(seq id no.22)：
73.h-his
1-aib
2-glu
3-gly
4-thr(o-phospho)
5-phe
6-thr
7-ser
8-asp
9-val
10-ser(o-phospho)
11-ser
12-t yr
13-leu
14-glu
15-gly
16-gln
17-ala
18-ala
19-lys(oct-γglu-aeea-aeea)
20-glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-tr p
25-leu
26-val
27-arg
28-gly
29-arg
30-gly
31-lys
32-arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-asn
37-ile
38-ala
39-nh274.analog22(seq id no.23)：
75.h-his
1-aib
2-glu
3-gly
4-thr(o-phospho)
5-phe
6-thr
7-ser(o-phospho)
8-asp
9-val
10-ser(o-phosp ho)
11-ser
12-tyr(o-phospho)
13-leu
14-glu
15-gly
16-gln
17-ala
18-ala
19-lys(oct-γglu-aeea-aeea)
20
‑ꢀ
glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-trp
25-leu
26-val
27-arg
28-gly
29-arg
30-gly
31-lys
32-arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-a sn
37-ile
38-ala
39-nh276.analog23(seq id no.24)：
77.h-his
1-aib
2-glu
3-gly
4-thr
5-phe
6-thr
7-ser(o-β-d-glucose)
8-asp
9-val
10-ser
11-ser
12-tyr
13-leu
14-glu
15-gly
16-gln
17-ala
18-ala
19-lys(oct-γglu-aeea-aeea)
20-glu
21-phe
22-ile
23-ala
24-trp
25-leu
26
‑ꢀ
val
27-arg
28-gly
29-arg
30-gly
31-lys
32-arg
33-asn
34-arg
35-asn
36-asn
37-ile
38-ala
39-nh278.analog24(seq id no.25)：
ile
38-ala
39-nh2(glu
15-lys
32
酰胺键环肽)
95.本发明的上述技术方案中，所述多肽化合物优选为下述序列之一(如下表所示)：
96.xaa1是his，xaa2是aib，xaa5和xaa7是thr，xaa8和xaa
11
是ser，xaa
13
是tyr，xaa
18
是ala，xaa
28
是arg，则xaa
20
是lys(c20-γglu-aeea-aeea)或cys(maleimide-c20-γ glu-aeea-aeea)，即为analog4和analog13；
97.所述xaa1是his，xaa2是aib，xaa5和xaa7是thr，xaa8和xaa
11
是ser，xaa
13
是tyr， xaa
18
是aib，xaa
28
是d-arg，则xaa
20
为lys(oct-γglu-aeea-aeea)，即为analog18；
98.所述xaa1是his，xaa2是aib，xaa5和xaa7是thr，xaa8是ser(o-β-d-glucose)，xaa
11
是ser，xaa
13
是tyr，xaa
18
是aib，xaa
28
是arg，则xaa
20
为lys(oct-γglu-aeea-aeea)，即为analog23；
99.所述asp
9-lys
32
侧链形成酰胺键环，则xaa1是his，xaa2是aib，xaa5和xaa7是thr， xaa8和xaa
11
是ser，xaa
13
是tyr，xaa
18
是aib，xaa
28
是arg，xaa
20
是lys(oct-γ glu-aeea-aeea)，即为analog29。
[0100][0101]
本发明第二方面提供所述的多肽化合物作为glp-1r/gcgr/gipr三重受体激动剂的应用。
[0102]
本发明第三方面提供所述的多肽化合物作为预防和/或治疗代谢性疾病药物的应用。
[0103]
本发明第四方面提供一种预防和/或治疗代谢性疾病的药物组合物，其包括任一所述的多肽化合物或其组合物。
[0104]
进一步地，所述代谢性疾病包括糖尿病、高血糖、肥胖症、高脂血症、动脉硬化、脂肪肝和/或糖尿病并发症。
[0105]
进一步地，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝；
[0106]
所述非酒精性脂肪肝包括非酒精性脂肪样变性、非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化和/或肝纤维化合并的肝硬化；
[0107]
所述糖尿病并发症包括糖尿病肾病、糖尿病高血压、糖尿病眼疾和/或糖尿病神经性病变。
[0108]
本发明的有益效果为：
[0109]
1、本发明利用多肽分子设计的常用手段，对glp-1r/gcgr/gipr多靶点激动剂多肽序列进行改构优化，设计出一系列似化合物analog1-analog31，主要包括侧链修饰改造、氨基酸取代改造、环化封闭结构改造等。最后对这些类似物进行了降糖生物活性筛选，通过转染技术构建高度表达胰高血糖素样肽-1受体的hek293细胞，多肽化合物作用于该细胞，测定化合物刺激细胞产生camp的含量，评价化合物的glp-1r/gcgr/gipr受体激动活性。本发明多肽化合物具有glp-1r/gcgr/gipr三重受体激动活性，可作为glp-1r/gcgr/gipr三重受体激动剂使用，其中类似物analog4、analog13、analog18、analog23、analog29的ec50值均在纳摩尔以下，表现非常好的降糖活性，对细胞实验较好的五种类似物多肽同时进行了降血糖和促胰岛分泌的小鼠实验，在小鼠实验中表现出非常好的降糖和促进胰岛分泌的效果， analog18的生物活性最强，高于glp-1受体激动剂的对照品。
[0110]
2、本发明设计合成的多肽化合物具有天然的多肽二级结构，α螺旋被稳定化，其接近于内源性结构更容易与靶位相结合，并提高了对二肽酰基肽酶iv的耐受，降低了在体内被降解的速度，使其血清半衰期得以延长，并保留了天然的药理活性。
[0111]
本发明多肽化合物明显具有降糖、促进胰岛素分泌作用，同时具有食欲抑制、脂肪分解热量消耗及调节代谢紊乱的功能，连续使用并没有出现胰高血糖素所产生的血糖升高，并对肥胖症有预防和治疗用途，有望作为有效候选药物用于临床治疗代谢紊乱疾病如高血糖、肥胖症等。
[0112]
本发明多肽化合物可以显著改善高脂饮食诱导的小鼠脂肪肝和db/db糖尿病小鼠肝脏脂肪样变性和非酒精性脂肪炎症，glp-1r/gcgr/gipr三靶点激动剂多肽有望作为新一代非酒精性脂肪肝病(包括非酒精性脂肪样变性、非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化、肝纤维化合并的肝硬化)的预防或治疗药物。也可优选为预防、治疗糖尿病并发症药物，所述的糖尿病并发症包括但不限于：糖尿病肾病、糖尿病高血压、糖尿病眼疾、糖尿病神经性病变等。
[0113]
本发明多肽化合物为抑制糖代谢水平和改善代谢疾病提供了研究新方向。
附图说明
[0114]
图1为analog1 hplc检测结果；
[0115]
图2为analog1质谱检测结果。
具体实施方式
[0116]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市购获得。
[0117]
本发明中缩写及其含义，如下表：
[0118]
缩写及英文含义alloc烯丙氧羰基
dic二异丙基碳二亚胺diea二异丙基乙胺dmfn,n-二甲基甲酰胺dcm二氯甲烷fmoc9-芴甲氧羰基boc叔丁氧羰基hbtuo-苯并三唑-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐hatu2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐pybop(苯并三唑-1-氧)三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐hobt1-羟基苯并三唑hoatn-羟基-7-偶氮苯并三氮唑pd(pph3)4四三苯基膦钯phsih3苯硅烷tfa三氟乙酸tis三甲基吡啶phoh苯酚edt1,2-乙二硫醇maleimide马来酰亚胺glp-1对照品利拉鲁肽
[0119]
本发明采用n-端fmoc-保护策略通过标准固相多肽合成方法制备多肽。根据标准的 fmoc方法手动进行肽链的组装。从西安蓝晓科技有限公司购得的fmoc-rink amide树脂(1％交联度，100-200目，取代度0.25-0.35mmol/g)作为固相载体。
[0120]
本发明使用的以下侧链保护的氨基酸为上海吉尔生化有限公司提供的：
[0121]
fmoc-ala-oh,fmoc-arg(pbf)-oh,fmoc-asn(trt)-oh,fmoc-asp(otbu)-oh, fmoc-cys(trt)-oh,fmoc-gln(trt)-oh,fmoc-glu(otbu)-oh,fmoc-glu(oall)-oh, fmoc-gly-oh,fmoc-gly(allyl)-oh,fmoc-his(trt)-oh,fmoc-ile-oh,fmoc-leu-oh,fmoc-lys(b oc)-oh,fmoc-lys(alloc)-oh,fmoc-met-oh,fmoc-nle-oh,fmoc-phe-oh,fmoc-pro-oh,fmoc-s er(tbu)-oh,fmoc-thr(tbu)-oh,fmoc-trp(boc)-oh,fmoc-tyr(tbu)-oh,boc-tyr(tbu)-oh,fmoc
‑ꢀ
val-oh,fmoc-aib-oh,fmoc-orn(alloc)-oh,fmoc-dap(alloc)-oh,fmoc-dab(alloc)-oh,fmoc
‑ꢀ
glu(oall)-oh,fmoc-asp(oall)-oh,fmoc-thr(o-phospho)-oh,fmoc-ser(o-phospho)-oh,fmoc-t yr(o-phospho)-oh,fmoc-thr(o-β-d-glucose)-oh,fmoc-ser(o-β-d-glucose)-oh,fmoc-tyr(o-β
‑ꢀ
d-glucose)-oh。所有的化学品(来自不同的供应商包括上海吉尔生化、成都科隆等)都是化学纯。
[0122]
fmoc-cys(maleimide-oct-γglu-aeea-aeea)-oh, fmoc-cys(maleimide-pal-γglu-aeea-aeea)-oh, fmoc-cys(maleimide-c20-γglu-aeea-aeea)-oh等特殊氨基酸为自制。
[0123]
实施例1：analog1-analog9的线性肽树脂制备
[0124]
称取fmoc-rink-amide树脂(sub＝0.32mmol/g)62.5克(20mmol)于反应柱中，用dmf 清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6 次。称
取fmoc-ala-oh18.66克(60mmol)，hobt8.91克(66mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入11.35克dic(90mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用 dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联fmoc-ile-oh、fmoc-asn(trt)-oh、 fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、 fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh或fmoc-dap(alloc)-oh或fmoc-dab(alloc)-oh、 fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、 fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(trt)-oh、fmoc-val-oh、 fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、 boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-gly-oh；反应结束后，用dmf、dcm、甲醇依次清洗，干燥后得到肽树脂。
[0125]
实施例2：analog1-analog9的侧链保护基团alloc的脱除
[0126]
将实施例1中得到的全保护肽树脂，用dcm清洗3次。称取43.2克的苯硅烷，量取500ml 的dcm，加入反应柱中，反应5分钟之后，加入11.55克的pd0(ph3p)4，反应1小时。然后用dcm清洗3次树脂，用dmf溶液清洗肽树脂30分钟，dmf清洗树脂3次，再用dcm 清洗树脂3次，得到选择性脱除alloc的肽树脂，备用。
[0127]
将所得树脂分成10份，每份2mmol，用于analog1到analog9的合成。
[0128]
实施例3：analog1侧链的偶联
[0129]
称取fmoc-aeea-oh2.31克(6mmol)，hobt0.89克(6.6mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入1.13克dic(9mmol)，活化5分钟，加入实施例2中的肽树脂，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联fmoc-aeea-oh、 fmoc-glu-otbu、十八烷二酸叔丁酯；反应结束后，用用dmf清洗6次，再次用dcm清洗 3次，然后加入甲醇清洗3
×
10分钟，用真空抽干，得到analog1肽树脂18.8克。
[0130]
实施例4：analog1的制备
[0131]
将实施例3得到的18.8克肽树脂加入到500ml单口烧瓶中，预先配制190ml裂解液， tfa：tis：edt：phoh：h2o＝90:3:3:2:2(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5 小时，滤掉树脂，树脂用50mltfa洗涤，合并滤液，加入到1900ml无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥的到白色固体的analog1粗肽9.47克，收率98.13％。 hplc纯度68.88％。用hplc对上述粗肽进行纯化，得到纯度98.87％的analog1精肽3.20克，产品总收率33.15％；analog1的平均分子量为5081.03，质谱测试结果显示4电荷峰为1271.28，经计算得到平均分子量为5081.12(1271.28*4-4＝5081.12)，在目标平均分子量范围之内。 analog1的质谱检测结果和纯度检测结果如图1和2。
[0132]
analog2-analog9侧链偶联方法和实施例3类似，选择需要进行侧链偶联的氨基酸或者类似物，按照侧链数序进行偶联；
[0133]
analog2-analog9的制备方法和实施例4完全一致。analog2-analog9经hplc检测和质谱检测，计算得到平均分子量在目标平均分子量范围之内。
[0134]
实施例5：analog10肽树脂合成
[0135]
称取fmoc-rink-amide树脂(sub＝0.31mmol/g)6.25克(2mmol)于反应柱中，用dcm 清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6 次。称取
fmoc-ala-oh1.87克(6mmol)，hobt0.89克(6.6mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入1.13克dic(9mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk 脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联fmoc-ile-oh、fmoc-asn(trt)-oh、 fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、 fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(maleimide)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、 fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc
‑ꢀ
ser(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、boc-his(trt)-aib
ꢀ‑
glu(otbu)-gly-oh；反应结束后，用dmf、dcm、甲醇依次清洗，干燥后得到analog10的肽树脂。
[0136]
analog11-analog13的肽树脂合成方法和analog10的肽树脂完全一致，第20位根据不同的肽序，选择不同的氨基酸，特殊氨基酸需要自制氨基酸单体。
[0137]
analog10-analog13的制备方法和实施例4完全一致。analog10-analog13经hplc检测和质谱检测，计算得到平均分子量在目标平均分子量范围之内。
[0138]
analog14-analog28的线性肽肽树脂合成方法和实施例1完全一致，根据肽序设计选择不同的氨基酸。脱保护的方法和实施例2完全一致，偶联的方法和实施例3完全一致，制备方法和实施例4完全一致。analog14-analog28经hplc检测和质谱检测，计算得到平均分子量在目标平均分子量范围之内。
[0139]
实施例6：analog29的肽树脂合成
[0140]
称取fmoc-rink-amide树脂(sub＝0.32mmol/g)62.5克(2mmol)于反应柱中，用dmf 清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6 次。称取fmoc-ala-oh1.87克(6mmol)，hobt0.89克(6.6mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入1.13克dic(9mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk 脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联fmoc-ile-oh、fmoc-asn(trt)-oh、 fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、 fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(oct-γglu-aeea-aeea)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、 fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(oall)-oh、fmoc-ser(trt)-oh、 fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-gly-oh；反应结束后，用dmf、dcm、甲醇依次清洗，干燥后得到肽树脂。
[0141]
实施例7：analog30肽树脂合成
[0142]
称取fmoc-rink-amide树脂(sub＝0.32mmol/g)62.5克(2mmol)于反应柱中，用dmf 清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6 次。称取fmoc-ala-oh1.87克(6mmol)，hobt0.89克(6.6mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入1.13克dic(9mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk 脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联fmoc-ile-oh、fmoc-asn(trt)-oh、 fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg
(pbf)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、 fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(oct-γglu-aeea-aeea)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、 fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc
‑ꢀ
ser(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(oall)-oh、 boc-his(trt)-aib-oh；反应结束后，用dmf、dcm、甲醇依次清洗，干燥后得到肽树脂。
[0143]
实施例8：analog31的肽树脂合成
[0144]
称取fmoc-rink-amide树脂(sub＝0.32mmol/g)62.5克(2mmol)于反应柱中，用dmf 清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6 次。称取fmoc-ala-oh1.87克(6mmol)，hobt0.89克(6.6mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入1.13克dic(9mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk 脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联fmoc-ile-oh、fmoc-asn(trt)-oh、 fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、 fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(oct-γglu-aeea-aeea)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、 fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(oall)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc
‑ꢀ
ser(trt)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、boc-his(trt)-aib
ꢀ‑
glu(otbu)-gly-oh；反应结束后，用dmf、dcm、甲醇依次清洗，干燥后得到肽树脂。
[0145]
实施例9：analog29的lys和asp侧链保护基团的脱除
[0146]
将实施例6中得到的全保护肽树脂，用dcm清洗3次。称取8.64克的苯硅烷，量取50ml 的dcm，加入反应柱中，反应5分钟之后，加入2.31克的pd0(ph3p)4，反应1小时。然后用 dcm清洗3次树脂，用dmf溶液清洗肽树脂30分钟，dmf清洗树脂3次，再用dcm清洗树脂3次，得到选择性脱除alloc/oall的肽树脂，备用。
[0147]
analog30和analog31的lys和glu侧链保护基团的脱除和实施例9完全一致。
[0148]
实施例10：analog29的侧链成环
[0149]
取实施例9的肽树脂，称取hoat1.36克(10mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入 1.89克dic(15mmol)，加入肽树脂，反应2小时，反应结束后，用用dmf清洗6次，再次用dcm清洗3次，然后加入甲醇清洗3次，每次10分钟，用真空抽干，得到analog29 肽树脂17.95克。
[0150]
实施例11：analog29的制备
[0151]
将实施例10得到的17.95克肽树脂加入到500ml单口烧瓶中，预先配制裂解液180ml， tfa：tis：edt：phoh：h2o＝90:3:3:2:2(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5 小时，滤掉树脂，树脂用50mltfa洗涤，合并滤液，加入到1800ml无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥的到白色固体的analog29粗肽8.95克，收率97.25％。 hplc纯度63.58％。用hplc对上述粗肽进行纯化，得到纯度98.33％的analog29精肽3.42 克，产品总收率33.15％。
[0152]
analog30和analog31的lys和glu侧链成环方法和实施例10完全一致。
[0153]
analog30和analog31的制备方法和实施例11完全一致。
[0154]
analog29-analog31经hplc检测和质谱检测，计算得到平均分子量在目标平均分子量范围之内。
[0155]
实验例1：降糖活性测试
[0156]
降糖活性测试方法的原理是基于时间分辨荧光技术、荧光共振能量转移以及均相的竞争性分析模式。实验使用cisbio公司camp-gs dynamickit试剂盒检测camp，通过时间均相分辨荧光法(htrf)用于检测hek293/glp-1r细胞中产生camp含量。细胞本身产生的 camp或者标准品及受试化合物中未标记的camp与d2标记的camp一道竞争结合 eu
3+-cryptate标记的抗camp的单抗(供体)。以665nm/620nm比值的形式呈现的荧光共振能量转移产生的特异性荧光信号与标准品和对照品或测试样品中的camp的浓度呈反比。
[0157]
实验细胞：稳定高表达glp-1受体的hek293细胞株(细胞株先确认hek293细胞中 glp-1受体的蛋白水平)。
[0158]
样品：类似物(analog1-analog31)；
[0159]
配制方法：分别准确称取约6mg的analog1-analog31化合物，加入1ml的pbs缓冲液；准确称取6mg对照品，加入1ml的pbs缓冲液，配成6mg/ml的储备液。
[0160]
具体实施方法：
[0161]
(1)标准曲线制作：以camp standard储存液(浓度为2768nm)为母液配制不同浓度的溶液，作出标准曲线。各稀释溶液浓度为：0nm、0.21nm、0.76nm、2.56nm、10.8nm、 43.8nm、184nm、745nm。
[0162]
(2)对照品和受试品的配制：将对照品(利拉鲁肽)和受试品配制为8个浓度样品(745nm 至2.1
×
10-1
nm)。
[0163]
(3)对照品和受试品加样类似物的降糖活性研究：
①
每孔加入5μl细胞悬液；
②
受试品和对照品：每孔加入5μl各浓度的受试品和对照品溶液；细胞阴性对照样：每孔加入5μlcamp-d2各浓度稀释液。
③
封膜，在25℃孵育30分钟；
④
每孔加入5μlcamp-d2抗体工作溶液；
⑤
封膜，在25℃孵育60分钟；
⑥
转移至酶标仪器用htrf665/620nm进行检测。
[0164]
使用软件将665/620nm处的荧光比值与化合物浓度的对数值计算化合物的ec50数值。
[0165]
上述实施例合成analog1-analog31化合物的结果和化合物的ec50如下表所示。
[0166]
类似物的合成结果和ec50的结果
[0167]
名称重量(g)纯度ec50(nm)analog13.2098.87％0.042
±
0.0044analog23.0698.33％0.059
±
0.0058analog33.2398.28％0.054
±
0.0055analog43.4098.95％0.022
±
0.0024analog52.9898.11％0.062
±
0.0060analog63.1598.19％0.786
±
0.0720analog73.2098.28％2.324
±
0.235analog83.4399.18％/
analog93.2498.80％/analog103.2598.75％/analog113.0698.66％0.546
±
0.0535analog123.1499.10％0.058
±
0.0055analog132.9599.22％0.030
±
0.0028analog143.2798.32％0.689
±
0.0664analog153.4198.65％1.580
±
0.1664analog163.2998.48％0.988
±
0.0875analog173.4098.39％0.869
±
0.0862analog183.3899.06％0.012
±
0.0013analog193.2298.33％0.436
±
0.0521analog203.0898.46％0.854
±
0.0842analog213.1999.15％4.976
±
0.538analog223.2698.38％3.877
±
0.487analog233.1399.08％0.032
±
0.0034analog243.1798.22％0.087
±
0.0077analog253.3399.13％0.158
±
0.0189analog263.1898.46％0.218
±
0.0278analog272.9598.76％/analog283.0598.87％/analog293.4298.33％0.024
±
0.0025analog303.2898.46％0.678
±
0.0588analog313.3198.89％0.216
±
0.0228glp-1对照品 99.32％0.033
±
0.0035
[0168]
所有类似物通过降糖生物活性筛选，analog4、analog13、analog18、analog23、analog29 的ec50值均在纳摩尔以下，和对照品相比较表现出非常好的降糖活性，因此选择这五种化合物进行降血糖和促胰岛分泌的小鼠实验。
[0169]
实验例2：analog4、analog13、analog18、analog23、analog29的降血糖小鼠实验
[0170]
取健康昆明小鼠(体重16-20g)，禁食过夜，随机分为8组，每组5只：实施例类似物组(按照小鼠体重每千克腹腔注射15mmol的葡萄糖溶液和20nmol的类似物analog4、analog13、 analog18、analog23、analog29)。葡萄糖对照组(按照小鼠体重每千克腹腔注射15mmol的葡萄糖溶液(浓度20％))；glp-1对照组(按照小鼠体重每千克腹腔注射15mmol的葡萄糖溶液和 20nmol的glp-1对照品)；长效药物对照组(按照小鼠体重每千克腹腔注射15mmol的葡萄糖溶液和20nmol的索马鲁肽)；在0、30、60、90、120、240分钟鼠尾静脉取血，取血后注射葡萄糖溶液，并用血糖仪测定血糖值。
[0171]
如下表所示，与葡萄糖组小鼠相比，类似物多肽analog4、analog13、analog18、analog23、 analog29具有降糖作用；与glp-1对照组小鼠相比，在240min内，类似物多肽analog18仍然能降低血糖，而glp-1对照组在大约90min内能够有效降低血糖，长效多肽对照组在大约 120min内能够有效降低血糖，类似物多肽analog18有效的延长了药效时间。
[0172]
给药时间0min30min60min90min120min240min葡糖糖对照5.12
±
0.7812.33
±
1.6915.23
±
2.1216.67
±
2.3417.55
±
1.9816.15
±
1.87glp-1对照4.67
±
0.976.78
±
0.997.23
±
1.218.89
±
1.3714.45
±
1.0815.36
±
1.98长效对照4.88
±
1.227.12
±
1.287.55
±
1.348.12
±
1.168.33
±
1.3614.36
±
1.98analog44.79
±
1.057.89
±
1.159.12
±
1.1910.01
±
2.019.89
±
1.8713.56
±
1.85analog135.34
±
1.188.15
±
1.2810.23
±
2.2110.29
±
2.0510.12
±
1.7810.26
±
2.13analog185.01
±
0.806.88
±
0.977.01
±
1.327.78
±
0.897.16
±
1.127.27
±
0.86analog234.68
±
0.986.64
±
1.068.26
±
1.868.04
±
1.237.98
±
2.0310.22
±
1.79analog294.89
±
1.167.89
±
1.769.03
±
2.128.82
±
1.678.23
±
1.5313.17
±
1.96
[0173]
实验例3：analog4、analog13、analog18、analog23、analog29的促胰岛素分泌实验
[0174]
将nod小鼠(非肥胖糖尿病小鼠)分为7组(每组5只)，5组实验组，1组空白组， 1组对照组。用毛细管眼窦取血80μl，7组小鼠分别腹腔注射10μg是analog4、analog13、 analog18、analog23、analog29、10ugglp-1对照品、200ul生理盐水，分别于0、10、20、30、 40、50分钟眼窦取血。取血后的血样加入含80μl生理盐水的离心管中混匀，离心去除红血球，用放射性免疫试剂盒测定血清胰岛素浓度(去除最高值和最小值后取平均值)，检测化合物的促胰岛素分泌作用。
[0175]
如下表所示，结果显示，腹腔注射的化合物和glp-1对照品均能显著促进胰岛素的分泌。本发明的类似物长时间刺激产生胰岛素的能力超过glp-1对照品，说明本发明的类似物多肽能够有效延长glp-1的体内药效时间。
[0176]
化合物的促胰岛素分泌作用
[0177]
给药时间0min10min20min30min40min50min空白组2.10
×
10-6
2.13
×
10-6
2.08
×
10-6
2.15
×
10-6
2.12
×
10-6
2.01
×
10-6
glp-1对照组2.10
×
10-6
8.55
×
10-6
10.31
×
10-6
10.45
×
10-6
8.60
×
10-6
6.24
×
10-6
analog42.18
×
10-6
7.89
×
10-6
8.68
×
10-6
8.45
×
10-6
7.66
×
10-6
5.87
×
10-6
analog132.21
×
10-6
8.23
×
10-6
10.23
×
10-6
10.98
×
10-6
8.75
×
10-6
7.67
×
10-6
analog182.09
×
10-6
10.88
×
10-6
12.15
×
10-6
11.67
×
10-6
10.87
×
10-6
9.89
×
10-6
analog232.15
×
10-6
6.69
×
10-6
8.85
×
10-6
9.02
×
10-6
8.24
×
10-6
6.53
×
10-6
analog292.16
×
10-6
7.87
×
10-6
9.98
×
10-6
9.36
×
10-6
8.24
×
10-6
5.35
×
10-6
[0178]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。