一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽ADPs、表达载体和重组根瘤菌构建及应用

一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽adps、表达载体和重组根瘤菌构建及应用
技术领域
1.本发明属于根瘤固氮技术领域，具体涉及一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽adps、表达载体和重组根瘤菌构建及应用。


背景技术：

2.在豆科植物与根瘤菌的共生过程中，豆科植物的根部会形成一种特殊的器官——根瘤。根据根瘤的形态和结构，可以将其分为定型根瘤和不定型根瘤两种类型，这两种类型的根瘤早期发育过程基本一致，但在后期不定型根瘤中存在类菌体的末端分化。
3.类菌体的末端分化主要是指根瘤菌侵染植物后的一种不可逆转的分化状态，根瘤菌发生形态上的变化，如细胞伸长以及基因组扩增，膜的通透性的改变还有繁殖能力的丧失等。并且在irlc豆科植物的不定型根瘤中存在一种根瘤特异的富含半胱氨酸(nodule-specific cysteine-rich，ncr)多肽，这种ncr多肽可能与根瘤中类菌体的末端分化有关。
4.ncr多肽是一类具有生物学活性的小分子多肽，一般由20-50个氨基酸残基组成，结构复杂多样。ncr多肽主要由两部分组成：一部分是n端的信号肽；另一部分是含有4个或6个保守半胱氨酸的成熟活性肽。ncr多肽含有的氨基酸种类和数量具有较大差异，这导致ncr多肽的一些重要的理化性质，比如等电点，也存在较大的差异，进而影响ncr多肽的功能。在生物体内，ncr多肽主要通过靶向类菌体的细胞周期蛋白和一些细胞通路的关键因子来行使功能。并且，ncr多肽往往不是单独发挥作用的，通常由几个ncr多肽组合在一起来行使功能。
5.ncr多肽主要在irlc豆科植物的不定型根瘤中表达。根据已有的报道可知，通过对蒺藜苜蓿的根瘤进行转录组分析，截至目前已经发现了700多种ncr多肽。不同的ncr多肽在豆科植物与根瘤菌共生过程中的不同阶段起作用，它们对豆科植物与根瘤菌的共生至关重要。但是如何应用已知的ncr多肽，目前只有极少的研究。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽adps、表达载体和重组根瘤菌构建及应用，显著提高根瘤菌的固氮效率。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽adps，所述人工串联多肽adps包括若干个依次连接的ncr多肽；
9.所述ncr多肽的等电点为4.23～8.25。
10.优选的，所述人工串联多肽adps包括由3～4个ncr多肽依次利用linker连接后形成的多肽。
11.优选的，所述人工串联多肽adps的结构包括：第一ncr-linker-第二ncr-linker-第三ncr-linker-第四ncr；
12.所述第一ncr的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述第二ncr的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述第三ncr的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述第四ncr的氨基酸序列如seq id no.4所示。
13.优选的，所述第一ncr的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述第二ncr的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述第三ncr的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述第四ncr的核苷酸序列如seq id no.8所示。
14.本发明还提供了一种包含上述人工串联多肽adps的编码基因的表达载体，所述表达载体的基础载体包括phc60。
15.优选的，将所述编码基因插入所述基础载体的xhoi和xbai酶切位点之间。
16.本发明还提供了一种表达上述人工串联多肽adps的重组根瘤菌，所述重组根瘤菌的基因组中包含上述人工串联多肽adps的编码基因。
17.本发明还提供了上述重组根瘤菌的构建方法，包括以下步骤：将上述人工串联多肽adps的编码基因插入phc60的xhoi和xbai酶切位点之间，得表达载体；
18.将所述表达载体转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆后提取重组质粒；
19.将所述重组质粒转化mesorhizobium japonicum maff303099，筛选阳性菌落，得所述重组根瘤菌。
20.本发明还提供了上述人工串联多肽adps或上述表达载体或上述重组根瘤菌在提高固氮效率中的应用。
21.本发明还提供了上述人工串联多肽adps或上述表达载体在调控根瘤类菌体形态中的应用。
22.有益效果：本发明提供了一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽adps，将若干个等电点相近的ncr多肽进行串联；并将所述人工串联多肽adps的编码基因插入phc60形成表达载体，再转化mesorhizobium japonicum maff303099，得到重组根瘤菌，使人工串联多肽adps在根瘤菌中表达，通过根瘤中类菌体的形态较快速地判断ncr多肽的功能，提高了检验ncr多肽功能的效率，同时，也可以对几种不同的ncr多肽所发挥的复合作用进行研究。本发明实施例中将含有人工串联多肽adps的编码基因的根瘤菌接种百脉根，通过对根瘤中类菌体的形态、固氮酶活等共生表型进行统计分析，判断人工串联多肽adps在共生固氮方面的功能，对提高豆科植物的固氮效率具有重要意义，对发展环境友好型可持续发展农业具有重要意义。人工串联多肽adps在根瘤菌中表达使其作用环境更接近于真实的生理环境，使实验结果更加真实可信，另外，也克服了一些ncr多肽跨膜较困难的问题。
附图说明
23.图1为ncr多肽等电点分布；
24.图2为接种21天后根瘤中类菌体的形态，a为野生型类菌体的形态，b为重组根瘤菌的类菌体的形态(标尺10μm)；
25.图3为接种21天后根瘤中类菌体的长度统计，其中control表示野生型类菌体；adps表示重组根瘤菌的类菌体；并且*表示在control和重组根瘤菌的类菌体之间的差异性比较(t-检验)，*表示显著水平0.01＜p≤0.05时，差异显著；**表示显著水平0.001＜p≤0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示p≤0.001时，差异极显著，下同；
26.图4为接种21天后的固氮酶活性，其中control表示野生型类菌体；adps表示重组根瘤菌的类菌体；
27.图5为乙烯体积与乙烯峰面积的标准曲线。
具体实施方式
28.本发明提供了一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽adps，所述人工串联多肽adps包括若干个依次连接的ncr多肽；
29.所述ncr多肽的等电点为4.23～8.25。
30.本发明所述人工串联多肽adps优选包括由3～4个ncr多肽依次利用linker连接后形成的多肽。本发明通过对目前已知的ncr多肽进行统计，等电点在4.23或8.25时各会出现一个丰度，说明等电点在4.23和8.25附近的ncr多肽数量较多，可能发挥较为重要的作用(图1)，因此本发明实施例中选择4个等电点相近的ncr基因序列进行串联，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围，所形成的人工串联多肽adps的结构，优选包括：第一ncr-linker-第二ncr-linker-第三ncr-linker-第四ncr；所述第一ncr的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述第二ncr的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述第三ncr的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述第四ncr的氨基酸序列如seq id no.4所示。本发明所述第一ncr的等电点为5.58，第二ncr的等电点为5.5，第三ncr的等电点为5.52，第四ncr的等电点为5.47。
31.本发明所述第一ncr的核苷酸序列优选如seq id no.5所示：atgatccactggtgctggaccttcgaggactgcccggacaacttctgcaagccgctgtacaagccgatctgctcgctgtacgtctgctattgcaaggagatcgccgtcaactga；所述第二ncr的核苷酸序列优选如seq id no.6所示：atgcacgtcgagtgctacgtcgactcggactgcccggcctatatctgcgaccgcgaccatttcgtcgtctgcgaggtcgaccgctgccgctgcaagcgcttcgaggacttccaccgctga；所述第三ncr的核苷酸序列优选如seq id no.7所示：atgtgcctgcacgactcggactgccaggagaacatctgcaccccgcgcgacgcggagcgtcgctgcatcgaggacttctgcgcgtgcggcgacgactacaccatcgaccactcgatgtcgatccgcccgaagcgcgtcaacaagctgccggtcggcaacttcctgcattga；所述第四ncr的核苷酸序列优选如seq id no.8所示：atgaacccgcgctgctggacggtcaacggctgcccgggcaactactgccagccgccgcagaaggtcacctgcaactggtatcacgactgcgactgcatcgactaa。
32.本发明对所述linker的种类和序列并没有特殊限定，优选包括nifkpro、nifdpro和/或nifepro，实施例中优选利用nifkpro连接第一ncr和第二ncr，nifdpro连接第二ncr和第三ncr，nifepro连接第三ncr和第四ncr，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述nifkpro的核苷酸序列优选如seq id no.11所示：ccgccgctaccgacagggaggcgccgaccgtgacctggcgcccctttctacgaaacaaggcctcgttggcgaggcgttacccgaaccttgaaaggggcaggtccc；所述nifdpro的核苷酸序列优选如seq id no.12所示：ggactggcctccctggcaggcagggaggccgataaatgcttggggcgtgctcgatccacgctggatgcccttcaaagtttcgatgtccctgtgctgccgcttgccgcggccagatggaaaaggtgaccacc；所述nifepro的核苷酸序列优选如seq id no.13所示：gcccgtgccggcctttcgccgaggccgcccatgcccaatggacttcggagactgacgca。
33.本发明还提供了一种包含上述人工串联多肽adps的编码基因的表达载体，所述表达载体的基础载体包括phc60。
34.本发明优选将所述编码基因插入所述基础载体的xhoi和xbai酶切位点之间。本发明对所述表达载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规双酶切方法进行构建即可。
35.本发明在构建所述表达载体时，优选在所述编码基因的5’端和3’端分别加入xhoi和xbai酶切位点，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成所述编码基因。
36.本发明还提供了一种表达上述人工串联多肽adps的重组根瘤菌，所述重组根瘤菌的基因组中包含上述人工串联多肽adps的编码基因。
37.本发明还提供了上述重组根瘤菌的构建方法，包括以下步骤：将上述人工串联多肽adps的编码基因插入phc60的xhoi和xbai酶切位点之间，得表达载体；
38.将所述表达载体转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆后提取重组质粒；
39.将所述重组质粒转化mesorhizobium japonicum maff303099，筛选阳性菌落，得所述重组根瘤菌。
40.本发明在构建所述表达载体时，优选利用限制性内切酶xhoi和xbai对人工串联多肽adps的编码基因以及phc60载体进行消化，通过t4酶连的方式将二者进行连接，从而得到所述表达载体。
41.本发明优选利用所述表达载体转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在四环素抗性的lb平板上筛选，并利用菌落pcr验证及测序鉴定重组表达载体。
42.本发明所述菌落pcr的引物对优选包括nifhpro-kpni-gf和olncr21-xbai-r，其中nifhpro-kpni-gf的核苷酸序列优选如seq id no.9所示：tgaattcgagctcggtaccggatgccgtctctgtcttgg；olncr21-xbai-r的核苷酸序列优选如seq id no.10所示：atttctagattagtcgatgcagtcgcag。本发明所述菌落pcr的程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，27循环；72℃再延伸10min。
43.本发明优选从上述菌落pcr验证阳性并测序正确的大肠杆菌中提取重组质粒，并转化mesorhizobium japonicum maff303099(根瘤菌maff303099感受态细胞)，利用含有磷霉素和四环素抗性的ty培养基进行筛选，28℃培养一周左右。待筛选平板上长出根瘤菌单菌落后，从每个单菌落中挑取适量根瘤菌于20μl灭过菌的ddh2o中进行稀释处理，并用稀释后的菌液进行pcr验证，筛选阳性菌。本发明所述pcr验证的引物对优选包括nifhpro-kpni-gf和olncr21-xbai-r，且所述pcr验证的程序优选包括：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，27循环；72℃再延伸10min。
44.本发明还提供了上述人工串联多肽adps或上述表达载体或上述重组根瘤菌在提高固氮效率中的应用。
45.本发明实施例中，将上述重组根瘤菌经培养后接种到百脉根上，可显著提高固氮酶活性。
46.本发明还提供了上述人工串联多肽adps或上述表达载体在调控根瘤类菌体形态中的应用。
47.在本发明实施例中，对所述重组根瘤菌进行培养后，其类菌体的长度显著增加。
48.下面结合实施例对本发明提供的一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽adps、表达载体和重组根瘤菌构建及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
49.实施例1
50.1、委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成seq id no.5-seq id no.11-seq id no.6-seq id no.12-seq id no.7-seq id no.13-seq id no.8所示的序列，作为串联表达框。
51.2、利用限制性内切酶xhoi和xbai对串联表达框以及phc60载体进行消化，通过t4酶连的方式将二者进行连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在四环素抗性的lb平板上筛选，并利用菌落pcr验证(引物为seq id no.9和seq id no.10，程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，27循环；72℃再延伸10min)及测序鉴定重组表达载体。
52.3、从测序成功的大肠杆菌中提取重组质粒，并转化根瘤菌maff303099感受态细胞，利用含有磷霉素和四环素抗性的ty培养基进行筛选，28℃培养一周左右。待筛选平板上长出根瘤菌单菌落后，从每个单菌落中挑取适量根瘤菌于20μl灭过菌的ddh2o中进行稀释处理，并用稀释后的菌液进行pcr验证(引物为seq id no.9和seq id no.10，程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，27循环；72℃再延伸10min)，筛选阳性菌。
53.实施例2
54.将实施例1中筛选得到的阳性菌用磷霉素(100μg/ml)和四环素(10μg/ml)抗性的ty培养基进行培养，28℃、180r/min过夜培养，待od
600
至1.0时，4000rpm离心10min收集根瘤菌，用无氮培养基稀释到od
600
至0.05后均匀地喷洒在百脉根的根部，每一株的接种量为5ml。
55.1、人工串联多肽adps对根瘤类菌体形态的影响
56.接种21天后，使用结晶紫对根瘤中的类菌体进行简单染色，并用光学显微镜对类菌体的形态进行观察，利用imagej对根瘤菌的长度进行统计分析。
57.光学显微镜下观察到根瘤中类菌体的形态如图2所示，与对照组相比，含有ncr基因的类菌体的长度明显增加。根瘤中类菌体长度结果如图3和表1所示，与对照相比，含有重组根瘤菌的类菌体的长度显著增加。
58.表1类菌体长度统计
59.60.61.[0062][0063]
2、接种21天后，利用乙炔还原法对固氮酶活进行测定。
[0064]
(1)固氮酶活性测定
[0065]
接种21天后，将10棵长势相近的百脉根放入40ml玻璃瓶中，先用注射器从玻璃瓶中抽出3ml的空气，再用注射器往玻璃瓶中注入2ml的乙炔气体。将玻璃瓶置于装有水的塑料盒中，28℃反应2小时后取出，用气相色谱仪检测。
[0066]
(2)乙烯标准曲线制作
[0067]
用微量进样器往玻璃瓶中注入一定体积的乙烯标准气体，每个浓度设置3个重复，用气相色谱仪检测乙烯峰。在excel表格上绘制乙烯体积与乙烯峰面积的标准曲线，如图5所示，y＝27706x-8670.1，r2＝0.9972，其中x为乙烯体积(μl)，y为乙烯峰面积。
[0068]
(3)固氮酶活的计算
[0069]
固氮酶活性即为乙炔还原活性(acetylene reduction activity,ara)，可表示为单位重量的根瘤在单位时间内还原乙炔的摩尔数：乙炔还原活性＝乙烯的摩尔数/鲜根瘤重
×
反应时间(酶活的单位通常是：μmol/g.h)。根据气体的摩尔数与体积、温度，压力的关系，摩尔数可由乙烯体积求得：
[0070]
c2h4(μmol)＝c2h4体积(μl)
×
1/22.4
×
273/(273+t℃)
×
p/760，式中：t℃为反应温度(摄氏气温，28)；p为气压，通常取760毫米汞柱，22.4表示1mol气体在标准状态下的体积是22.4升；273是绝对温度。
[0071]
固氮酶活性的统计结果如图4和表2所示，与对照相比，百脉根接种含有重组根瘤菌，固氮酶活性显著升高。
[0072]
表2固氮酶活性数据
[0073]
controladpscontroladps13.8983624.5767514.9940131.0186516.2087626.4436614.7016727.1042117.7027627.8117214.5379222.8812214.0253118.4530916.5925524.3268315.0680220.7335913.5668 13.0323319.2685911.3455 14.6848817.2615113.11076 15.568918.11432
ꢀꢀ
[0074]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。